一种治疗肿瘤的增效组合药物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及医药、生物【技术领域】，涉及抗肿瘤药物增效药物，具体涉及一种自噬抑制剂和阿霉素组成的治疗肿瘤的增效药物组合物。所述的组合药物由一种或多种细胞自噬抑制剂和阿霉素组成，采用联合给药或序贯使用的方式用于治疗肿瘤，可以通过抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对阿霉素治疗的拮抗作用，从而显著增强阿霉素对肿瘤的治疗效果。本发明的增效药物组合物适于治疗淋巴瘤、肺癌、脑瘤、乳腺癌和骨髓瘤。
【专利说明】一种治疗肿瘤的增效组合药物
【技术领域】
[0001]本发明涉及医药、生物【技术领域】，涉及抗肿瘤药物增效药物，具体涉及一种自噬抑制剂和阿霉素组成的治疗肿瘤的增效药物组合物。
【背景技术】[0002]恶性淋巴瘤主要可以分为何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)，其中非何杰金淋巴瘤占绝大多数。据世界卫生组织国际癌症研究组织(International Agency forResearch on Cancer)的数据显示,全世界NHL的发病率均有所上升,而且发达国家的发病率明显高于非洲和亚洲地区。恶性淋巴瘤的病因复杂，目前尚未完全研究清楚，远期存活率较低。阿霉素作为化疗治疗恶性淋巴瘤的主要药物之一一直被广泛应用。研究表明阿霉素主要通过嵌入DNA的相邻碱基之间，扰乱模板功能，阻止DNA依赖性的RNA多聚酶作用，干扰转录过程，从而诱导肿瘤细胞凋亡，并且其对淋巴瘤细胞杀伤效果明显。然而阿霉素具有较强的毒性，长期使用可能会导致强烈的心脏副作用，且该副作用为剂量累积型，致使阿霉素的临床应用受到了一定程度上的限制。本领域研究人员致力于研究通过增加阿霉素对淋巴瘤细胞的疗效减少阿霉素的给药剂量，和减少其副作用的发生[Mounier N,Heutte N,Thieblemont C,et al.Clin Lymphoma Myeloma Leuk.2012[Epub ahead of print]]。
[0003]细胞自卩遼(autophagy)又叫II 型程序性死亡(type II programmed cell death),是真核生物体内常见的“自我消化”(cellular degradation)的现象，能分解细胞内受损或多余的细胞器和蛋白产生核苷酸，氨基酸等小分子物质供细胞合成新的蛋白质，并能维持细胞内微环境的稳定。近年来随着分子生物学及基因技术的发展和对细胞自噬的深入认识，发现其与多种疾病，尤其是肿瘤的发展关系密切
[0004]根据细胞内底物运送到溶酶体腔内方式的不同，哺乳动物细胞自噬可分为三种方式:大自嗤(macroautophagy)、小自嗤(microautophagy)和分子伴侣介导的自嗤(chaperone-mediated autophagy, CMA)。大自卩遼主要具有以下特征:(I)发展过程迅速；
(2)自噬的可诱导性；(3)批量降解；(4)无选择性吞噬；(5)自噬的保守性。其他两种自噬与大自噬的主要区别在于:小自噬是溶酶体膜自身变形，然后包裹吞噬细胞浆中的底物；而分子伴侣介导的自噬则能有选择性地降解蛋白。据研究，大自噬(以下简称自噬)与肿瘤发展及治疗关系最为密切[Sridhar S, Botbol Y, Macian F, et al.Autophagy and disease:always two sides to a problem.J Pathol.2012 ；226(2):255-73.]。
[0005]自噬是胞浆大分子物质和细胞器在双层膜包囊泡中大量降解的生物学过程。
[0006]自噬能对细胞对外部环境改变及各种刺激产生应激反应。细胞在生长条件下能发生较低水平的自噬，称基础自噬。然而，一旦受到外界的刺激，如饥饿、缺氧、高温、高细胞密度或是生长因子剥夺等，细胞自噬的水平将会迅速上调。如在营养物质缺乏的情况下，细胞自噬能分解体内坏死细胞器产生氨基酸等供细胞合成新的蛋白质，维持细胞的存活[① Piacentini M, D’ Eletto M, Falasca L, et al.Adv Enzymol Relat Areas MolBiol.2011 ;78:197-246 ;② Cook KL, Shajahan AN, Clarke R.Expert Rev AnticancerTher.2011 ；11 (8):1283-94.!③ Wirawan E, Vanden Berghe T, Lippens S, et al.CellRes.2012 ；22(1):43-61.]。
