Cd38酶抑制剂在治疗气道高反应性疾病中的用途
【专利摘要】本发明涉及一种治疗气道高反应性疾病的药物，5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺。该药物是一种CD38酶抑制剂，可通过抑制Ca2+释放舒张气管平滑肌，对症治疗气道高反应性疾病；我们利用臭氧制作小鼠气道高反应模型，同时给予该药物的乳化剂灌胃治疗，发现经该药物治疗的小鼠气道阻力明显降低、动态肺顺应性明显增加、肺病变程度减轻；另外，实验发现该药物还具有抗炎、抗氧化作用，未发现明显毒副作用，具有良好地开发价值，属于药物领域。
【专利说明】CD38酶抑制剂在治疗气道高反应性疾病中的用途
【技术领域】:
[0001]本发明涉及一种治疗气道高反应性疾病的药物，5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺。该药物是一种CD38酶抑制剂，主要通过扩张气管平滑肌达到治疗目的，同时具有抗炎、抗氧化作用，属于药物领域。
【背景技术】:
[0002]气道高反应性是指气管、支气管本身对各种刺激，包括特异性抗原刺激和非特异性刺激，如物理、化学刺激，呈现过度反应，是支气管哮喘病人区别于正常人的重要特征[1]。虽然气道高反应的诱发因素多种多样，而各种药物的治疗作用环节各不相同，新疗法的研究亦呈多方向性，但基本上从抗炎、抗组胺药、过敏反应介质阻释剂、相应对症[2]和中医药治疗M出发。目前，研究者使用较多的气道高反应模型为卵蛋白(OVA)致敏的大、小鼠模型，但该造模方法的不足之处是造模时间长、成功率不高且操作复杂。由于工业和汽车废气的影响，尤其在大城市周围农林地区，地表臭氧会形成和聚集。地表臭氧对人体，尤其是对眼睛，呼吸道等有侵蚀和损害作用。国内外有很多研究者从臭氧对人与动物的损害及环境保护角度对臭氧进行了研究，发现臭氧不仅能加重呼吸系统疾病，还发现空气污染物中的臭氧与哮喘发作直接相关早在2001年，国内就有研究者利用臭氧攻击原代培养的兔支气管上皮细胞，观察支气管上皮细胞的抗氧化活性[8]。湖南师范大学的张坚松等[9]利用臭氧制作大鼠气道高反应模型，并与卵蛋白(OVA)致敏的大鼠模型比较，发现臭氧吸入制备非变异性气道高反应性大鼠模型的方法简易并可行。该课题组最新研究发现经地塞米松治疗后，臭氧造模的大鼠气道粘液分泌明显减少、气道上皮粘液储备指数和杯状细胞化生指数有显著下降_。0038分子表达与分布相当广泛，主要表达在不成熟的造血细胞和活化的淋巴样细胞，在骨骼肌、心肌、气道平滑肌和子宫平滑肌⑶38分子也有表达。通过⑶38分子的酶催化作用生成的环腺 苷二磷酸核糖(cyclic adenosine diphosphate ribose,cADPR)来调节细胞内Ca2+的释放而调节细胞收缩[11_13]。气道平滑肌的收缩能力主要依靠于平滑肌细胞内Ca2+的浓度，CD38分子可以调节细胞内Ca2+的浓度进而影响气道平滑肌的收缩，在哮喘的发病机制中起到很重要的作用[14]。发明人合成了两种CD38酶抑制剂，做成乳化剂，灌胃治疗臭氧引起的气道高反应小鼠模型，进行药理学研究，完成了本发明。
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【发明内容】
:
[0017]本发明目的是研究两种⑶38酶抑制剂[3-氨基甲酰基-1- ((2- (3_苯氧基苯氧基)乙氧基)甲基)吡啶与5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺]，用于治疗气道高反应性疾病。
[0018]发明人以已知的CD38晶体结构为基础，釆用逐级筛选的策略对商用小分子数据库(Sigma和Maybridge)进行了虚拟筛选。得到的化合物在充分考虑结合模式的合理性和结构多样性的基础上，购买其中23个化合物，进行了 CD38NADase抑制活性测试。根据活性测试的结果以及结构新颖性、合成难度、可衍生性等因素，选定先导物。通过对先导物结构的多次改造和活性测试，最终得到两种CD38酶抑制剂。
