专利名称：人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞(nk)及注射液的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种利用人脐带血或外周血的有核细胞作为种子细胞，采用エ业化大规模生产方式，制备自然杀伤性细胞(NK)的方法；特别是一种人异基因有核细胞エ业化制备自然杀伤性细胞(NK)及注射液。
背景技术：
自然杀伤细胞(nature killer cell,NK cell)是人体介导固有免疫细胞，其表面标记的主要代表是⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，它的特点是含有穿孔素和颗粒酶，不用预先致敏就可以裂解对NK细胞敏感的肿瘤细胞，从而杀伤肿瘤细胞。自然杀伤细胞是介导抗 体依赖的细胞毒作用的主要细胞，它表达肿瘤细胞坏死因子家族的几个配体，可以导致多种肿瘤靶细胞凋亡。这种以肿瘤细胞凋亡方式杀伤肿瘤细胞的机制比分泌性的,颗粒介导的杀伤还被科学家看好，因为大多数肿瘤细胞的受体对凋亡导致的死亡敏感，所以自然杀伤细胞(NK)在抗肿瘤方面非常有意义。自然杀伤细胞的抗肿瘤作用是国际主流医学不争的事实。自然杀伤细胞(NK)能导致多种肿瘤细胞凋亡，是肿瘤免疫治疗的ー个途径，国际医学界的共识。而该自然杀伤细胞(NK)是人体内淋巴细胞中的ー类，数量很少，仅占淋巴细胞总数的1-1.5%，所以，如何获得自然杀伤细胞(NK)成了医学界的热点。科学家用病人自体外周血细胞加细胞诱导因子培养扩增2— 6周，使得⑶56 +和CD3+细胞增加5 —10%不等，这ー方法获得的杀伤性淋巴细胞称为细胞因子诱导杀伤性细胞CIK细胞Cytokine induced killer cell)。也有科学家采取先获得间充质干细胞(MSC)体外诱导培养自然杀伤细胞(NK)的；也有用造血干细胞诱导培养自然杀伤细胞(NK)的。这些诱导培养获得自然杀伤细胞(NK)的方法都有一定局限性。对于晚期肿瘤者不是医生认为该用细胞治疗就用CIK细胞治疗，往往是受到培养时间、培养条件的限制。自然杀伤性细胞的时间长于癌症病人的病情发展时间，在临床上受到一定的限制。自然杀伤性淋巴细胞是医学界肯定的抗肿瘤细胞和抗免疫カ的细胞治疗方法。在临床上都是用病人的外围血分离出单个核细胞加上细胞诱导因子在体外培养扩增了 2-6周，培养诱导的目的是让单核细胞生长成T淋巴细胞(表面标志物⑶3+，⑶56+)达到一定数量后回输给患者。正常人体内CD3+、CD56+细胞数量很少，而用体外诱导培养的方法扩增2-6周，⑶3+最低达到20%，⑶56+最低达到5%以上，用于个性化治疗在临床取得了一定的疗效，使五年存活率明显升高。但是，在临床治疗的开展和推广方面还有局限性。首先，由于这项技术是以单个核细胞为载体，加上细胞诱导因子，培养扩增为杀伤性淋巴细胞用于临床治疗的。目前为止全世界绝大多数都是采用一対一的个性化治疗。即采集ー份患者的单个核细胞或者是采集一份供体血液，分离出单个核细胞，在体外诱导扩增后用于患者治疗各种实体肿瘤。这种传统的治疗方法首先是ー对一的个体化治疗方法，只能在医院床边开展。
第二，这种治疗方法自然杀伤性细胞制备的时间一般需要2— 6周，对于晚期肿瘤病人，尤其是手术后放疗、化疗的病人来讲，有的病人就等不到细胞制备完成，等不到细胞回输的时候就与世长辞了。第三，由于ー对一的治疗，也就是每ー个人要做一全套细胞诱导扩增培养的过程，从实验室管理角度讲，室内质量控制很难，室间质量控制更难。尽管是ー个非常好的医疗技术，但很难推广和普及。不是每个病人都享有平等的治疗机会。第四、上述方法制备的CIK细胞从理论上讲是由成体干细胞诱导、培养和扩增而来的，培养液中含有大量的成体干细胞，可以无限繁殖生产CIK细胞。在临床上其扩增繁殖时间5-6周以后其繁殖速度明显下降，繁殖的量(倍増数)也明显不及早期。