[0007]自噬能降解折叠错误的蛋白质、损伤的细胞器等，延缓机体衰老的发生。研究表明，大量衰老性疾病，如神经退行性疾病和恶性肿瘤都与细胞自噬密切相关。
[0008]细胞自噬在生物体的发育和分化过程中起了重要作用。此外作为程序性细胞死亡的一种，细胞自卩遼能通过多种途径直接或是间接导致细胞死亡。[Denton D, Nicolson S，Kumar S.Cell Death Differ.2012 ; 19 (I):87-95.]。研究表明，肿瘤的发生与发展和自噬的关系极为密切。
[0009]一般来说，由于细胞自噬有利于细胞的存活，因此无论在正常细胞或是肿瘤细胞中，自噬都普遍被保留下来，并且在一般情况下都维持着基础自噬。但是自噬究竟是抑制还是促进肿瘤细胞的发生发展目前尚没有定论。自噬初期可以作为肿瘤发生的一种抑制因素，已知的肿瘤抑制因子，例如PTEN、TSC1和TSC2能激活自噬，并且对自噬的抑制可使蛋白降解减少，合成代谢增加，最终导致原癌细胞持续增殖。大多数肿瘤细胞(如肝、胰腺、乳腺癌等)尽管癌变前自噬能力各有不同，但是在癌变之后其自噬能力均减弱。自噬缺乏可引起自卩遼底物p62积聚,通过NF- K B信号途径引起肿瘤形成[Trocoli A, Djavaher1-MergnyM.Am J Cancer Res.2011 ；1(5):629-49.]。然而在肿瘤生长到一定程度时，尤其是当肿瘤内还没有形成足够的血管为其扩增提供营养时，肿瘤细胞也可以通过自噬来克服营养缺乏和低氧的环境得以生存。
[0010]抗肿瘤药物诱导的肿瘤细胞自噬所体现的作用大致可以概括为两种:大部分情况下是对肿瘤细胞的保护，某些情况下也能对肿瘤细胞进行杀伤。研究表明化疗药物5-FU以及单克隆抗体药物曲妥珠单抗(Trastuzumab)和西妥昔单抗(Cetuximab)均能显著地诱导细胞自噬，且抑制由这3种药物产生的细胞自噬能显著增加肿瘤细胞对治疗的敏感性。
[0011]到目前为止，尚未见有细`胞自噬抑制剂与阿霉素制成药物复合物尤其是治疗肿瘤的增效药物组合物的相关报道。
【发明内容】
[0012]本发明的目的是提供一种新型的治疗肿瘤的增效组合药物，尤其是一种自噬抑制剂和阿霉素组成的治疗肿瘤的增效组合药物。
[0013]本发明的药物组合物由一种或多种细胞自噬抑制剂和阿霉素组成，其特点在于，自身无明显细胞毒性但能通过抑制细胞自噬来增强阿霉素的疗效，从而降低阿霉素在治疗肿瘤时的用量，减少其副作用的发生。
[0014]本发明的药物组合物采用联合给药或序贯使用的方式使用，用于治疗淋巴瘤、肺癌脑瘤、乳腺癌或骨髓瘤。
[0015]本发明中，细胞自噬抑制剂选自自噬抑制剂中的一种或几种例如:3_MA(3_MethyIadenine)、渥曼青霉素(Wortmannin)、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素Al (BafilomycinAl)、NH4Cl、氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine),与阿霉素组成组合药物或序贯使用治疗肿瘤。本发明中，优选3-MA(3_Methyladenine)、氯喹(Chloroquine)和羟基氯喹(hydroxychloroquine)。
[0016]本发明中，所述的肿瘤包括肺癌、脑瘤、乳腺癌、淋巴瘤和骨髓瘤。尤其是淋巴瘤，包括何杰金淋巴瘤(HL)和非何杰金淋巴瘤(NHL)。
[0017]本发明中，阿霉素药物通常溶于无菌水充分搅拌后，无菌滤器过滤，分管保存，使用时稀释。
[0018]本发明中，自噬抑制剂药物使用前分别配置成:
[0019](I)氯喹的配制:取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
[0020](2)氯化铵的配制:取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬；
[0021](3)羟基氯喹的配制:取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用
0.1ym的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬；
