专利名称：Mhcⅱ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种MHC II类分子的新用途，尤其是一种体外培养诱导淋巴细胞生产的MHC II类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。
背景技术：
免疫抑制是由于免疫系统受到损害，导致机体对抗原的应答能力下降，对疾病的敏感性增强的一种免疫异常状态，有许多疾病病原的感染可以损害动物的免疫系统，具有免疫抑制性。在动物众多的免疫抑制性疾病中，有些具有明显的临床症状，其危害性容易为人们所认识和重视；而有些却并不表现出明显的症状，但免疫抑制却使机体免疫力降低，使动物对多种外来病原微生物的免疫应答能力降低，甚至消失，显著增加了动物的发病率和治疗难度，给养殖者造成了巨大的经济损失。主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex, MHC)是一个与机 体免疫反应相关的基因群，该基因群有100多个基因位点，其编码产物包括MHCI类分子和MHC II类分子，是一些能够提呈抗原的分子，在调节免疫应答和免疫细胞发育中发挥作用。MHC II类分子是呈现在免疫系统特定细胞(APC)表面的由a链和0链非共价链相连组成的一组高度多态性的跨膜糖蛋白，可提呈经过加工的外来抗原给辅助性T细胞的抗原受体，导致辅助性T细胞激活和分化，从而在诱发免疫应答中起重要的作用。如在一些病毒感染的疾病中，病毒的某些蛋白就是通过干扰MHC II的功能，影响了正常的免疫识别。MHC II类分子在抗原提呈过程中可介导APC的多条信号转导通路、凋亡等多种生物学行为，一些在正常情况下不表达MHC II类分子的细胞，在生长过程中亦可受细胞因子等诱导表达MHC II类分子，因此MHC II类分子的表达被看成是抗原递呈能力的标志。细胞因子(cytokine, CK)则是一类能在细胞间传递信息的蛋白质或小分子多肽，通过与靶细胞膜表面的受体相结合并将信号传递到细胞内部以发挥广泛多样的生物学功能。免疫活性细胞产生的具有免疫调节和效应功能的细胞因子，以其多种多样的生物学活性，在体内构成功能性细胞因子网络，彼此协作或相互制约，对细胞间相互作用、细胞的增殖分化和效应功能有重要的调节作用，有助于提高MHC II类分子的免疫增效作用。由于现有MHCII类分子的提取方法存在着操作复杂、原料来源较少、得率低、成本高以及潜在携带外源病毒及其他病原微生物的危险，很难实现产业化，迄今为止，未发现国内外关于MHCII类分子相关产品的报道，更没有关于MHCII类分子在制备防治动物免疫抑制药物中应用的相关报道。
发明内容
本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，发现了体外培养诱导淋巴细胞而制备的MHC II类分子有防治动物免疫抑制的作用，从而发明了 MHC II类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。本发明的技术解决方案是一种MHC II类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。所述MHC II类分子是通过体外培养诱导淋巴细胞而制备，制备方法包括如下步骤
a.用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层； b.对淋巴细胞单层进行传代培养；
c.当传代淋巴细胞长成单层后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人参皂苷、美洲商陆及肿瘤刺激剂中的至少两种丝裂原诱导培养48小时，丝裂原加入量为5 10ug/mL ；
d.将细胞培养物经超声破碎后取样检测MHCII类分子的浓度。本发明是发现了体外培养诱导淋巴细胞而制备的MHC II类分子有防治动物免疫抑制的作用，从而发明了 MHC II类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用，按一定剂量给动物使用，可以预防和治疗动物免疫抑制疾病，具有安全、高效、反应时间短、作用时间长、用量小、无污染、无残留等优点。
图I是本发明实施例I细胞显微镜下图。图2是本发明实施例I体外抑制病毒的实验散点图。图3是本发明实施例2 REV病毒检测结果示意图。图4是本发明实施例2剖检结果示意图。图5是本发明实施例3新城疫抗体监测结果示意图。
具体实施例方式实施例I :
具体操作方法可以按以下步骤进行
a.处理新鲜猪脾脏；
取新鲜猪脾脏，立即放入无菌烧杯中，加入平衡盐液浸泡半小时或浸于1%新洁尔灭溶液中，取出以碘酒酒精消毒脾脏表面，用解剖剪及镊子去除脾脏脂肪及包膜，用平衡盐液洗涤一次，再将脾脏剪成小段移入平皿中，最后用眼科剪将脾脏剪成Imm3小块，再用平衡盐液洗涤2-3次，以去除血细胞、色素物质及剪碎过程中机械损伤的细胞；
