一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
【专利摘要】本发明涉及生物领域，公开了一种具有抗凝活性的菲牛蛭素多肽及含该多肽的临床制剂。本发明所述菲牛蛭素多肽的氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示。本发明还提供所述菲牛蛭素活性肽的制备方法与用途。
【专利说明】一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途。
【背景技术】
[0002]水蛭素(hirudin)是由60多个氨基酸组成的小分子量蛋白质，相对分子量为7kDa左右，是迄今为止发现的最强的凝血酶特异性抑制剂。天然水蛭素最早是从欧洲医蛭唾液腺中分离出来的，至少有20多种突变体，其中由全身提取的水蛭素称为HV1，由头部提取的水蛭素称为HV2，二者氨基酸序列同源性为86%。
[0003]天然水蛭素的N端由疏水性氨基酸组成，3个二硫键组成稳定的构象。C端富含带负电荷的酸性氨基酸残基，可与凝血酶的正电荷部位结合，以静电作用阻止凝血酶与纤维蛋白原的识别位点结合。中间部位的Pro46-Lys47-Pro48与凝血酶的Arg环结合,是水蛭素与凝血酶结合的催化位点。此外，63位Try残基的硫酸化提高了它与凝血酶的结合能力，增强了水蛭素抗凝血作用的特异性。
[0004]由于医蛭食性较 杂，人们逐渐把注意力转向以哺乳动物为主要吸血对象的东南亚菲牛蛭(Hirudinariamanillensis),希望获得更适合人类的抗凝血物质。1992年Steiner等首次从产自马尼拉的菲牛蛭中提取了 2种水蛭素。1993年Scacheri等从菲牛蛭中分离出了 2种水蛭素变异体(菲牛蛭素HMl和HM2)，并测定其氨基酸序列，cDNA克隆和表达，表达产物有抗凝活性。菲牛蛭素(HMl及HM2)的活性与医蛭来源的水蛭素(HVl及HV2)相似，但是二者同源性低于60%，且前者不存在硫酸化位点。
[0005]由于水蛭来源有限，从医蛭中提取天然水蛭素满足不了临床的大量需求，继续寻求大量合成具有抗凝活性的多肽的解决方案。
【发明内容】
[0006]本发明以我国广西菲牛蛭为原材料，通过基因重组的方法扩增菲牛蛭素基因片段，并在大肠杆菌表达系统中进行活性表达，采用中国药典的凝血酶滴定法测定本发明所述菲牛蛭素活性肽的抗凝血活性，活性高达20080ATU/g。
[0007]本发明提供的菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0008]本发明还提供编码所述菲牛蛭素活性肽的基因。优选地，所述基因核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示。
[0009]本发明的另一个目的是提供所述菲牛蛭素活性肽的制备方法。
[0010]在【具体实施方式】中，本发明所述的制备方法包含以下步骤:
[0011]步骤1:以编码所述菲牛蛭素活性肽的CDNA为模板，设计引物进行PCR扩增，上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如SEQ IDN0.4所示；
[0012]步骤2:对扩增产物与质粒进行重组构建原核表达载体；将所得原核表达载体转入宿主细胞E.coliBL21 (DE3)进行蛋白表达；[0013]步骤3:收集菌体，离心弃沉淀，收上清；向上清中加硫酸铵达硫酸铵饱和度，静置后离心弃上清，取沉淀用pH 7.4PBS溶解；
[0014]步骤4:将步骤3所得溶解液超滤除杂，用0.1M NaCl溶液洗膜，收集穿过液；穿过液用G-25柱脱盐，收集层析图谱中第一个吸收峰，即得。
[0015]所述模板核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述PCR扩增反应条件为:95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s, 30 次；72°C IOmin0
[0016]作为优选，所述质粒为Pet22b。更优选地,步骤2所述蛋白表达经IPTG诱导。
[0017]作为优选，所述超滤为用0.45 μ m醋酸纤维滤膜过滤后，用30kDa超滤管，于4°C、4000rpm超滤。在本发明的【具体实施方式】中，是将溶解上清液用13000g离心10min,收上清，用0.45 μ μ m醋酸纤维滤膜过滤上清；后用30kDa MilliPore超滤管，于4?, 4000rpm超滤。