[0022](4) 3-MA的配制:取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于_20°C。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬；
[0023](5) LY294002的配制:取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬；
[0024](6)巴伐洛霉素Al的配制:取适量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自嗤；
[0025]本发明中，阿霉素能显著诱导淋巴瘤细胞发生细胞自嗤，通过分别于上述细胞自噬抑制剂组成组合药物或序贯使用抑制细胞自噬能增加淋巴瘤细胞对阿霉素的敏感性，从而增强阿霉素的疗效。
[0026]本发明的组合药物进行了体外试验，结果显示，阿霉素能诱导Raji细胞发生细胞自噬，8 μ g/ml阿霉素的Raji细胞的自噬发生水平高于对照组。由于抑制自噬后增加了Raji细胞对阿霉素的药物敏感性，抑制自噬能增强阿霉素诱导的Raji细胞的细胞死亡，表明抑制自噬能增加阿霉素对Raji细胞的杀伤作用。
[0027]本发明实验结果表明，通过抑制阿霉素诱导的肿瘤细胞的细胞自噬而抵消肿瘤由于细胞自噬而引起的对阿霉素治疗的拮抗作用，从而显著增强阿霉素对肿瘤的治疗效果。
[0028]本发明的优点在于:
[0029]1，解决目前主要用于肿瘤治疗的化疗药物大多会产生耐药性及对患者有较强的副作用，其中阿霉素的副作用也十分明显，不但会产生细胞毒性，还会引起心肌疾病，本发明的组合药物通过使用一种或者几种自噬抑制剂与阿霉素联合给药或是序贯给药能加强其活性从而降低其用量，加强阿霉素对肿瘤的疗效。
[0030]2、细胞自噬在阿霉素对淋巴瘤的治疗过程中对阿霉素有抵抗作用；并且使用细胞自噬抑制剂能加强阿霉素对肺癌、脑瘤、乳腺癌、淋巴瘤和骨髓瘤，尤其是淋巴瘤的疗效。
[0031]为了便于理解，以下将通过具体的附图和实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，具体实例和附图仅是为了说明，显然本领域的普通技术人员可以根据本文说明，在本发明的范围内对本发明做出各种各样的修正和改变，这些修正和改变也纳入本发明的范围内。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是阿霉素能诱导Raji细胞发生细胞自噬，
[0033]其中，1:经过8 μ g/ml阿霉素处理了 24h后的Raji细胞Line2:未经阿霉素干预的Raji细胞*p < 0.05与对照组细胞进行比较计算。
[0034]图2是Raji细胞的MDC染色结果对比，
[0035]其中，A:经过8 μ g/ml阿霉素处理了 24h后的Raji细胞B:未经阿霉素干预的Raji细胞。
[0036]图3是抑制自噬能增强阿霉素诱导的Raji细胞的细胞死亡结果，
[0037]其中，*p <0.05与组II比较计算；ΛΛ P < 0.01与组III比较计算；
< 0.01与组IV比较计算；▽▽ p<0.01与组I比较计算。[0038]图4是抑制自噬后自噬相关蛋白LC3II的表达水平，
[0039]其中，1.未经处理的Raji细胞2.Raji细胞+8 μ g/ml阿霉素3.Raji细胞+2mmol/L 3-MA 4.Raji 细胞 +2mmol/L+8 μ g/ml 阿霉素 5.Raji 细胞 +5mmol/L NH4Cl 6.Raji 细胞+5mmol/L NH4CI+8 μ g/ml 阿霉素。
[0040]图5是抑制自噬能增强阿霉素诱导的Raji细胞的细胞凋亡，
[0041]其中，A a:未经处理的Raji细胞b:经过8 μ g/ml阿霉素处理了 24h后的Raji细胞c:经过8 μ g/ml阿霉素和5mmol/LNH4Cl处理了 24h后的Raji细胞d:经过8 μ g/ml阿霉素和2mmol/L3-MA处理了 24h后的Raji细胞B*p < 0.05，料？ < 0.01与组I比较计算。
【具体实施方式】
[0042]实施例1
[0043]制备阿霉素药物:称取16mg阿霉素，溶于IOml无菌水。充分搅拌30分钟并用
0.1ym无菌滤器过滤。分装成10管保存。体外试验时稀释200-800倍。
[0044]分别配置自噬抑制剂药物:
