专利名称：一种提高肝片吸虫Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保护率的方法
技术领域：
本发明涉及一种提高抗肝片吸虫FhCat LI DNA疫苗免疫保护率的方法。具体涉及利用树突状细胞(DC)表面分子DEC-205的单链抗体SCFVNU)e_145靶向DC细胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI基因的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高抗肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率。
背景技术：
肝片吸虫是一种寄生性蠕虫，能引起牛、羊等反刍动物及人的严重吸虫病[I]。在世界范围内，肝片吸虫病直接影响着畜牧业的发展和人类健康，据估计每年可造成约20亿美元的经济损失[2]，是一种不可忽视的重要人畜共患寄生虫病。对此病的防治一般采用三氯苯咪唑等化学药物，但这些药物只对早期的未成熟虫体或成虫具有良好效果，对感染后期的治疗不佳。最近发现，家畜已对三氯苯咪唑等化学药物产生耐药性[3-5]。同时，人们对畜产品中化学药物残留量的要求也越来越严格，这给利用化学药物控制吸虫病带来极大困难。因此，防治吸虫病急切需要一种能替代化学药物的治疗方法，这就给疫苗发展带来了良好契机[6]。事实上，到目前为止，有很多肝片吸虫的疫苗候选分子如谷胱甘肽S转移酶(GST)，亮氨酸氨肽酶(LAP)，脂肪酸结合蛋白(FABP)及组织蛋白酶L (Cat L)被用于开发诸如重组蛋白疫苗及DNA疫苗，虽然这些疫苗能在实验动物和大动物上产生一定的免疫保护[7，8]，但至今仍没有一种商品化疫苗能投入到临床生产，这在很大程度上受制于疫苗的保护率低下的现状，而这种现状与如何提高抗原的呈递有着密切的关系[9-12]。理想的疫苗应能够刺激机体产生特异性的免疫反应，并能诱导长期持久的免疫记忆以保护机体免受疾病侵袭。作为一种成 功的疫苗，其抗原可被抗原提呈细胞(antigen presentingcells，APC)所提呈，并激活机体免疫系统引起抗原特异性免疫反应。树突状细胞(DC)是已知体内最强的专职抗原提呈细胞，其最大的特点是能够刺激初始T细胞增殖和启动机体免疫反应。单链抗体是一种分子量小，穿透力强，可避免非特异性细胞毒性及免疫原性，目前被认为是最为理想的具有体内特异性导向作用的载体片段[13，14]。DEC205作为小鼠DC表面特异性标志，DEC205抗体NLDC-145具有特异靶向DC的作用，是体内DC修饰的理想载体。所以抗DEC205的单链抗体可将特定抗原定向呈递给DC，激活初始免疫细胞，使抗原提呈给T细胞，引起有效的抗原特异性免疫反应。组织蛋白酶L是一种半胱氨酸蛋白酶，通常情况下这种酶以非活性状态存在于分泌囊泡的肠上皮细胞中[15，16]，当前体酶活化并被释放后，寄生虫即可利用活化的组织蛋白酶行使多种重要的功能，如能在肝脏中将蛋白分解为多肽从而利于营养的吸收、降解基质蛋白从而有利于寄生虫从肠道迁移到肝脏[17，18]。研究还表明，组织蛋白酶L还在免疫逃避和免疫调节中发挥重要作用。它可分解宿主的免疫球蛋白从而破坏宿主的免疫攻击，并能介导和调节巨噬细胞的活性、抑制Thl免疫反应[19-21]。
目前，对肝片吸虫组织蛋白酶L的疫苗开发主要集中在重组蛋白疫苗和DNA疫苗的研究上。有研究表明重组肝片吸虫组织蛋白酶L具有与天然蛋白相似的功能[22]，且在荷斯坦牛身上免疫后获得了 48.2%的减虫率和显著升高的总IgG [23]。在DNA疫苗的研究中，肝片吸虫Cat L DNA疫苗免疫大鼠能获得70%的免疫保护[24]。然而，要想开发出高效率的抗肝片吸虫的疫苗，这样的免疫保护率仍显不足。因此，如何提高疫苗的保护率就成了目前疫苗开发的热点。本发明正是着眼于提高肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率，从提高其抗原在树突状细胞中的呈递作用入手，利用树突状细胞(DC)的表面分子DEC-205的单链抗体ScFvm45能靶向DC细胞的重要作用机理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI基因的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高肝片吸虫Cat LI DNA疫苗的免疫保护率。
发明内容
