专利名称：靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立方法
技术领域：
本发明设计一种抗猪蓝耳病病毒转基因细胞系的构建；具体地讲，本发明设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因ShRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的Marc-145细胞克隆。
背景技术：
猪繁殖与呼吸综合症于上世纪80年代末首次在美国发现，其致病病原为猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRS virus, PRRSV)，主要造成母猪繁殖障碍和大量仔猪死亡，仔猪发病率100%，死亡率50%以上，母猪流产率达30%以上，是一种重要的动物疫病。近年猪蓝耳病在我国大面积暴发，防治高致病性蓝耳病的根本有效措施主要依靠 疫苗，但成本高、手续烦琐，而且价格非常昂贵，极大的增加了养殖成本，增加了猪农的负担，应用范围受到极大限制。猪蓝耳病(PRRS)是严重危害养猪业的病毒性传染病，死亡率极高，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。虽然国内外对PRRS的疫苗研究非常活跃，但到目前为止，仍没有一种疫苗可对猪体产生完全安全的保护，普遍存在难以诱发较早和较高的抗体水平等问题。Marc-145细胞来源于猴肾细胞，从母细胞(MA 104细胞)克隆而得到，可连续传代培养。Marc-145细胞是目前对PRRSV最敏感的细胞系之一。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种靶向基因shRNA干扰猪生殖与呼吸综合症病毒增殖和复制的转基因细胞系的构建方法及相应的重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建方法，为开辟控制猪PRRS感染和减少其危害提供技术支持。为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建方法，包括以下步骤I )、设计靶向基因shRNA 0RF6-6e 5’-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3’3’-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActta
a-5，；2)、构建重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 通过PCR 扩增 zsGFP 和 NEO 片段，将 0RF6_6e 所述的 shRNA 酶切(EcoRI-BamHI)连接到pMD18-TSimple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2 载体上，构建了重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA。本发明还同时提供了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA(即，0RF6-6e)，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。作为本发明的转基因细胞系的构建方法的改进，利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤将重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 用 lipofectin2000 (Invitrogen)转染试剂转染Marc-145细胞；到细胞增长接近汇合时按I :10密度(即细胞密度稀释10倍)传代，继续培养；培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基；S卩，该培养基的制备方法为在每升DMEM (Gibco)基本培养基中加入IOOml的胎牛血清；待细胞密度增至50% 70%汇合时，加入G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基， 每3-5天更换一次G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基；当有大量细胞死亡(即超过80%的细胞死亡)时，改用G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基维持筛选(即，将G418浓度减半进行筛选);每3-5天更换一次G418浓度为600Pg/ml的筛选培养基；筛选10 14天后,有抗性的克隆细胞出现，改用含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基进行培养(即停药培养)，待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系；上述培养和筛选的条件均为于37°C，5% CO2培养箱中培养。G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为120(^g/ml，该培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基。G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为60(^g/ml，该培养基为含有10% (体积浓度)胎牛血清的DMEM (Gibco)基本培养基。本发明还同时提供了利用上述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途对PRRSV型病毒具有抑制作用。本发明的具体技术方案如下步骤(I)、设计能有效阻止猪蓝耳病病毒的增殖和复制的靶向基因shRNA 1-1靶向基因shRNA设计根据PRRSV病毒的基因组序列，以0RF5和0RF6为目的基因，选取一段19bp长的核酸序列。该序列不要在5’和3’非翻译区，以及起始密码子后75bp ;将候选的19bp核酸序列，与相应的基因组进行比对，以确定该序列是特异性的只针对目的基因，与其他基因没有相似性。根据以上原则分别设计了 5对针对PRRSV-0RF5基因和5对针对PRRSV-0RF6基因的shRNA。1-2体外shRNA活性检测设计合成的shRNA序列经退火反应形成具有粘性末端的双链，直接连接到线性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen载体上，构建成RNA干扰载体；将上述质粒DNA,分别在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率(图I)。