而且随着繁殖代数的増加对肿瘤细胞的免疫杀伤作用也降低。所以控制和撑握 自然杀伤性细胞(NK)的培养传代的周期很重要，保持自然杀伤性细胞(NK)生物活性更重要。第五、传统的方法采取肿瘤病人来源的单个核细胞或者造血干细胞为原代细胞，细胞因子诱导CIK细胞。这些来源肿瘤病人的单个核细胞，部分病人的单个核细胞与所患的肿瘤细胞有共同抗原性，所以用这些病人的单个核细胞作为原代细胞，诱导的CIK细胞的抗肿瘤能力往往较差。异基因脐带血有核细胞中含有丰富的干细胞已经被科学家证实，这些干细胞生物活性优于自体骨髄、自体外周血来源的干细胞。这是一群具有多向分化潜能和増殖潜能的干细胞。干细胞种类也很丰富，含有造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、不受限的体干细胞(USSCs)、类胚胎样干细胞(CBEs)、多潜能成体祖细胞(CB-MPCs)等。异基因来源的外周血有核细胞中虽然不及脐带血含有丰富的干细胞，但是，含有造血干细胞(HSC)、间充质干细胞(MSC)、少量的多潜能成体祖细胞(CB-MPCs)等。从脐带血和外周血提取分离有核细胞的方法有多种，本发明涉及的提取方法是申请人在先授权的专利“ー种有核细胞体外分离试剂盒及其应用方法”(专利号ZL200610106875. 5)和使用Ficoll或percoll采用密度梯度离心法分选出有核细胞技术。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术缺陷，提供人异基因有核细胞エ业化制备自然杀伤性细胞(NK)及注射液。本发明的目的按照下述方案实现一种从脐带血或外周血制备自然杀伤细胞(NK)的方法，包括以脐带血或者外周血为原料，采用有核细胞分离提取方法获得干细胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度离心法分选出有核细胞；将上述有核细胞用细胞培养液稀释，再加上干扰素、白介素、CD3抗体、人血白蛋白，一起灌装至生物反应器中进行灌流培养，然后进行扩增培养；扩增培养自然杀伤细胞(NK)的传代次数不小于8代，时间不少于4周；扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为 CD3' CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中 CD16+/CD56. ^ 15%, CD37⑶56+彡50%,⑶8+/⑶57+彡8%。本发明是采用来源于脐带血库的脐带血，或者来源于中心血库的外周血，在保证来源合法、健康供体的脐带血或外周血，从中分离提取有核细胞作为种子细胞；分离提取技术采用了申请人拥有专利权的“骨髄、脐带血细胞处理盒”(专利号ZL200610106875. 5)分离提取脐带血干细胞；或者使用Ficoll或percoll采用密度梯度离心法分选出有核细胞。上述细胞培养液是无血清培养液GT-T551或RMP1-1640 ；上述干扰素为Y -干扰素(IFN- Y )；上述白介素是以下三种之ー或其组合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7 (IL-7)；上述灌流培养的温度是37°C ;上述扩增培养在生物反应器里或者在エ业化使用的灌流培养箱中进行。扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中 CD16+/CD56+ 彡 15%，CD37CD56+ 彡 50%，CD8+/CD57+ 彡 8%。 培养扩增后的成品自然杀伤细胞(NK)需经质量控制检測。检测项目包括①细胞⑶表型(CD3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+)②细胞染色体核型，或采取微阵列测序检测。