针对肝片吸虫疫苗保护率和疫苗抗原呈递效率低下的现状，本发明主要着眼于提供一种利用DC特异性单链抗体提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI )DNA疫苗免疫保护率的新方法，用于指导抗肝片吸虫DNA疫苗的研发。本发明采取的技术方案是:一种提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI)免疫保护率的方法，所述方法包括以下步骤:1.运用反转录聚合酶链 式反应(RT-PCR)扩增目的基因，将扩增得到的Cat LI基因回收后连接入PMD18-T载体，得到pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)；2.利用大肠杆菌工程菌(Escherichia coli)和真核细胞Cos7表达目的蛋白；3.Cat LI多克隆抗体的制备；4.纯化和鉴定目的蛋白；5.设计合成单链抗体scF/.145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1):用单链抗体片断ScFvm45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF,同时合成SF的i sotype序列；6.构建并鉴定编码ScFVNU)G_145及目的蛋白的真核表达质粒:将pVAXl和合成的SF进行体外连接后转化大肠杆菌T0P10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒pVAXl- SF及步骤I中获得的pMD-Cat LI分别用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到感受态细胞JM109中，提取质粒并进行测序鉴定后获得阳性 pVAXl-SF- Cat LI 重组质粒(SEQ ID N0.3)；7.动物免疫及感染试验；8.动物体液及细胞免疫评价；9.免疫保护率评价。本发明利用树突状细胞(DC)的表面分子的DEC-205的单链抗体scFv 45靶向DC细胞，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高FhCat LI的DNA疫苗的免疫保护率，其优点在于:1、与非DC靶向DNA疫苗相比，所采用的DC特异性单链抗体能靶向DC细胞，可特异性提高抗原的呈递效率，从而提高免疫保护率(83.1%)。2、采用的骨架质粒pVAXl为真核表达质粒pcDNA3.1的升级构件，具有更多的技术优势。3、pVAXl-SF-Cat LI质粒免疫后获得的免疫保护率显著高于对照组，且获得了较pcDNA-Cat LI疫苗(36.3%)高的免疫保护率，也较别的学者以Cat LI为抗原研究的DNA疫苗保护率(70%)高。本发明技术具有针对性强、效率高、易于操作、效果明显等特点。该技术为肝片吸虫DNA疫苗的开发提供了一种新的方法，适宜在其他肝片吸虫候选疫苗分子上引申应用，对抗肝片吸虫疫苗的研发和生产及肝片吸虫病的免疫防控具有重要的指导意义和应用价值。
图1是本发明所构建的疫苗质·粒及其结构。图2 是 pVAXl-SF- Cat LI 质粒及其 isotype 的结构。图中 scDEC 即 SF, targetprotein即Cat LI。DEC-H, DEC-L分别为SF的重链和轻链。图3是单链抗体ScFvnK45的核苷酸序列组成(SEQ ID N0.1)。加粗斜体分别为CACC接头序列和BamH I酶切位点；下划线为序列的信号肽SP，该序列广泛应用于真核表达系统，可促进目的基因表达；斜体下划线序列为Linker (G4S)3 ；Linker前为重链VH，后为轻链VL (见图2)。图4是PCR检测scFVNU)e_145，Cat LI及二者连接后的质粒正确性。A为Cat LlPCR电泳图，目标长度为720bp。B为ScFvnldc-145PCR电泳图，目标长度为819bp。C为scFv.145连接Cat LI后PCR电泳图，目标长度为1539bp。图5中A是pET32a_Cat LI在大肠杆菌中的表达结果。M为蛋白标准分子量。1，pET32a- Cat LI阳性质粒在BL21 (DE3)感受态细胞中的表达，所用条件是37°C 1.0mM IPTG诱导4h。2，pET32a空载体;B是Cat LI蛋白纯化后SDS-PAGE电泳结果。M为蛋白标准分子量。1-4为纯化后蛋白条带。图6 中 A 是 pVAXl-Cat LI 转染 Cos7 细胞后 Western blotting 结果，1-3 为目标蛋白，大小为26.lkD，4为空白对照PVAXI质粒。B是pVAXl-SF转染Cos7细胞后Western blotting结果，1-3为目标蛋白，大小为29.6kD，4为空白对照pVAXl质粒。图1是质粒中目标序列的测序结果(SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3)。