黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用，所述黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果实经热水提取、乙醇沉淀、脱蛋白、脱色后得到的一组分子量在80kDa～22kDa的糖蛋白复合物。本发明在动物实验发现，黑果枸杞多糖可明显提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指数、提高免疫抑制小鼠淋巴细胞水平；增强免疫抑制小鼠迟发超敏反应能力；增强免疫抑制小鼠抗体分泌水平。细胞实验发现黑果枸杞多糖可显著的提高小鼠脾细胞增殖率，促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌TNF-α和NO等免疫因子，证明黑果枸杞多糖具有很好的免疫活性。
【专利说明】黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及食品保健和医药领域，具体的说是黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用
【背景技术】
[0002]近年来，免疫功能低下，包括原发性及继发性免疫功能缺陷、缺乏或受损，受到国内外研究者的广泛关注，因为它们本身及所诱发的各种并发症，特别是感染，常使病人的病情加重，难以治疗，并可引起严重的后果，甚至危及生命。因此，寻找安全的改善机体免疫功能的药物将会挽救更多的患者，在卫生保健行业有很好的应用前景。
[0003]黑果枸杞(Lyciumruthenicum Murr)系爺科(Solanaceae)枸杞属(Lycium L.),是我国西北荒漠地区一种特有的的野生植物，分布于宁夏、甘肃、青海、新疆、西藏等省。黑果枸杞果实味甜多汁，含丰富的维生素、有机酸及糖类；黑果枸杞也具有医疗保健功能，藏医用于治疗心热病、心脏病、月经不调、停经等病症。多糖广泛存在于中药材中，现代药理学研究证明，多糖是中草药发挥独特疗效的重要物质基础。多糖可通过激活免疫细胞，促进细胞因子生成及表达，对免疫系统发挥多方面的免疫调节作用。黑果枸杞多糖作为黑果枸杞的一个重要组成成分，研究表明其有降血糖和抗疲劳功效，而针对黑果枸杞的免疫活性未见报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用，为临床提供适合免疫功能低下 患者及亚健康人群服用的药品或保健品。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0006]所述黑果枸杞多糖可提高小鼠脾细胞增殖率，促进小鼠巨噬细胞株RAW264.7分泌免疫相关细胞因子，提高免疫抑制小鼠的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫等功能。
[0007]所述黑果枸杞多糖与药物学上可接受的药物/保健品辅料混合形成各种形式的散剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂或注射剂。
[0008]在使用时可采取口吸取、皮下、静脉注射或肛肠给药；注射液的使用可以任意选用生理盐水、葡萄糖、稳定剂、悬浮剂或乳化剂等。
[0009]本发明具有如下优点:
[0010]I本发明表明黑果枸杞多糖具有免疫调节活性，黑果枸杞多糖是黑果枸杞的主要功效成分，具有多种保健功效，纯天然，无副作用，可开发成免疫调节保健品。
[0011]2根据实施例1:实验证明黑果枸杞多糖可明显提高免疫抑制小鼠脾及胸腺指数、提高免疫抑制小鼠淋巴细胞水平；增强免疫抑制小鼠的细胞免疫功能如提高迟发超敏反应能力；增强免疫抑制小鼠的体液免疫功能如提高抗体分泌水平。因此，黑果枸杞多糖具有较强的免疫调节活性，有望为临床提供一种非常适合免疫功能低下人群服用的药品。
[0012]3根据实施例3和4:实验证明在细胞水平上，黑果枸杞可诱导巨噬细胞分泌TNF-α和NO等免疫因子。根据本发明实验结论，为黑果枸杞调节免疫机理进行进一步的研究，确定其作用机理，可开发成免疫冶疗药物。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1黑果枸杞多糖诱导脾细胞增殖；
[0014]图2黑果枸杞多糖对RAW264.7细胞TNF- α的激活作用；
[0015]图3黑果枸杞多糖对RAW264.7产生NO的影响。
【具体实施方式】
[0016]本发明采用黑果枸杞多糖是由黑果枸杞果实经水提法得到的一组分子量在80kDa~22kDa的糖蛋白复合物，通过整体动物实验及细胞生物学实验发现黑果枸杞具有免疫调节活性。
[0017]实施例1动物实验评价黑果枸杞多糖的免疫活性
[0018](I)受试样品:黑果枸杞多糖，由中国科学院大连化物所糖工程研究组制备。
[0019]黑果枸杞多糖(LRP)的制备方法:黑果枸杞果实加4倍体积的水用组织捣碎机打碎至均匀状态，加热超声法(提取条件:温度70°C，超声波频率40KHz，功率50W)提取2h，将提取液离心(6000r/min, IOmin),残洛用2倍体积的水再次加热超声提取Ih,合并两次提取液，浓缩，以4倍体积乙醇醇沉24h， 抽滤，沉淀用50倍体积的水溶解，将Sevage试剂[氯仿:正丁醇=4:1(V/V)]加入样品中，所加Sevage试剂体积为样品体积的1/5，震荡15min，经离心(6000r/min，10min)以去除游离蛋白形成的凝胶状沉淀，取上层清液。滴加少量氨水(NH3 -H2O)将上层清液pH调至9，缓慢向溶液中加入3%H202，在40°C条件下搅拌6h，至颜色变为淡黄色。加0.5mol/L HCl调pH至中性，透析，减压浓缩后冷冻干燥，得到黑果枸杞多糖 LRP (Lycium ruthenicum polysaccharides) ?