[0045](I)氯喹的配制:取适量氯喹溶于纯水配成10mmol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬
[0046](2)氯化铵的配制:取适量氯化铵溶于水配成0.4mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于4°C。体外实验时稀释50-80倍用于抑制细胞自噬
[0047](3)羟基氯喹的配制:取适量羟基氯喹溶于纯水配成lOmmol/L的储存液，用
0.1ym的滤器过滤除菌后保存于4°C，体外实验室稀释500-1000倍用于抑制细胞自噬
[0048](4) 3-MA的配制:取适量3-MA干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于_20°C。体外实验时稀释50-200倍用于抑制细胞自噬。
[0049](5) LY294002的配制:取适量LY294002干粉配制成0.2mol/L的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°C。体外实验时稀释50-100倍用于抑制细胞自噬。
[0050](6)巴伐洛霉素Al的配制:取适量巴伐洛霉素Al干粉配制成0.5 μ g/ml的储存液，用0.1 μ m的滤器过滤除菌后保存于-20°c，体外实验时稀释1000倍用于抑制细胞自噬。
[0051]细胞培养:Raji细胞生长至对数生长期后，以5*105cellS/ml的浓度转入细胞培养板内培养，各组细胞分别给予0-8 μ g/ml的阿霉素,并在给药前Ih加入2mmol/L的3-MA和5mmol/L的NH4C1抑制Raji细胞的细胞自噬。连续培养24h，以1000r/min离心收集细胞。
[0052]阿霉素诱导Raji细胞发生细胞自噬:
[0053]将收集到的Raji细胞用PBS洗I次，用RIPA试剂盒裂解细胞，并定量后按照每个泳道50 μ g进行蛋白电泳后转膜至PVDF膜上，用5 %脱脂牛奶封闭lh，分别加入LC3b和β -actin抗体，于4°C孵育12h。TBST洗膜后加入二抗室温孵育1.5h，用DAB显色液显色。Western Blot的结果用ImageQuantTL进行灰度统计分析。发现Raji细胞经过阿霉素处理24小时后,通过Western Blot的检测，结果如图1所示,24h后。给予8 μ g/ml阿霉素的Raji细胞的LC3II的表达水平高于对照组(P < 0.05)。
[0054]MDC染色法观察细胞自噬水平:
[0055]将收集到的Raji细胞用PBS洗2次。加入Iml 0.5% MDC染色液，避光孵育lOmin，于1000r/min离心5min收集细胞，再用PBS洗2次。随即在激发光为365nm的荧光显微镜下观察。Raji细胞经过阿霉素处理24小时后，通过365nm的荧光显微镜的观察，结果如图2所示:8μ g/ml阿霉素的Raji细胞的荧光强度强于对照组，证明了经过阿霉素处理的Raji的自噬体和自噬溶酶体的数量多于对照组，提示8 μ g/ml阿霉素的Raji细胞的自噬发生水平高于对照组。
[0056]抑制自噬能增强阿霉素诱导的Raji细胞的细胞死亡:`[0057]连续培养24h后直接加入ΙΟμ IMTT反应液，37 °C避光孵育4h后加入三联液(50% DMF,20% SDS的水溶液)，37°C孵育6h，于570nm处测定各组的0.D值，并用SPSSstatisticsl9进行统计学分析。各组Raji细胞分别给予O μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml和8 μ g/ml的阿霉素，并在给药前Ih加入2mmol/L的3-MA和5mmol/L的NH4Cl抑制Raji细胞的细胞自噬。连续培养24h后经过MTT法测定各组的细胞活力如图3所示，与对照组相t匕，所有经过2 μ g/ml,4 μ g/m`l,8 μ g/ml阿霉素干预的Raji细胞的细胞活力都有显著性下降(P < 0.01)，加入自噬抑制剂3-MA和NH4Cl的Raji细胞的细胞活力与相同浓度的单纯阿霉素干预的Raji细胞的细胞活力相比，有显著性下降(P < 0.05，P < 0.01)，证明自噬抑制剂和阿霉素的联合给药能更有效地抑制Raji细胞的生长，并且只加抑制剂3-MA和NH4Cl的组的细胞活力与对照组相比，无显著差异。说明抑制剂本身对细胞无明显细胞毒性，故而我们推断了自噬抑制剂和阿霉素的联合给药所降低的Raji细胞的细胞活性并非是抑制剂和药物的协同作用所致，而是因为抑制自噬后增加了 Raji细胞对阿霉素的药物敏感性。提示抑制自噬能增加阿霉素对Raji细胞的杀伤作用。