③无菌检测④细胞悬液细胞内毒素检测< 2EU/ml ;⑤细胞存活率检测> 96%。本发明提供了一种人异基因有核细胞エ业化制备的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其是以合法来源的脐带血或者外周血为原料，采用有核细胞分离提取方法获得干细胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度离心法分选出有核细胞；将上述有核细胞用细胞培养液稀释，再加上干扰素、白介素、CD3抗体，一起灌装至生物反应器中进行灌流培养，然后进行扩增培养；扩增培养自然杀伤细胞(NK)的传代次数不小于8代，时间不少于4周；扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/⑶56+彡15%，⑶37⑶56+彡50%，⑶8+/⑶57+彡8%，将以上方法获得的细胞悬液配制成一定浓度的注射液，即为成品；上述细胞培养液是无血清培养液GT-T551或RMP1-1640 ；上述干扰素为Y -干扰素(IFN- Y )；上述白介素是以下三种之ー或其组合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7 (IL-7)；上述灌流培养的温度是37°C ;上述人血白蛋白为药用人血白蛋白。上述扩增培养在生物反应器里或者在エ业化使用的灌流培养箱中进行，如美国GE公司生产的Wave，或者国产的エ业反应釜中进行灌流培养箱。扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中 CD16+/CD56+ 彡 15%，CD37CD56+ 彡 50%，CD8+/CD57+ 彡 8%。培养扩增后的自然杀伤细胞(NK)需经质量控制检測。检测项目包括①细胞CD表型(⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+)②细胞染色体核型，或采取微阵列测序检测。③无菌检测④细胞悬液细胞内毒素检测< 2EU/ml ;⑤细胞存活率检测> 95%。检测合格后将细胞悬液配制为IX 106/ml的浓度，然后分装为合格的“自然杀伤性细胞(NK)注射液”出厂，分装量按临床医生的要求而定，最小为每支10毫升，供临床使用。成品的自然杀伤性细胞(NK)注射液，必须采取冷藏运输和保存(冷链)，最佳保存、运输温度4°C。本发明的核心就是选用异基因脐带血来源或者外周血来源的有核细胞，经过细胞诱导因子诱导，エ业化扩增培养，制备成自然杀伤性细胞注射液(药品)，直接供临床医生抗肿瘤治疗。临床用于治疗肝癌、子宮癌、胃癌等恶性肿瘤的效果显著。1、治疗肝癌适用于肝癌手术切除后，疑似有肝癌转移，化验甲胎蛋白(AFP) >400ng/ml(ELISA法測定)，白细胞总数< 3. 6 X 109/し其他免疫指标明显低下的患者。采用细胞浓度IXlO6Ail自然杀伤性细胞(NK)注射液50ml，静脉注射，隔日一次，共5次为ー个疗程。完成一个疗程后，第一周末有46%的病人AFP开始下降,到第四周末有91. 5%的病人AFP可以100ng/ml以下或接近正常水平。白细胞在第一周末开始升高，两周有91的病人升至正常水平(男3· 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16 X 109/し)，病人的一般状况明显好转。根据病人的具体情况间隔3—6个月进行第二个疗程和 第三疗程，两年存活率明显升高近50%。不良反应自然杀伤性细胞(NK)注射液静脉注射后，偶尔有低热，很少超过37. 60C，可用物理降温，維持一天后自行恢复，偶尔有恶心、呕吐。2、治疗子宮癌适用于子宮癌手术切除术后，疑似有转移的患者，临床化验癌胚抗原(CEA) (ELISA法測定)>20ng/ml，白细胞总数明显低于正常水平。