b.消化及分散组织块；
将上步清洗过的平衡盐液吸掉，将剪碎的组织块移入三角烧瓶中，按组织块体积的5倍量加入0. 25%胰蛋白酶液(PH7. 6-7. 8)，置37°C水浴中消化30分钟，每隔10分钟摇动一次锥形瓶，以便组织块散开，以利继续消化，直到组织变成松散、表面发毛时为止，这时从水浴中取出锥形瓶，吸去胰蛋白酶液，再用平衡盐液洗涤3次，用0. 5%水解乳蛋白-Hanks液洗，用口径稍大的吸管吹打数次，用四层纱布过滤；
c.细胞计数；
采用标有0. Imm字样的血球计数板进行计数，计数方法与白细胞计数方法相同；
d.细胞悬液的分装和培养；
按细胞计数结果，将细胞悬液用DMEM营养液调整至60万/毫升细胞悬液，将细胞悬液分装入细胞培养瓶和细胞转瓶，分装量为该瓶容量的1/5，盖上盖，做好标识，然后将细胞培养瓶和转瓶分别放在二氧化碳培养箱和转瓶机上培养；
e.观察；
置于37°C培养的细胞，需逐日进行观察，若细胞已生长，则要观察细胞的形态特征并判断其所处的生长阶段(游离期、吸附期、繁殖期、维持期和衰退期)，直至形成淋巴细胞单层；
f.对淋巴细胞单层进行传代培养；
g.当传代淋巴细胞长成单层后，进行诱导培养；
当显微镜下观察传代淋巴细胞长成单层后，加入溶解过滤后的刀豆蛋白A (Con A)、美洲商陆(PWM)和人参皂苷(GS)诱导培养，加入量分别是刀豆蛋白A (Con A)5ug/mL、美洲商陆(PWM) 2ug/mL 和人参皂苷(GS) lug/mL ；
h.诱导培养48小时后对产品进行检验；
将细胞培养物经冻融、超声波破碎、过滤后取样检测。本实施例I所得培养物中MHCII类分子的含量为1000 2500ng/L ；
MHCII类分子的含量测定对MHCII类分子的定量多以多肽含量定量，利用紫外分光光度计或ELISA检测试剂盒进行测定多肽含量(以多肽含量Img为一个单位)；i 半成品和成品的检验。半成品检验半成品进行细菌内毒素、无菌检查、pH值等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。成品检验成品进行MHCII类分子的含量检测、外观检测、pH值、多肽含量、特异活性试验、蛋白质反应、无菌检查、细菌内毒素、异常毒素等项检测，检测要求应符合中华人民共和国药典2000年版二部附录中的规定。实验例I :体外抑制病毒实验
具体体操作方法可以按以下步骤进行 a.鸡胚成纤维细胞的制备。 取9-11日龄的鸡胚，无菌状态下制备鸡胚成纤维细胞，铺满96孔板，待其长成单后，准备试验。b.网状内皮组织增生症病毒(REV)复苏。取存与_86°C冰箱中的网状内皮组织增生症病毒(REV)，按常规方法复苏，病毒的TCID50 为 10'c.不同梯度的本发明实施例I制备的MHCII类分子对网状内皮组织增生症病毒的抑制作用。向96孔板中除了第一列空白孔各加入网状内皮组织增生症病毒50微升，再将96孔板的第一列为空白孔，加入200微升正常的培养基，第二列为对照孔，加入200微升正常的的培养基，第三列为实验一组，加入200微升含10微升本发明实施例I (含MHCII类分子的细胞培养物)的培养基，第四列为实验二组，加入200微升含20微升本发明实施例IMHCII类分子的培养基，依次类推至第十二列孔。d. ELISA试剂盒检测。按照网状内皮组织增生症病毒病毒(REV)的检测试剂盒说明书操作。e.检测结果如下表及图I、图2所示。图I中A是正常鸡胚成纤维细胞，B是REV病毒作用后的细胞。
结果表明
权利要求
1.一种MHC II类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用。
2.根据权利要求I所述MHCII类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用，其特征在于所述MHC II类分子是通过体外培养诱导淋巴细胞而制备，制备方法包括如下步骤 a.用脾脏或外周血制备淋巴细胞单层； b.对淋巴细胞单层进行传代培养； c.当传代淋巴细胞长成单层后，用刀豆蛋白A、脂多糖、植物血凝素、人参皂苷、美洲商陆及肿瘤刺激剂中的至少两种丝裂原诱导培养48小时，丝裂原加入量为5 10ug/mL ； d.将细胞培养物经超声破碎后取样检测MHCII类分子的浓度。
全文摘要
本发明是发现了体外培养诱导淋巴细胞而制备的MHCⅡ类分子有防治动物免疫抑制的作用，从而发明了MHCⅡ类分子在制备防治动物免疫抑制药物中的应用，按一定剂量给动物使用，可以预防和治疗动物免疫抑制疾病，具有安全、高效、反应时间短、作用时间长、用量小、无污染、无残留等优点。
文档编号A61K38/17GK102716466SQ20121023258
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月6日 优先权日2012年7月6日
发明者刘艳, 江国托 申请人:江苏三仪生物工程有限公司