[0019]发明人经过研究发现，5-(3-苯基丙酰氨基)-N_(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺除了能通过抑制CD38酶活性，扩张气管平滑肌对症治疗气道高反应性疾病之外，还具有抗炎、抗氧化活性。在本发明当中，通过使用臭氧制作的小鼠气道高反应模型，发明人研究了这两种CD38酶抑制剂的药理作用，发现其中的一种化合物5-(3-苯基丙酰氨基)-N- (4-乙氧羰基苯基)-1H-3-吲哚甲酰胺能够明显降低小鼠气道阻力、增加动态肺顺应性、减轻肺病变程度；另外，实验发现该药物还具有抗炎、抗氧化作用，未发现明显毒副作用。
[0020]本发明药物为淡黄白色粉末，熔点192-194?，溶于DMF、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷，不溶于水，在强酸、强碱存在下分解。本发明药物还可以含有临床上适用的药物赋型剂。其剂型可以是适用于临床的各种常规剂型，例如丸剂、片剂、散剂、口服液体制剂、注射剂等。
【专利附图】
【附图说明】:
[0021]图1:化合物T的结构式；
[0022]图2:BALF中白细胞数；
[0023]*P < 0.05 vs 正常对照组 # P < 0.05 VS模型组
[0024]P = 0.090 VS 模型组P = 0.068 VS 模型组(η = 9 ~10)
[0025]图3 =BALF 中 MDA 含量；
[0026]*Ρ < 0.01 vs 正常对照组 # P < 0.01 VS 模型组(η = 9 ~10) [0027]图4:各组小鼠肺脏病理切片的HE染色图(X 100倍)；
[0028]图5:各组小鼠肺脏病理切片的HE染色图(Χ400倍)。
【具体实施方式】:
[0029]实施例一:化合物T [5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)_1Η_3_吲哚甲酰胺]的理化性质
[0030]化合物T的结构式如图1所示，分子量为455.51，淡黄白色粉末，熔点192_194°C，溶于DMF、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷，不溶于水，在强酸、强碱存在下分解。其溶解度与酸碱稳定性可通过以下实验证明。
[0031]1、溶解度测试
[0032]目的:测试化合物T在不同溶剂中的溶解性
[0033]原理:当20°C时，100g溶剂中的溶解的溶剂的量为I~IOg为可溶，0.01g-1g为微溶，0.01g以下为难溶。向定量样品中加入一定量溶剂，观察溶解情况。
[0034]方法:取2mg样品，加入溶剂震荡，澄清透明无固体视为完全溶解。
[0035]微溶与可溶的分界线为2mg样品能否溶于200mg溶剂中，不溶与微溶的区分为2mg样品能否溶于少于20g溶剂中。因此，向2mg样品中从小到大加入200mg、2g、20g溶剂直至溶解，观察溶解情况，记录下样品的溶解区间。
[0036]结果:2mg样品在200mg甲醇中的溶解情况为:不能完全溶解；2mg样品在200mg甲醇中的溶解情况为:完全溶解；2mg样品在200mg 二氯甲烷中的溶解情况为:不能完全溶解；2mg样品在2g 二氣甲烧中的溶解情况为:完全溶解；2mg样品在200mg丙丽中的溶解情况为:完全溶解；2mg样品在200mg乙酸乙酷中的溶解情况为:不能完全溶解；2mg样品在2g乙酸乙酯中的溶解情况为:完全溶解；2mg样品在200mg N, N-二甲基甲酰胺中的溶解情况为:完全溶解；2mg样品在20g水中的溶解情况为:不完全溶解。