图8是大鼠免疫后血清中抗体水平。与pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX1-SF-Cat LI能刺激大鼠产生显著高水平的IgGl。*，#分别代表与pVAXl_SF_Cat LI组相比差异显著和极显著(p〈0.05, p〈0.01)。图9是外周血细胞因子IL4、IL5和IFNy的含量。与pVAXl-Cat LI及pcDNA-CatLI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠产生显著高水平的IL4和IL5。*，林分别代表与pVAX 1-SF-Cat LI组相比差异显著和极显著(ρ〈0.05, ρ〈0.01)。图10是脾细胞增殖反应结果。与pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾细胞显著增殖。*代表与pVAXl_SF_Cat LI组相比差异显著(ρ〈0.05)。图11是疫苗免疫后受囊蝴感染攻击后成活的虫体数量。与pVAXl-Cat LI及pcDNA-Cat LI相比，pVAXl_SF_Cat LI使大鼠中虫体成活数量较pVAXl组显著降低。*代表与pVAXl组相比差异显著(p〈0.05)。
具体实施例方式本发明具体的方法按如下步骤操作:1.运用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增目的基因根据GenBank收录的肝片吸虫Cathepsin LI (登录号AY573569.1)序列(序列ORF总长720bp，蛋白大小26.1KDa)，应用Oligo 5.0设计特异性克隆(Pl，P2)。Pl- 5’CCGGATCCGTA CTG ACT ATT GGA TTGTG 3’，P2-5’ CC GAATTCTCA CGG AM TCG TGC CAC CA3’，在克隆引物P1，P2的上下游分别引入BamH I和EcoR I酶切位点(划线部分)。肝片吸虫Cat LI的总RNA提取采用Trizol试剂盒进行，反转录后进行PCR扩增。反应条件为:95°C预变性 5min，95°C 40s, 55°C 45s，72°C 60s，30 个循环。最后 72°C延伸 lOmin。每次PCR设阳性和空白对照。将扩增得到的Cat LI基因回收后连接入pMD18-T载体(pMD-CatLI )，转化入大肠杆菌感受态细胞JM109中，培养后提取质粒进行初步1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后测序确定序列的正确性。2.利用大肠杆菌工程菌(Escherichia coli)表达和纯化目的蛋白应用Oligo 5.0 设计特异性表达引物Pel, Pe2，Pel_5’ GGGAATTCCATATG GTA CTGACT ATT GGA TTG TG 3’，Pe2~5'~CGG CTCGAG TCA CGG MA TCG TGC CAC CA 3’，并在其上下游分别引入Nde I和Xho I酶切位点(划线部分)。以阳性质粒pMD-Cat LI为模板，用表达引物Pel, Pe2进行扩增，反应条件为:95°C预变性5min，95°C 45s, 56 °C 40s, 72 °C60s, 30个循环。最后72°C延伸lOmin。将扩增得到的带酶切位点的Cat LI基因回收后进行Nde I和Xho I酶切，所得片断与同样经Nde I和Xho I酶切的pET32a载体连接过夜(4°C),构建pET32a- Cat LI表达质粒。转化阳性质粒入BL21 (DE3)感受态细胞，培养后提取质粒进行测序鉴定。选取经PCR鉴定为阳性的质粒转化大肠杆菌后进行体外IPTG诱导表达。当转化后的细菌在37°C生长至0D600nm的浓度为0.6时加入ImM IPTG诱导4小时，将所得细菌6000g离心30min后获取沉淀并称重。然后按lg/5ml His-Tag结合缓冲液的比例加入缓冲液后作用20min，然后用超声波反复作用30次(条件为24KHz，30sec开，30sec关)。将处理后产物于6000g离心30min，取上清，并利用His-Tag融合蛋白纯化试剂盒进行纯化，然后用PBS缓冲液透析24小时后备用。蛋白浓度测定采用Coomasie proteinassay测定。3.Cat LI多克隆抗体的制备将5只6-7周龄雌性SD大鼠分别后腿肌肉注射30 μ g/只的纯化后的Cat LI蛋白，总共进行3次免疫，每次间隔I周，最后I次免疫后I周采血分离血清备用。抗体的浓度测定米用Coomasie protein assay测定。4.Western blotting 鉴定目的蛋白将步骤2中利用His-Tag融合蛋白纯化试剂盒纯化后的蛋白进行SDS_PAGE(30V，Ih)电泳后转至尼龙膜上进行Western blotting鉴定。