采用细胞浓度I X IO6/ml自然杀伤性细胞(NK)注射液50ml，静脉注射，隔日一次，共5次为ー个疗程。子宮癌患者静脉注射自然杀伤性细胞(NK)注射液7天开始有41%的病人CEA开始下降，到第四周末有95%的病人CEA降至10ng/ml以下或接近3ng/ml正常水平。白细胞在第一周末开始升高，两周有90%的病人升至正常水平(男3. 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16X109/L,)，病人的一般状况明显好转。根据病人的具体情况间隔3— 6个月进行第二个疗程和第二疗程。不良反应自然杀伤性细胞(NK)注射液静脉注射后，偶尔有低热，很少超过37. 60C，可用物理降温，維持一天后自行恢复，偶尔有恶心、呕吐。3、胃癌的治疗适用于胃癌手术切除术后，有转移的患者，临床化验癌胚抗原(CEA)(ELISA法測定)> 20ng/ml，白细胞总数明显低于正常水平。采用细胞浓度I X 106/ml自然杀伤性细胞(NK)注射液50ml，静脉注射，隔日一次，共3次为ー个疗程。胃癌患者静脉注射自然杀伤性细胞(NK)注射液7天开始有52%的病人CEA开始下降，到第四周末有90%的病人CEA降至10ng/ml以下或接近3ng/ml正常水平。白细胞在第一周末开始升高，两周有89%的病人升至正常水平(男3. 97 9. 15X109/L，女3. 69 9. 16X107L，)，病人的一般状况明显好转。根据病人的具体情况间隔3— 6个月进行第二个疗程和第三疗程。不良反应自然杀伤性细胞(NK)注射液静脉注射后，偶尔有低热，很少超过37. 60C，可用物理降温，維持一天后自行恢复，偶尔有恶心、呕吐。本发明解决了目前自然杀伤细胞或者CIK细胞在临床治疗上那种传统的漫长的制备过程，让临床医生随时随地的、方便的使用自然杀伤性细胞注射液(药品)，尽早的治疗肿瘤患者；同时将自然杀伤性细胞实现エ业化生产，使自然杀伤性细胞治疗技术从ー种临床技术，跨越为自然杀伤性细胞注射液的药品，实现细胞药品化的跨越。为エ业化生产细胞药品开辟了ー个先河。为我国在细胞治疗领域创立自有知识产权的细胞药品争得一席之地，力争以自有知识产权的“细胞药品”逐步走向国际市场。采用异基因脐带血来源的有核细胞和异基因外周血来源的有核细胞，在体外用诱导因子诱导自然杀伤性NK细胞有几个优点1、异基因脐带血来源于脐带血库，能够保证来源于健康供体，脐带血有核细胞来源非常丰富，这一途径来源的脐带血有核细胞符合生物安全性需求。异基因外周血来源于各地中心血库，能保证外周血来源于健康供体，能保证质量，符合生物安全性需求。2、本发明采用异基因脐带血来源和异基因外周血来源的有核细胞用细胞诱导因子诱导自然杀伤性细胞的方法可以エ业化生产“自然杀伤性细胞NK注射液”，能按照GMP、CE或按FDA的标准要求，规范的生产出细胞药品。3、エ业化生产的“自然杀伤性细胞NK注射液”方便临床医生使用，医生像用药品 治疗ー样方便的治疗各种癌症。4、诱导杀伤性淋巴细胞CIK的表面特征是⑶3+、⑶56+也有部分是⑶16+，在临床抗肿瘤治疗上仅仅是对部分肿瘤有效。自然杀伤细胞(nature killer cell, NK cell)是人体介导固有免疫细胞，其表面标记的主要代表是⑶3+、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+。NK的抗肿瘤的特点是可以导致多种肿瘤靶细胞凋亡，是以肿瘤细胞凋亡方式杀伤肿瘤细胞的。所以本发明不仅是⑶3+、⑶56+阳性，而且可以选择性的⑶16+、⑶57+、⑶8+的阳性表达，起到对大多数恶性肿瘤有杀伤的功效。