[0058]检测抑制自噬后自噬相关蛋白LC3II的表达水平:
[0059]用RIPA裂解液裂解抽取细胞总蛋白，定量后按每孔50 μ g蛋白量上样进行蛋白电泳并转膜进行Western blot，用ECL化学发光试剂盒进行化学发光。结果如图4所示:经过8 μ g/ml阿霉素处理的Raji细胞的LC3II的表达量高于对照组，经过2mmol/L3-MA和8 μ g/ml阿霉素处理后的Raji细胞的LC3II的表达量低于8 μ g/ml阿霉素处理后的Raji细胞，而经过8 μ g/ml阿霉素和5mmol/LNH4Cl处理后的Raji细胞的LC3II的表达量高于8 μ g/ml阿霉素处理后的Raji细胞。由于3-MA是一种PI3KIII抑制剂，PI3KIII在细胞自噬的调控中起重要的作用，其能与Beciln I等分子结合，参与调控自噬体膜的运输。故而抑制PI3KIII将阻遏自噬体的形成，从而起到抑制细胞自噬的作用。从现象上看，由于自噬体膜的形成与运输受阻，导致ATG8/LC3分子无法通过泛素化在自噬体膜上定位。所以LC3II分子的表达水平会因此下降。故而Western Blot的结果证明2mmol/L的3-MA能抑制由8 μ g/ml阿霉素所诱导的Raji细胞的细胞自噬。而NH4Cl是自噬溶酶体的抑制剂，NH4Cl能造成溶酶体的碱化，使溶酶体酶失去活性，从而造成自噬体的堆积，这造成了自噬体无法在溶酶体内进行降解，导致了处于自噬体膜表面的LC3II分子的量增加。所以Western Blot的结果能证明5mmol/L的NH4C1能抑制由8 μ g/ml阿霉素诱导的Raji细胞的细胞自噬。
[0060]抑制自噬能增强阿霉素诱导的Raji细胞的细胞凋亡:
[0061]将收集到的Raji细胞用PBS洗I次，之后加入500 μ I结合液和5 μ lAnexinV-FITC，避光室温孵育15min，随即进行流式细胞检测。结果使用SPSSstatistics 19进行统计学分析。Raji细胞经过阿霉素和抑制剂处理24小时经过流式细胞检测，结果如图5所示，经过8 μ g/ml阿霉素处理的Raji细胞的细胞凋亡率高于对照组，而8 μ g/ml阿霉素+2mmol/L3-MA和8 μ g/ml阿霉素+5mmol/LNH4Cl干预的Raji细胞的细胞凋亡率显著高于8 μ g/ml 阿霉素干预的Raji细胞(p < 0.05, p < 0.01)。
【权利要求】
1.一种治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，由一种或多种细胞自噬抑制剂和阿霉素组成。
2.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自下述自噬抑制剂中的一种或几种:3-MA、渥曼青霉素、LY294002、放线菌酮、巴法洛霉素Al、NH4C1、氯喹或/和羟基氯喹。
3.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的细胞自噬抑制剂选自3-MA、氯喹或羟基氯喹。
4.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的组合药物采用联合给药或序贯使用的方式使用。
5.按权利要求4所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的组合药物中的阿霉素药物溶于无菌水充分搅拌后，无菌滤器过滤，分管保存，使用时稀释。
6.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的肿瘤包括肺癌、脑瘤、乳腺癌、淋巴瘤和骨髓瘤。
7.按权利要求1所述的治疗肿瘤的增效组合药物，其特征在于，所述的肿瘤是何杰金淋巴瘤或非何杰金淋巴瘤。
【文档编号】A61K31/704GK103505732SQ201210210937
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2012年6月21日 优先权日:2012年6月21日
【发明者】鞠佃文, 范佳君, 史训龙, 周珮, 曾贤, 李玉彬, 王子玉, 叶丽, 冯美卿, 李继扬, 朱海燕, 黄海 申请人:复旦大学