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析所设计的shRNA对PRRSV型病毒的抑制作用(图2)。由图2可见，针对0RF5和0RF6设计的共10对shRNA均表现出抑制PRRSV病毒增殖复制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差异(O. 71%-67. 52%)。其中ORF6_6e的病毒相对表达量仅为O. 71%，表现出较显著的对PRRSV病毒复制与增殖的抑制作用，可作为转基因的候选shRNA序列。步骤(2)抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建2-1抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因载体构建。经体外shRNA活性检测，筛选出有效阻止PRRSV感染的shRNA，构建转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA (图3)。2-2抗猪蓝耳病病毒活性检测。将构建好的上述质粒DNA，在转染试剂介导下导入Marc-145细胞，24小时后进行荧光观察，确定转染效率。转染24小时后对细胞接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测病毒感染后，细胞中病毒相对表达量，分析转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA对 PRRSV型病毒的抑制作用。步骤(3)抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的建立3-1建立转基因细胞系将上述转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA和helper质粒用Iipofectamine 2000转染试剂转染Marc-145细胞。转染后培养24小时，观察荧光蛋白的表达情况。到细胞增长接近汇合时按I : 10密度传代(即细胞密度稀释10倍)，继续培养。待细胞密度增至50% 70%汇合时，加入按最佳筛选浓度配制好的G418(120(^g/ml)筛选培养基。根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选(也需每3-5天更换一次筛选培养基)；筛选10 14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；将细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆(图4)。在荧光显微镜下观察这些克隆GFP的表达情况。3-2抗猪蓝耳病病毒活性检测对转基因细胞系接种PRRSV病毒，接毒48-72小时后将上清悬液和细胞分开收集，通过Real-Time PCR方法检测细胞中病毒相对表达量，分析转基因细胞系对PRRSV型病毒的抑制作用(图5)。步骤(4)抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中目标插入基因检测4-1抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中GFP和Neomycinlr插入片段的检测以转基因细胞系为材料抽提细胞基因组(模板)，分别设计GFP引物(1400bp)和Neomycinlr引物序列2000bp)进行PCR扩增。PCR扩增的条件为94°C预变性5分钟，再以94°C/45sec，55°C/45sec，72°C/3min，共35个循环，最后72°C延长10分钟。可从转基因细胞系的基因组中扩增获得GFP基因和Neomycinlr基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中(图6)。4-2抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞cDNA中GFP和Neomycinlr插入片段的检测以转基因细胞系为材料抽提细胞RNA进行反转录合成cDNA (模板)，分别设计GFP引物(1400bp)和Neomycinlr引物序列2000bp)进行PCR扩增。PCR扩增的条件为94°C预变性5分钟，再以94°C/45sec，55°C/45sec，72°C/3min，共35个循环，最后72°C延长10分钟。可从转基因细胞系的cDNA中扩增获得GFP基因和Neomycinlr基因，表明该两基因分别被重组到猪基因组中(图7)。4-3抗猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞基因组中shRNA插入片段的检测以转基因细胞系为材料抽提基因组，设计shRNA PCR扩增引物序列( 310bp )F AAGTAACAAAACTTTTATCG 和 R :ATTCCTTCATATTTGCATA。该扩增序列包含载体序列 LTR、shRNA(6e)和U6启动子的序列。转基因细胞系可从基因组中扩增获得shRNA基因(图8)。
本发明的有益效果如下利用RNA干扰技术，建立一种能有效抑制猪蓝耳病靶向基因增殖的转基因细胞系，为从遗传的角度根除猪蓝耳病病毒的感染提供理论依据和试验基础。减少养猪的疫病控制成本，为生命科学研究提供科学依据，同时，利用转基因技术，转基因细胞系的建立从育种的角度为开辟控制猪蓝耳病病毒感染和减少其危害的技术奠定基础，是未来的重要发展趋势。
图I是含PRRSV-0RF6e_shRNA表达质粒转染Marc-145细胞24 h后的荧光观察图(100 μm)；左图代表含shRNA的重组质粒转染Marc-145细胞荧光蛋白表达情况；右图代表对照组Marc-145细胞。图2是pSIREN-shRNA抗病毒能力检测图；图中Control代表对照，即未经RNA干扰载体转染；5b 5e、6a 6e分别代表用于转染的RNA干扰载体含有PRRSV_0RF5b\5c\5d\5e和PRRSV-0RF6a\6b\6c\6d\6e shRNA 序列。图3转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建示意图。图4具有抑制PRRSV增殖能力的转基因细胞系；上图左(50μ m)为转基因重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0_shRNA 转染Marc-145细胞后采用G418筛选10日的细胞；上图右(IOOym)S :Marc_145细胞转染后继续通过G418筛选30天，观察到阳性细胞单克隆化形成的单个细胞岛；下图(100 μ m)为将上述单克隆细胞逐步扩大培养筛选得到的形态和活力都较好的单克隆细胞株。图5是转基因细胞系抑制PRRSV增殖效果图；对照(Control),即未经RNA干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒
