专利名称：Chang Liver细胞作为具有肝功能的细胞源的医学应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和医药领域,具体涉及Chang Liver细胞的肝细胞功能研究，及其在体外培养增殖后在肝细胞移植和治疗急性肝功能衰竭中的应用。
背景技术：
急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)死亡率很高，目前可根治急性肝衰竭的唯一方法是肝移植。但供肝的数量远远不能满足患者的需求，很多急性肝衰竭患者在等待肝移植的过程中死亡。除肝移植外，急性肝衰竭尚有两种有效治疗方法，即肝细胞移植和生物人工肝。用人源性肝细胞充填的生物人工肝是治疗急性肝衰竭的一种最有效的方法，可有效降低急性肝功能衰竭死亡率，可作为肝移植前的一种过渡性治疗。肝细胞移植可以明显降低急性肝功能衰竭死亡率，促进病肝再生和恢复，也可作为肝移植的过渡疗法。肝细胞移植和生物人工肝都需要大量的肝细胞，但目前原代肝细胞的来源很困难，主要是可供分离肝细胞的肝脏来源不足，且原代肝细胞体外培养增殖极为困难。其他的一些可用细胞系，如干细胞、永生化肝细胞、异种肝细胞等，都有或多或少的不足，如永生化肝细胞潜在的致瘤危险性，异种肝细胞强烈的排异反应，有关干细胞的研究尚不充分等。Chang Liver细胞系，是上世纪80年代由国内学者自行建系的细胞系,其体外培养容易，来源方便，目前多作为许多实验的对照组细胞。但Chang Liver细胞系是否具有肝细胞相关功能及是否能应用于肝细胞移植和生物人工肝，目前国内外文献中尚无报道。
发明内容
本发明的目的是对Chang Liver细胞系进行肝细胞功能研究，并将其应用于肝细胞移植，研究其治疗急性肝功能衰竭的效果，旨在提供一种新型可用、功能稳定、来源充足的具有良好肝功能的细胞系来源。本发明的技术方案是本发明选择了目前国内应用较多且来源方便、经无限繁代的Chang Liver细胞系，对其进行肝细胞功能研究。将Chang Liver细胞解冻后进行培养增殖，其贴壁后增殖迅速，传代周期较稳定，以新生牛血清培养2至3天即可传代，可完全满足实验的需求。对ChangLiver细胞进行肝细胞功能检测发现，Chang Liver细胞表达多种肝细胞特异性因子,包括白蛋白、胆红素葡糖醛酸基转移酶、细胞色素酶P450和转氨酶等，表明其具有确切的肝细胞功能。为进一步验证Chang Liver细胞对于急性肝衰竭的治疗作用,本发明人选择了大鼠90%肝切除诱导的急性肝衰竭模型。实验中发现，实验组大鼠肝切除术后存活时间明显长于对照组，实验组大鼠30天存活率达到40%以上，而对照组大鼠均于术后72h内死亡，其差异具有统计学意义(P〈0. 01)。对存活30天大鼠进行开腹观察可见明显肝脏再生。同时抽血检测肝功能指标，证实Chang Liver细胞能有效改善肝功能。本发明的优点(I)本发明所用的细胞系Chang Liver细胞系来源方便，且易在体外大量培养增殖，适合临床推广。(2)本发明证明Chang Liver细胞具有良好的肝细胞功能，可以作为良好的人源肝细胞替代来源，用于在治疗急慢性肝功能衰竭中的应用，为Chang Liver细胞在医学实验研究上的应用奠定了基础。
图1 : SD大鼠肝脏解剖图。图2 :显微镜下观察Chang Liver细胞(X 100)。图3 =RT-PCR检测Chang Liver细胞肝细胞相关因子的表达。从上至下依次为白蛋白(ALB)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、人凝血因子-X (HBCF-X)及内参GAPDH。图4 :Western_blot检测Chang Liver肝细胞功能分子的表达。从上至下依次为白蛋白(ALB)、细胞色素酶P450 (CYP3A4)、葡糖醛酸基转移酶(UGT)及内参P-actin。图5:Chang Liver细胞免疫荧光染色，FITC标记白蛋白(ALB)、TRITC标记细胞色素酶P450 (CYP)和葡糖醛酸基转移酶(UGT)，激光共聚焦显微镜下观察其分泌情况。图A、图B分别为40倍及100倍下观察所见，肝细胞质染成绿色颗粒状。图C、D为100倍下所见，肝细胞质染成橘黄色颗粒状。E中蓝色为DAPI所染胞核。F为阴性对照，胞质内见荧光颗粒表达。图6 :Chang Liver移植、90%肝切除后分别测定并计算各组大鼠的存活率、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、总胆红素、直接胆红素及碱性磷酸酶水平。其中Gl为对照组，G2为移植Chang Liver细胞的实验组。图7 :裸鼠细胞种植后4周结果。