具体实施例方式实施例1从脐带血库申请ー份健康供体的脐带血(不少于50ml)，，(无遗传病、和四项传染病，こ肝、丙肝、艾滋、梅毒)，同时获取可溯源的供体代码。为了安全起见将脐带血再取Iml样品送第三方检测(こ肝、丙肝、艾滋、梅毒四项)和(ΑΒ0血型，RH血型)存档，以备将来溯源之用。确定供体脐带血合格以后，立即制备有核细胞。有核细胞分离提取选用宁夏中联达生物有限公司生产的《骨髄、脐带血细胞处理试剂盒》，按操作说明书要求的步骤分离提取出脐带血有核细胞。在分离过程中注意保存全部的脐带血血清，将血清用O. 22 μ m过滤器过滤后备用。自然杀伤性细胞(NK)培养液的配制；将有核细胞制备过程中保留的脐带血血清按重量1: 200的比例加入GT-T551无
血清培养液，总量大致在10000毫升左右。再加入重量O. 1-0. 5%的药用人血白蛋白；按每毫升20U-200U(国际单位)白介素_2 ;每毫升5-50mg的CD3单克隆抗体；每毫升10U-100U的T -干扰素。将分离提取出的脐带血有核细胞检测存活率，细胞计数，计数出总数。然后按细胞数计算IXlO6Ail浓度，加入自然杀伤性细胞(NK)培养液。常规ー份脐带血分离提取有核细胞IX IO8个有核细胞，自然杀伤性细胞(NK)培养液总量大约在100-150ml之间。(取50yL用微阵列测序检测DNA留着等待与自然杀伤性细胞(NK)注射液成品的DNA检测结果比较)将制备好含有脐带血有核细胞的诱导自然杀伤细胞培养液，放入美国GE公司生产的Wave生物反应器中灌流培养。条件37°C±0. 2°C和 5% CO2 气。内置摇摆式混匀8-12次/min前两日不用加配制的自然杀伤性细胞(NK)培养液，第三日开始视细胞生长速度，计算浓度在l_5X106/ml 之间，按照加2出I的比例每日加入相应量的自然杀伤性细胞(NK)培养液，按1/2的比例抽出灌流液，直到本次配制的自然杀伤性细胞(NK)培养液用完为止，保持1-2天让细胞浓度达到IXlOVml为止。
连续培养4-6周，当细胞密度达到或接近I X 107/ml，计算细胞总数达到IXIOki时，或培养时间达到6周，即完成培养。精心收取所有细胞，用细胞保养液清洗两次。[检测]检测步骤应该放在前面。自然杀伤性细胞(NK)培养过程中的流程检测合格，成品检测合格后制备成I X106/ml的细胞悬液。分袋灌装为规格2X 107/20ml或5X 107/50ml加5% CO2气体密封，制成自然杀伤
性细胞注射液(细胞药品)。供临床医生直接用于治疗，运输必须按低温(最适宜温度4°C)保存和运输。1、细胞培养过程检测(流程质量控制)自然杀伤性细胞(NK)培养过程中从第3天开始每日检测抽出灌流液的细菌内毒素，(检测细菌内毒素彡5EU/ml)。自然杀伤性细胞(NK)培养完成前三天，每天取样进行无菌检测，检测方法參照《中华人民共和国药典》2010版附则。自然杀伤性细胞(NK)培养过程中每周必须做细胞形态学检测，观察核型、细胞大小，以及细胞形态是否正常。2、自然杀伤性细胞(NK)注射液成品检测自然杀伤性细胞(NK)培养完成后，细胞浓缩清洗时将培养液取样，检测细菌内毒素 < 5EU/ml。培养液取样检测支原体，结果应为阴性，检测方法(參照卫生部医政司)主编的《全国临床检验操作規程》(第三版)第六篇第五章。自然杀伤性细胞(NK)注射液的细胞表型抗原检测选用流式细胞仪方法，检测项目和正常值为 CD3' CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中 CD16+/CD56+ ^ 15 %, CD37CD56. ^ 50%, CD8+/CD57. ^ 8% 0细胞存活率检测选用苔盼蓝染色法检测，检测结果存活率检测> 96%为合格产品，反之不合格。取50 μ L用微阵列测序检测DNA与原代细胞的DNA比较有无变异，无DNA变异为正常，产品合格。本例检测结果如表I所示。表INK细胞检测结果
序号检测项目设计合格标准实测值结果
1细菌内毒素彡5EU/mlSS 5EU/ml 合格