[0018]本发明还提供所述菲牛蛭素活性肽在制备抗凝药物中的用途。
[0019]本发明还提供临床制剂，包括所述的菲牛蛭素活性肽及药学上可接受的辅料。
[0020]所述的临床制剂包括口服制剂或注射制剂，口服制剂优选为胶囊剂或片剂、颗粒剂；注射制剂优选为注射液或冻干粉针剂。
[0021]发明人经过大量实验发现，含有pET22b质粒的大肠杆菌的对照组诱导后的培养基组分和破碎细胞的上清液没有或者几乎没有活性。而含有4种异构体的重组大肠杆菌的培养基组分和破碎细胞的上清液均表现出不同程度的抗凝血活性，4种异构体的氨基酸序列，两两比较仅有一个氨基酸序列存在差异。含有pET22b-HMb-l重组质粒的重组大肠杆菌诱导后的培养基组分呈现出最高的抗凝血活性，为300ATU/mL。而采用中国药典的凝血酶滴定法对该培养基组分中的菲牛蛭素活性肽(I峰)的抗凝血活性进行测定，活性高达20080ATU/g,较之天然菲牛蛭素干粉`活性1300ATU/g。
[0022]动物实验显示，白兔灌胃给予本发明所述菲牛蛭素活性肽FNZ后，于给药前及给药后不同时间点采血，观察FNZ的抗凝效应。结果表明，口服4mg/kg剂量本发明所述菲牛蛭素活性肽FNZ能显著延长TT、APTT，但对PT无延长作用，说明FNZ主要作用于内源性凝血通路，而对外源性凝血通路无作用。FNZ对TT的延长时间较短，量效关系的线性范围较窄，而FNZ对APTT延长时间较长且线性范围较宽。以上结果说明本发明所述菲牛蛭素活性肽FNZ在体内具有抗凝活性，具有良好的临床应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明所述质粒载体的构建过程；
[0024]图2为pET22b-HMb_l诱导表达结果；其中M:marker (红箭头表示为7.8kDa)；I:pET22b-HMb-l-l 诱导前全菌；2:pET22b-HMb-l-l 诱导后全菌；3:pET22b-HMb-l-l 诱导后破碎上清；4:pET22b-HMb-l-l诱导后破碎沉淀；5:pET22b-HMb-l-2诱导前全菌；6:pET22b-HMb-l-2 诱导后全菌；7:pET22b-HMb-l-2 诱导后破碎上清；8:pET22b-HMb-l-2 诱
导后破碎沉淀。
[0025]图3为菲牛蛭素G-25柱脱盐处理层析图谱；
[0026]图4为口服不同剂量FNZ对兔PT延长的时-效曲线；
[0027]图5为口服不同剂量FNZ对兔APTT延长的时-效曲线；[0028]图6为口服不同剂量FNZ对兔TT延长的时-效曲线。
【具体实施方式】
[0029]本发明公开了一种抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的产品、方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0030]为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0031]实施例1 =RT-PCR扩增菲牛蛭素基因片段
[0032]取广西菲牛蛭活体，切取菲牛蛭头部组织(大约l_2cm),采用TRIzol( Invitrogen)法提取组织的总RNA。以提取的总RNA为模板，首先进行反转录得到cDNA。设计上游引物Hmgx up (如 SEQ ID N0.3 所示)(ATGTTCTCTCTCAAGTTGTTCG)和下游引物 Hmgxdn (如 SEQID N0.4所示)(TTAATTCAATATATCTTCATCTGGG),以cDNA为模板，PCR扩增菲牛蛭素基因，反应条件为:95°C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s (30 次)；72°C IOmin0 扩增产物如 SEQID N0.2 所示。
[0033]实施例2:表达质粒构建
[0034]对实施例1所得基因进行改造，上游加上起始密码子ATG，且带有Msc I识别位点，下游带有Xho I识别位点。为了避免重组表达过程中引入的序列对菲牛蛭素活性的影响，所以在构建表达载体时均未加任何标签，同时去除菲牛蛭素自身的信号肽系列。基因片段采用限制性内切酶Msc I和Xho I·双酶切，同样的质粒Pet22b采用相同的限制性内切酶进行双酶切，T4连接酶连接线性化质粒和基因片段，得到pet22b-hmb-l，载体构建过程如图1。
[0035]实施例3:蛋白表达纯化和检测
[0036]3.1蛋白表达