表达量；Xl-Bac II -FRT-EGFP-NEO-N:阳性对照，即经Xl-Bac II -FRT-EGFP-NEO-N 阳性干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒表达量；Xl-Bac II -FRT-EGFP-NE0_6e:经 Xl-Bac II -FRT-EGFP-NE0_6e 干扰载体转染的Marc-145细胞PRRSV攻毒后的病毒表达量。图6转基因细胞系基因组中扩增获得GFP和Neomycinlr基因序列。
图7转基因细胞系cDNA中扩增获得GFP和Neomycinlr基因序列。图8转基因细胞系基因组中扩增犾得shRNA基因序列；6e代表含PRRSV-0RF6e-shRNA转基因细胞系扩增获得shRNA基因序列310bp);阴代表模板米用对照细胞系；H20代表PCR反应体系中添加水，不加模板；阳代表以转基因重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA为模板；M代表DNA分子量标记。
具体实施例方式实施例I、针对猪蓝耳病病毒的增殖和复制的靶向基因shRNA的设计、合成、载体构建根据PRRSV-0RF5和PRRSV-0RF6蛋白基因的结构序列和shRNA序列设计原则，分别针对PRRSV-0RF5和PRRSV-0RF6各设计了 5对shRNA序列；这10对shRNA序列具体如下表I和表2所述表 I、针对 PRRSV-0RF5 的 shRNA 设计
权利要求
1.重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA的构建方法，其特征在于包括以下步骤 1)、设计靶向基因shRNA0RF6_6e 5’-gatccGCCATAGAAACCTGGAAGTTTCAAGAGAACTTCCAGGTTTCTATGGCTTTTTTg-----3’3’-----gCGGTATCTTTGGACCTTCAAAGTTCTCTTGAAGGTCCAAAGATACCGAAAAAActtaa-5’ ； 2)、构建重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将0RF6_6e所述的shRNA酶切(EcoRI-BamHI )连接到pMD18-T Simple载体上，并通过BglII-EcoRV酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上，构建了重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA。
2.靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，其特征在于设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。
3.根据权利要求2所述的转基因细胞系的构建方法，其特征在于利用重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA进行细胞转染，包括以下步骤 将重组载体 PXL-BAC2-FRT-EGFP-NE0-shRNA 用 lipofectin2000 转染试剂转染Marc-145 细胞； 到细胞增长接近汇合时按I :10密度传代，继续培养；培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基； 待细胞密度增至50% 70%汇合时，加入G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基，每3飞天更换一次G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基；当有超过80%的细胞死亡时，改用G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基维持筛选，每3 5天更换一次G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基，筛选10 14天后，有抗性的克隆细胞出现，改用含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基进行培养，待克隆细胞逐渐增大后，将克隆细胞经胰酶消化后利用有限稀释法筛选阳性细胞单克隆；从而获得靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系； 上述培养和筛选的条件均为于37°C，5% CO2培养箱中培养； G418浓度为120(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为120(^g/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基； G418浓度为60(^g/ml的筛选培养基的制备方法为培养基中加入G418直至G418的浓度为60(^g/ml，该培养基为含有10%胎牛血清的DMEM基本培养基。
4.根据权利要求2或3所述方法构建而得的靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的用途，其特征是对PRRSV型病毒具有抑制作用。
全文摘要
本发明公开了一种靶向基因shRNA干扰猪蓝耳病病毒增殖的转基因细胞系的构建方法，设计能有效阻止猪蓝耳病病毒增殖和复制的靶向基因shRNA，并通过转座子载体插入供体细胞的基因组，从而获得能有效阻止蓝耳病病毒感染的克隆细胞系。本发明还同时公开了重组载体PXL-BAC2-FRT-EGFP-NEO-shRNA的构建方法，包括设计靶向基因shRNA--ORF6-6e，通过PCR扩增zsGFP和NEO片段，将ORF6-6e的shRNA酶切连接到pMD18-T Simple载体上，并通过酶切，回收、连接到PXL-BAC2载体上。本发明还同时公开了该转基因细胞系的用途对PRRSV型病毒具有抑制作用。
文档编号A61P31/14GK102876699SQ201210365489
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者缪云根, 周芳 申请人:浙江大学