2Γ支原体T阴性_Γ阴性厂合格
权利要求
1.一种人异基因有核细胞工业化制备的自然杀伤性细胞(NK)注射液，以合法来源的脐带血或者外周血为原料，采用有核细胞分离提取方法获得干细胞或者使用Ficoll或 percoll密度梯度离心法分选出有核细胞；将上述有核细胞用细胞培养液稀释，再加上干扰素、白介素、CD3抗体、人血白蛋白，一起灌装至生物反应器中进行灌流培养，然后进行扩增培养；扩增培养自然杀伤细胞(NK)的传代次数不小于8代，时间不少于4周；扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为⑶3_、⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/ ⑶56+彡15%，⑶37⑶56+彡50%，⑶8+/⑶57+彡8%，将以上方法获得的细胞悬液配制成一定浓度的注射液，即为成品。
2.一种从脐带血或外周血制备自然杀伤细胞(NK)的方法，包括以合法来源的脐带血或者外周血为原料，采用有核细胞分离提取方法获得干细胞或者使用Ficoll或percoll 密度梯度离心法分选出有核细胞；将上述有核细胞用细胞培养液稀释，再加上干扰素、白介素、CD3抗体、人血白蛋白，一起灌装至生物反应器中进行灌流培养，然后进行扩增培养；扩增培养自然杀伤细胞(NK)的传代次数不小于8代，时间不少于4周；扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为⑶3'⑶56+、⑶16+、⑶57+、⑶8+，其中⑶16+/⑶56+彡15%，⑶37 CD56. ^ 50%, CD8+/CD57. ^ 8% 0
3.如权利要求1所述的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其特征在于上述培养液是无血清培养液 GT-T551 或 RMP1-1640。
4.如权利要求1所述的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其特征在于上述干扰素为Y-干扰素(IFN- Y )。
5.如权利要求1所述的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其特征在于上述白介素是以下三种之一或其组合白介素-2 (IL-2)、白介素-1 (IL-1)和白介素-7(IL-7)。
6.如权利要求1所述的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其特征在于上述灌流培养的温度是 37。。。
7.如权利要求1所述的自然杀伤性细胞(NK)注射液，其特征在于上述扩增培养在生物反应器里或者在工业化使用的灌流培养箱中进行。
全文摘要
本发明涉及一种人异基因有核细胞工业化制备自然杀伤性细胞(NK)及注射液，以合法来源的脐带血或者外周血为原料，采用有核细胞分离提取方法获得干细胞或者使用Ficoll或percoll密度梯度离心法分选出有核细胞；将上述有核细胞用细胞培养液稀释，再加上干扰素、白介素、CD3抗体、人血白蛋白，一起灌装至生物反应器中进行灌流培养，然后进行扩增培养；扩增培养自然杀伤细胞(NK)的传代次数不小于8代，时间不少于4周；扩增培养后获得的自然杀伤细胞(NK)的标志物为CD3-、CD56+、CD16+、CD57+、CD8+，其中CD16+/CD56+≥15％，CD3-/CD56+≥50％，CD8+/CD57+≥8％，将以上方法获得的细胞悬液配制成一定浓度的注射液，即为成品。
文档编号A61P37/04GK102988415SQ201210288669
公开日2013年3月27日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者王沁怡, 王怀林 申请人:王沁怡, 王怀林