[0020]黑果枸杞多糖五个主要组分(LRP1-LRP5)的制备方法:采用弱碱型阴离子交换树脂(DEAE-纤维素)对黑果枸杞多糖进行组分分离，先用3倍柱体积0.05mol/L NaHCO3溶液平衡DEAE-52纤维素层析柱。将黑果枸杞多糖(LRP)配成20mg/mL的水溶液后上样，依次用蒸馏水，0.05,0.1,0.25和0.5mol/L NaHCO3溶液梯度洗脱，洗脱流速为1.0mL/min，将五种洗脱流分收集后，分别减压浓缩，透析除盐，冷冻干燥，得到5个黑果枸杞多糖组分，即LRP1、LRP2、LRP3、LRP4 和 LRP5。
[0021](2)实验动物:雌性昆明小鼠，清洁级动物，6~8周龄，20±2g，由大连医科大学实验动物中心提供，批准号为SCXK (辽)2008-0002，清洁级动物房饲养，温度20±1°C，湿度40%~50%，光照12h，颗粒饲料喂养，自由饮水。
[0022](3)检测项目:小鼠体重、脾脏和胸腺重；血象检测；细胞免疫功能检测，采用足趾肿法测定迟发型变态反应；体液免疫功能检测，测定血清半数溶血值。
[0023](4)实验方法:将小鼠随机分为4组(空白对照组、免疫抑制模型组、黑果枸杞多糖低剂量组、黑果枸杞多糖高剂量组)，每组5只(n=5)，除对照组外，其余各组采取连续5d皮下注射环磷酰胺80mg/kg的方法制造免疫功能低下模型，模型制备成功后，黑果枸杞多糖低剂量组(IOmg.kg-1.0-1)和黑果枸杞多糖高剂量组(30mg.kg-1.cf1)采取腹腔注射的方式给药，空白对照组和免疫抑制模型组用生理盐水给药，注射量按0.lmL/10g体重计，连续给药lOd。按照中华人民共和国卫生部《保健食品检验与评价技术规范》进行上述项目的检测。
[0024]实验各组小鼠给药IOd后，采血抗凝后用血细胞计数仪检测小鼠血象。末次给药前12h，动物禁食，不禁水，停药24h后各组动物处死后，取脾脏、胸腺，称湿重并按公式计算脾和胸腺指数。
[0025]脾指数=脾重量(mg) /体重(g)胸腺指数=胸腺重量(mg) /体重(g)
[0026]各组小鼠在给药第3d，用2%绵羊红细胞腹腔注射，每只小鼠注射0.2mL致敏，5d后测量右后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射20%绵羊红细胞，每只小鼠20 μ L，24h后测量右后足跖部厚度，测量三次取平均值，计算足跖增加厚度(mm)，以足跖增加厚度表示DTH程度。
[0027]各组小鼠于给药第3d，腹腔注射2%SRBC 0.2mL致敏。末次给药后24h，处死动物，小鼠摘眼球取血，分离血清，用生理盐水将血清稀释200倍，将稀释后的血清ImL置试管内，依次加入10%的绵羊红细胞0.5mL，补体ImL (用生理盐水按1:10稀释)，另设不加血清的对照管(以生理盐水代替)。置37°C恒温水浴锅中保温15min，冰浴中终止反应，2000r/min离心lOmin。取上清夜lmL、生理盐水3mL于试管内，同时取10%的SRBC0.25mL于另一支试管内，充分混匀，放置IOmin后，于540nm处分别测定各管的光密度值。
[0028]半数溶血值HC5tl=(样品OD值/SRBC半数溶血时OD值)X稀释倍数
[0029](4)结果:
[0030]黑果枸杞多糖对小鼠免疫器官重量的影响:从表1看出，与空白对照组相比，免疫抑制模型组小鼠脾指数、胸腺指数均低于空白对照组，差异显著。与模型对照组比较，黑果枸杞低剂量组和高剂量组均明显提高免疫抑制小鼠的脾指数和胸腺指数。
[0031]表1黑果枸杞多糖对小鼠脏器指数的影响(X土S，n=5)
【权利要求】
1.黑果枸杞多糖在制备免疫调节药物或保健品中的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于:所述黑果枸杞多糖与药物学上可接受的药物/保健品辅料混合形成`各种形式的散剂、膏剂、粉剂、针剂、水剂或注射剂。
【文档编号】A61P37/04GK103655598SQ201210337716
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年9月12日 优先权日:2012年9月12日
【发明者】杜昱光, 彭强, 孟庆山, 许青松, 李曙光, 王文霞 申请人:中国科学院大连化学物理研究所