具体实施例方式为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。实施例1 Chang Liver细胞的肝细胞功能检测(一)细胞培养-80°C取出事先冻存的Chang Liver细胞,Chang Liver细胞购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，37°C水浴摇晃Imin使之溶解，加入15mL离心管中，同时加入少量MEM培养基以去除DMSO的影响，1200rpm/min离心3min，去上清，加入4mLMEM培养基，重悬细胞后投入T25细胞培养瓶中，置于37°C 5% C02培养箱中。每隔24h换液一次，大约3天左右细胞长到80% 90%融合后，按1:3比例传代，待细胞扩增到足够数量后进行后续实验。在显微镜下观察细胞(X100)，发现细胞解冻后12h内即可贴壁，24h后观察细胞，间细胞生长较密集，呈多边形，胞质丰富，其内可见一个或多个细胞核，核仁清晰(见图2)。(二)RT-PCR检测相关基因的表达1. Chang Liver 细胞 mRNA 的提取DDEPC ImL加入999mL双蒸水 中制备DEPC水，留下部分作为后续实验所用，余下用来浸泡实验器具，以去除RNA酶影响。
2)弃去T25培养瓶中的培养基，加入约2mL TransZol (约10cm2加ImL TransZol)，使细胞裂解，裂解的同时用枪头反复吹吸数次，室温孵育5min后转入Ep管。3)加入0. 4mL氯仿(每ImL TransZol加0. 2mL氯仿)，剧烈震荡15s，室温放置3min。dOOOOg/mimfC离心15min。此时可见Ep内液体分3层，其中RNA位于最上层水相中。5)转上层水相至一新的Ep管中，加入ImL异丙醇(ImL TransZol加500 ii L异丙醇)，充分混匀后室温放置lOmin。6) 10000g/min，4°C离心lOmin，去上清，可见于Ep管底和管侧形成胶样沉淀。7)加入2mL由DEPC水配制而成的75%乙醇，每ImL TransZol至少加ImL乙醇，剧烈涡旋振荡。8) 7500g,4°C离心 5min。9)去上清，超净工作台开风机干燥约5min，但不能完全干燥。10)加入100 u L RNA溶解液以使沉淀溶解。11)55°C 60°C孵育lOmin，立即保存RNA样本于-70°C或立即用于逆转录。
2.逆转录合成cDNA I)于0.2mL Ep管中依次加入以下试剂(20 ii L体系)
权利要求
1.Chang Liver细胞用于作为肝细胞移植的细胞源的应用。
2.Chang Liver细胞用于作为生物人工肝的细胞源的应用。
3.按权利要求1或2所述的ChangLiver细胞在治疗急性肝功能衰竭疾病上的应用。
4.按权利要求1或2所述的ChangLiver细胞在治疗其他肝功能衰竭疾病上的应用。
全文摘要
本发明对肝肿瘤细胞系Chang Liver细胞系进行了肝细胞功能研究，并将其应用于肝细胞移植。研究发现Chang Liver细胞具有良好的肝细胞功能，能够表达多种肝细胞特异性因子，包括白蛋白、胆红素葡糖醛酸基转移酶、转氨酶等。大鼠90%肝切除诱导的急性肝衰竭模型实验表明，Chang Liver细胞能有效延长急性肝衰竭大鼠的存活时间，可成为生物人工肝较好的细胞来源，用于治疗急性肝功能衰竭。
文档编号A61P1/16GK103055349SQ20121039140
公开日2013年4月24日 申请日期2012年10月15日 优先权日2012年10月15日
发明者周平, 杨涛, 张利民 申请人:华中科技大学同济医学院附属同济医院