一株地衣芽孢杆菌H₂及其应用的制作方法

专利名称：一株地衣芽孢杆菌H₂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株经分离而获得的耐酸、耐热、耐胆盐且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H2及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用，属于预防兽医技术领域。
背景技术：
我国是一个养禽大国，由于规模化、集约化养殖业的迅猛发展，畜禽药物残留和病原菌污染引起的疾病层出不穷，不仅危害动物健康，而且对我国畜牧业造成巨大的经济损失。所以，预防和治疗畜禽的各种疾病成为养殖业的首要任务。近年来，全世界主要的养禽国家和地区都普遍存在由产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)引起的鸡坏死性肠炎,而该病原菌(产气荚膜梭菌)广泛存在于自然环境中。自2001年至今，我国在肉、蛋鸡养殖行业由产气荚膜梭菌增殖导致的鸡肠道坏死性肠炎疫区主要集中在长江以东(曹河源.2006.吉林畜牧兽医，27:42-42)。添加抗生素促生长剂(AGP)饲喂的鸡与不用药的鸡相比，大大减少了坏死性肠炎的发生率。但是长期使用抗生素造成畜禽抗药性增强，机体免疫力下降，最后造成抗生素残留超标，严重危害人类和动物健康。从2006年I月始，欧盟已全面禁止在动物饲料中添加抗生素(刘兴海.2007.现代畜牧兽医，5:35-36)。随着抗生素在我国的限用，甚至禁用，该病在我国养鸡业中将越来越严重。目前所知的鸡坏死性肠炎患病因素可能还远远不足，要考虑各种患病因素的影响，抑制产气荚膜梭菌的增殖，找到动物生长和产气荚膜梭菌污染的均衡点，这才可能找到最有效的防控措施(虞传峰.2010.上海畜牧兽医通讯，6:41-43)。因此，抓紧建立规模化养鸡场鸡坏死性肠炎的防治措施，促进我国养鸡行业的健康发展，具有重要的现实意义。益生菌(又叫微生态制剂，或微生物制剂，或微生物饲料添加剂)是最先被提出的抗生素替代品，它的作用主要在于扶植正常微生物菌群，调节生态平衡(李长强.2010.江西饲料，2:21-24)。自上世纪八十年代以来，微生态制剂作为生物兽药和饲料添加剂已用于仔猪、犊牛、羔羊、家禽等动物的部分疾病的治疗和预防上。现已证明，有些芽孢杆菌是具有特殊功能的益生菌，其微生态制剂具有防治疾病、促进生长等功效，且无毒、无残留。迄今为止尚未见到有关地衣芽孢杆菌H2的筛选及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用的报道。

发明内容
针对目前抗生素的滥用及禁用导致疾病很难治愈的情况以及禽类感染产气荚膜梭菌发生坏死性肠炎后难以治愈或无法治疗等问题，本发明的目的是提供一种具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H2 ;同时也提供该地衣芽孢杆菌H 2在兽药或饲料中的应用，可用以治疗由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，并提高鸡肠道微生物多样性。本发明参考益生菌可用于临床上预防和治疗动物疾病的思维，从健康鸡回肠内容物中筛选出耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H2并制作成菌剂，然后将该菌剂应用到兽药或鸡饲料中，证明添加本发明菌剂H2后，可以预防和治疗鸡坏死性肠炎；同时发现菌剂H2的应用能显著提高鸡肠道微生物的多样性，调整鸡肠道微生态平衡，改善鸡生长性能。具体讲，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:本发明获得具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌H2的方法是(见图1):采集健康鸡回肠内容物样品，用蒸馏水稀释后，用不同筛选培养基进行分离培养和鉴定，得到一株对鸡产气荚膜梭菌有显著抑制作用的菌株H2，然后进行耐酸、耐胆盐试验，并将其菌液、菌体、代谢产物做拮抗试验和生物学性能试验。通过PCR扩增出菌株!12的163 rDNA片段，经测序获得目的基因序列。用美国生物信息学中心(NCBI)的BLAST程序对所初步获得的菌株H2的16S rDNA序列进行登录，获得登录号为 FJ549021 (GenBank (Http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/),与已收录的序列进行核苷酸同源性比较。经过微生物学分类鉴定，确定该分离的菌株4为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)H2,该菌株已于2011年4月20日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为:CCTCC NO:M2011133。本发明地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H2(以下简称为“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”)按照常规甘油冷冻方法保藏。本发明也提供本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”在兽药或饲料中的应用。采用农业微生物常规操作方法将本发明制备成含“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”活菌含量lX109cfu/g至lX101Qcfu/g范围的微生物制剂(以下简称“菌剂”)，以0.05%至0.4%比例添加在鸡饲料中，使其在鸡饲料中活菌含量为I X 105-4X 106cfu/g，或以每日每只鸡饲喂该菌剂20mg至50mg(连续使用5_7天)，可以防治由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高鸡肠道微生物多样性的效果，增强机体免疫器官指数，改善鸡生长性能。本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”菌剂还可参照无锡中`顺生物有限公司公开的发明专利(公开号为CN101147529，发明名称:一种水产养殖的微生态制剂及其制备方法)所介绍的方法生产，应用后同样能获得相同效果。本发明具有以下效果:(I)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”具有耐酸、耐热、耐胆盐，抑菌效果好且
对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性，可用于治疗由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎并提高鸡肠道微生物多样性。(2)本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”可直接在兽药或饲料中应用；也可制成微生物制剂，作为兽药和鸡饲料添加剂使用，比如添加于鸡饲料中使用，可有效预防和治疗由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎，促进其肠道内正常生理性厌氧菌的生长，调整肠道菌群失调，恢复肠道功能，提高鸡肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善鸡生长性能。这会给生物兽药业和饲料工业带来良好的经济效益。本发明适用于饲料厂、兽药厂和规模化养鸡场。