[0037]结论:化合物T溶于N，N- 二甲基甲酰胺、丙酮，微溶于甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯，不溶于水。
[0038]2、酸碱稳定性测试
[0039]目的:测试化合物T对酸碱条件的稳定性。
[0040]原理:化合物T若在酸碱性条件下分解，薄板展开时可以观察到多个斑点。
[0041]方法:将6mg样品溶于1200 μ I丙酮中，加入400 μ I水混合均匀配成样液。根据温度和酸碱性，分成6组，即室温酸、碱、对照组和60°C酸、碱、对照组，每组加入200
[0042]μ I样液和400 μ I丙酮。酸组分别加入200 μ I IN盐酸，碱组分别加入200 μ 120%NaOH溶液，对照组则分别加入200 μ I水。室温酸、碱、对照组置于室温(25°C )下I小时，60°C酸、碱、对照组置于60°C水浴中下I小时，点板，以40: I 二氯甲烷-甲醇体系展开。
[0043]结果:从点板展开情况来看，与室温对照组相比，室温酸组和室温碱组在原点处有明显分解斑点；与60°C对照组相比，60°C酸组和60°C碱组在原点处有明显分解斑点。
[0044]结论:化合物T在室温与60°C条件下均对强酸、强碱不稳定。
[0045]实施 例二:两种CD38酶抑制剂在小鼠气道高反应性疾病模型中的药效学评价
[0046]实验材料:30g左右成年雄性昆明小鼠(清洁级)，购于北京大学医学部实验动物中心；AniRes2005动物肺功能分析系统(北京贝兰博科技有限公司)；乙酰甲胆碱(MCH，美国Sigma公司)；丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；化合物H[3_氨基甲酸基_1_ ((2-(3-苯氧基苯氧基)乙氧基)甲基)吡唳];化合物T [5-(3-苯基丙酸氨基)N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺]。
[0047]实验方法:
[0048]1、购买30g左右成年雄性KM小鼠约68只，造模前一天称重，除去体重过轻或过重小鼠，只保留60只，随机分成6组:正常对照组、模型组、激素组、美普清组、化合物H治疗组与化合物T治疗组；除正常对照组外，各组需臭氧造模，方法为每天下午臭氧攻击lOmin，连续5天，第六天测数据、取样本(实验前后称取小鼠体重，计算体重变化)；给药方案:正常对照组与模型组给予含羧甲基纤维素钠(0.5% )与植物油)的乳化剂；激素组为含
0.lmg/ml激素的乳化剂，丙卡特罗组为含7.5ug/ml丙卡特罗的乳化剂；化合物H治疗组与化合物T治疗组分别为5mg/ml，6mg/ml的乳化剂；每天上午、晚上给药，每只小鼠每次给予
0.2ml，连续5天；第六天早上追加灌胃一次。
[0049]2、第六天用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠，使用AniRes2005动物肺功能分析系统测量小鼠气道功能，所用工具药为预冷的浓度梯度为120ug/ml，240ug/ml，480ug/ml，960ug/ml，
1.92mg/ml的乙酰甲胆碱；测量完毕，将小鼠左侧肺主支气管结扎，右侧肺用PBS灌洗回收支气管肺灌洗液(BALF)，然后剪取左侧肺，每组前5只用4%多聚甲醛保存(用于肺病理功片)，后5只于-80度冰箱冷冻保存；于小鼠眼眶取血，抗凝保存(用于血液中白细胞、红细胞计数)。
[0050]3、将BALF在1500r/min*5min条件下离心,沉淀用于白细胞计数,上清液用于测量丙二醛(MDA)。[0051]结果与讨论:
[0052]1、就实验前后5天内小鼠体重变化而言，与正常对照组相比，模型组小鼠体重明显减轻；其它各组与模型组相比，激素组小鼠体重减轻更加明显，而包括T化合物组在内的各组小鼠体重变化与模型组相比没有统计学意义。说明臭氧造模引起小鼠体重降低，该浓度的激素治疗在臭氧造模的情况下会进一步降低小鼠体重，具有明显毒性，而包括T化合物治疗在内的其它药物未发现此全身毒性。
[0053]2、从血液中白细胞与红细胞计数来看，各组之间比较均没有统计学意义，但与正常对照组相比，激素组有降低血液中白细胞与红细胞数量的趋势(P值分别为0.087与
0.067)，说明该浓度的激素治疗有一定的血液毒性，而包括T化合物治疗在内的其它药物未发现血液毒性。
[0054]3、分析支气管肺灌洗液(BALF)的白细胞数，结果如图2所示，臭氧造模能明显增加BALF中白细胞数，说明臭氧造模引起了小鼠气管与肺局部炎症反应；其它各组与模型组相比，激素组与H化合物组BALF中白细胞数量明显降低，美普清组与T化合物组的白细胞数量有降低的趋势(P值分别为0.090与0.068)，说明激素与H化合物治疗能明显减轻臭氧造模引起的小鼠气管与肺局部炎症反应，美普清与T化合物治疗能一定程度减轻臭氧造模引起了小鼠气管与肺局部炎症反应。
[0055]4、分析支气管肺灌洗液(BALF)的丙二醛(MDA)含量，结果如图3所示，臭氧造模能明显增加BALF中的MDA含量；其它各组与模型组相比，激素组、美普清组与T化合物组BALF中的MDA含量明显降低 ，H化合物组与模型组的MDA含量无明显差别。MDA为多不饱和脂肪酸过氧化物的降解产物，机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，并由此形成脂质过氧化物，使组织细胞受损伤，MDA是一个重要的氧化损伤指标。因此，臭氧造模引起了小鼠气管与肺局部氧化损伤，激素、美普清与T化合物治疗能明显减轻臭氧造模引起的小鼠气管与肺局部氧化损伤，而H化合物治疗无此药理作用。
[0056]5、测得每只小鼠在六种不同状态下(基础状态，120ug/ml、240ug/ml、480ug/ml、960ug/ml与1.92mg/ml的乙酰甲胆碱激发状态)的气道阻力(RL)值(分别设为
X3，X4与X5)，然后设每只小鼠基础状态下的气道阻力为1，把四种不同浓度Mch激发状态下的气道阻力值分别除以该只小鼠在基础状态下的气道阻力值，得五个相对值(即为Xi/X。、X2/XQ、X3/X0> X4/X0和X5/%)，即为RL比值；然后求各组小鼠对应六种状态下RL比值的平均值；然后以这六种状态为横坐标，气道阻力的RL比值的平均值为纵坐标，每组小鼠划一条连续的曲线，然后比较这些曲线的升高趋势，升高幅度越大，表示小鼠对Mch的反应越明显，气道反应性越高。结果如表1所示，与正常对照组相比，模型组呈现明显地气道高反应性，其它各组与模型组比较，美普清组与T化合物组气道阻力明显降低，而激素组与H化合物组气道阻力总体接近于模型组。说明T化合物具有与美普清类似地降低臭氧攻击所导致的气道高反应性的作用，而激素与H化合物治疗无明显作用。
[0057]表1:各组小鼠在不同激发状态下的RL比值CY± s)
[0058]
【权利要求】
1.一种用于治疗气道高反应性疾病的药物，中文名:5-(3-苯基丙酰氨基)-N-(4-乙氧羰基苯基)-1Η-3-吲哚甲酰胺；类别:5_取代丙酰氨基-N-取代苯基-1H-3-吲哚甲酰胺类。
2.按照权利I所述的治疗气道高反应性疾病的药物，其特征是一种CD38酶抑制剂。
3.按权利要求1所述的化合物，其特征在于该化合物是CD38的非共价类抑制剂、吲哚杂环类小分子抑制剂。
【文档编号】A61P11/00GK103655557SQ201210332689
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月11日 优先权日:2012年9月11日
【发明者】蒲小平, 张亮仁, 邓政, 朱志鹏 申请人:北京大学