[0037]构建好的菲牛蛭素原核表达载体pET22b_HM转化BL21 (DE3)，并进行诱导表达。诱导条件为0.5mM IPTG，37°C 5h。诱导表达的电泳结果见下图2，诱导后均未见明显目的条带。活性测定发现，培养基组分的活性为300ATU/mL。培养基组分的抗凝血活性要比破碎细胞上清液的抗凝血活性高，推测可能菲牛蛭素分子量较小，大部分被分泌到培养基中。
[0038]将RT-PCR产物切胶回收，连接T载体，挑取不同的转化子进行测序，筛选不同的异构体。挑取10个转化子，最终得到4种异构体(HMb-l，HMb-2，HMb-3，HMb-4)。比较这4种异构体的氨基酸序列，可以看出，两两比较仅有一个氨基酸序列存在差异。
[0039]参照实施例1，分别以4种异构体的基因为模板，进行PCR扩增，反应条件为950C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s(30 次)；72°C IOmin0 酶切后连接载体 pET22b，得到重组子 pET22b-HMb-l、pET22b-HMb-2、pET22b-HMb_3、pET22b-HMb_4。
[0040]由于重组菲牛蛭素的表达量相对较低，无法通过电泳检测到，而且考虑到天然的菲牛蛭素的含量也相对较少，而活性并不低的现象，所以对重组菌的不同组分进行凝血酶抗凝功能验证，以确定菲牛蛭素是否成功表达并且定位重组多肽。
[0041]样品为含有pET22b 质粒以及含有 pET22b-HMb_l、pET22b-HMb_2、pET22b-HMb_3、pET22b-HMb-4重组质粒的重组大肠杆菌诱导前后的培养基组分和破碎细胞的上清液。重组菲牛蛭素的活性测定采用中国药典的凝血酶滴定法测定。天然的菲牛蛭素干粉活性为1300ATU/g，重组菌的活性数据见表1。
[0042]表1重组菲牛蛭素凝血酶抗凝功能验证
[0043]
【权利要求】
1.一种菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的基因。
3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.权利要求1所述的菲牛蛭素活性肽的制备方法。
5.根据权利要求4所述的制备方法，包含以下步骤: 步骤1:以编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的cDNA为模板，优选模板的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示；设计引物进行PCR扩增，上游引物如SEQ ID N0.3所示，下游引物如 SEQ ID N0.4 所示； 步骤2:对扩增产物与质粒优选质粒Pet22b进行重组构建原核表达载体；将所得原核表达载体转入宿主细胞E.coli BL21 (DE3)进行蛋白表达优选经IPTG诱导； 步骤3:收集菌体，离心弃沉淀，收上清；向上清中加硫酸铵达硫酸铵浓度65-80%，静置后离心弃上清，取沉淀用pH 7.4PBS溶解； 步骤4:将步骤3所得溶解液超滤除杂，用0.1M NaCl溶液洗膜，收集穿过液；穿过液用G-25柱脱盐，收集层析图谱中第一个吸收峰，即得。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为:950C 5min ；94°C 30s, 55°C 60s, 72°C 45s, 30 次；72°C IOmin0
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超滤为用0.45 μ m醋酸纤维滤膜过滤后，用30kDa超滤管,于·4°C、4000rpm进行超滤。
8.临床制剂，包括权利要求1所述的菲牛蛭素活性肽及药学上可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的临床制剂，其特征在于，其为口服制剂或注射制剂，口服制剂优选为胶囊剂或片剂、颗粒剂；注射制剂优选为注射液或冻干粉针剂。
10.权利要求1所述菲牛蛭素活性肽在制备抗凝药物中的用途。
【文档编号】A61K38/58GK103848914SQ201210504718
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2012年11月29日 优先权日:2012年11月29日
【发明者】贾继明, 王宏涛, 赵韶华, 郑春杨, 张会欣, 鲍蓬, 冯建敏, 姜新刚, 王海荣 申请人:河北以岭医药研究院有限公司