图1为本发明的技术流程图。图2为体外初筛拮抗产气荚膜梭菌的本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”图。图3为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的耐酸性试验结果图。图4为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的耐胆盐试验结果图。图5为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的菌液、菌体、代谢产物的拮抗试验
结果图。图6为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”总DNA的0.8%琼脂糖凝胶电泳检
测结果图。图7为从Genbank里搜索出芽孢杆菌属内12个不同种的16S rRNA序列建立芽孢杆菌属系统发育树图。图8-10为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对14日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。图11-13为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对21日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。图14-16为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”预防各组对28日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。图17为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗感染鸡回肠粪样细菌16S rRNAV3区PCR扩增结果图。该图中，Marker为D2000，PCR扩增得到200bp左右的16S rRNA V3区片段。图18-20为本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”治疗各组对28日龄鸡回肠菌群的DGGE图谱、聚类分析图和多样分析图。
具体实施例方式实施例1:本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的获取与鉴定，见图11、本发明“地衣芽孢杆菌CCTCC2011133”的分离、获取1.1菌株的分离采集位于中国四川省雅安市内的四川农业大学动物房饲养健康鸡回肠内容物，立即送实验室检测。取新鲜回肠内容物0.5g，放入加有49.5ml生理盐水并带有玻璃珠的三角瓶中，摇床37°C震荡20min，然后60°C恒温水浴20min。取0.5ml稀释粪液做十倍递减稀释到10_5。从10_3 10_5各稀释度取100 μ L涂布于普通营养琼脂培养基，37°C恒温培养12h(见图 2)。镜检培养基上的单个菌落。挑取芽孢杆菌单菌落在普通营养琼脂平板上画线培养，每个单菌落重复平板 画线2 3次，直到得到纯的芽孢杆菌。将得到的芽孢杆菌接种于营养琼脂斜面，保存备用。1.2耐酸试验将筛选到的芽孢杆菌培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，IOmin, 4°C ) ；0.25%生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于0.05M磷酸缓冲液-pH2.0中，37°C培养I 3h，检测培养期间活菌数的变化。试验结果显示，菌株在PH4.0时的活菌数较pH6.0下降，存活率在80%左右；pH2.0时存活率达到50%以上(见图3)。表明本发明菌株H2具有较强的耐酸性。
1.3耐胆盐试验将筛选到的芽孢杆菌培养过夜，离心收集菌体(4000r/min，IOmin, 4°C ) ；0.25%生理盐水漂洗一次后离心；悬浮于与初培养基等体积的含1%胆盐的生理盐水中，37°C作用6h ;检测活菌数的变化率。试验结果显示，菌株在胆盐浓度为0.6%时耐受性达到30%以上(见图4)。这表明本发明菌株H2具有较强的胆盐耐受性。1.4抑菌试验1.4.1按照(徐春厚.2010.华南农业大学学报，2:117-120)方法制得芽孢杆菌菌体，上清液用0.22 μ m细菌滤器过滤，即得芽孢杆菌代谢产物(见图5)。1.4.2采用双层琼脂扩散法:将芽孢杆菌接于普通营养琼脂平板上，37°C培养24h。然后用0.7%软营养琼脂覆盖(加有IO8AiL的指示菌)，倒置平板。37°C再培养24h。测量抑菌圈的直径。菌株H2代谢产物的抑菌直径基本等于其菌液的抑菌直径(见表I)。表I芽孢杆菌菌液、菌体、代谢产物的抑菌直径(单位:mm)
权利要求
1.一株地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H2,其特征在于该菌株耐酸、耐热、耐胆盐，且对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性，该菌株已于2011年4月20日由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO:M2011133。
2.权利要求1所述的 菌株或含有该菌株的微生物制剂在防治鸡坏死性肠炎中的应用。
全文摘要
本发明公开了一株耐酸、耐热、耐胆盐并对产气荚膜梭菌具有良好拮抗性的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)H2及其在防治鸡坏死性肠炎中的应用。该菌株通过分离、筛选和鉴定而获得，保藏编号为CCTCC NOM2011133；该地衣芽孢杆菌H2可制成微生物制剂，作为兽药和鸡饲料添加剂使用，能有效防治由产气荚膜梭菌引起的鸡坏死性肠炎，促进鸡肠道内正常生理性厌氧菌的生长，提高鸡肠道微生物多样性及免疫器官指数，改善鸡生长性能。本发明适用于饲料厂、兽药厂和规模化养鸡场。
文档编号A61P31/04GK103243041SQ20121026189
公开日2013年8月14日 申请日期2012年7月27日 优先权日2012年7月27日
发明者倪学勤, 曾东, 李洁萍, 曾燕, 舒刚, 景波, 彭焕伟 申请人:四川农业大学