将膜用15ml I XTBS清洗2次后加入5%脱脂奶粉TBS液封闭未结合蛋白位点。经过2次IXTTBS再清洗后，将尼龙膜抚育在多克隆抗体中lh，用所获得的Cat LI多克隆血清(1:300稀释)，再经2次IXTTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，经2次IXTTBS清洗后加入发光底物Chemi Glow，然后进行成像处理以鉴定蛋白的表达情况。5.设计合成单链抗体ScFvnldg-145的核苷酸序列(SEQ ID N0.1)根据文献[25]报道的单链抗体片断scFv 45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF，同时合成SF的isotype序列。6.质粒 pVAXl- SF-Cat LI 的构建将pVAXl和合成的SF进行体外连接后转化大肠杆菌T0P10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒pVAXl- SF及方法I中获得的pMD-Cat LI分别用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到感受态细胞JM109中，利用质粒提取试剂盒(QIANGEN)提取质粒并进行测序鉴定后获得阳性pVAXl-SF- Cat LI重组质粒。疫苗的设计和构建示意图见图1，2。7.质粒的体外转染及鉴定经过柱分离纯化后的阳性重组子pVAXl-SF-Cat LLpVAXl-1SOSF-Cat LI及pVAXl空质粒，分别用质体介导法转染至70-85%单层Cos7细胞，即准备两个Eppendorf管,在第一管中加入1.25 μ g质粒和500 μ I Opt1-MEM I (invitrogrn)。在第二管中加入2μ IIipofectamine 和 500 μ I Opt1-MEM I jmin后将两管混合并再作用 20min后，将此 1000 μ I混合液与3ml70-85%单层Cos7细胞(含有10%FCS的RMPI1640)混合并孵育5min。将细胞清洗2次后于IlOOg离心lmin，然后再与3mllO%FCS的RMPI1640 37°C孵育48h。收集细胞培养液，12，OOOg离心5min后分别收集上清和细胞沉淀。上清液经离心沉淀后，用所获得的Cat LI多克隆血清(1:300稀释)或SF抗体(1:500)，羊抗鼠IgG (1:5000)发光底物Chemi Glow进行Western Blotting鉴定质粒的表达情况。8.DNA质粒的大量制备将阳性质粒转染至大肠杆菌后接种500ml含有50 μ g/ml氨节西林的LB培养基中，37°C培养16h。将培养物于4°C 6000g离心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500试剂盒说明进行质粒的大量提取。获得的质粒用UV260nm测定其浓度后储存于4°C备用。9.肝片吸虫囊蝴的获取从自然感染肝片吸虫的牛粪便中收集虫卵并置于平皿中于室温孵育18天，然后将虫卵暴露在光线下刺激2h以获取毛蝴。将2只毛蝴感染I只截口土蜗，然后正常饲喂截口土蜗68天。此后即可收集囊蝴。将收集到的囊蝴置于透明玻璃纸，于4°C储存备用。10.动物免疫，感染试验及保护率评估
将70只6-8周龄雌性SD大鼠随机分成7组，每组10只，分别在腿部肌肉注PBS空白对照，40 μ g/ 只 PVAXI 空质粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl- SF, pVAXl-1SOSF-Cat LI,pVAX 1-SF-Cat LI和pcDNA-Cat LI (对照质粒，由实验室保存)质粒，总共进行2次免疫，每次间隔7天。第2次免疫后14天将其中35只大鼠采血I次进行抗体水平测定，同时将其中的35只(每组5只)用作囊蝴感染，每只大鼠经口感染30个囊蝴，在感染后63天即可处死大鼠，根据最后获得的肝片吸虫数量来评估疫苗保护率。11.动物体液免疫评估采用间接ELISA对肝片吸虫特异性IgGl和IgG2a进行测定，即应用本试验pET32a表达载体表达的CatLl蛋白(5mg/ml，50l.! I/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C过夜。然后用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在进行2次TBST洗涤后加入50 μ I/孔的倍比系列稀释的血清(起始浓度1:100)，于4°C孵育过夜。将平板洗涤后加入1:6000稀释的IgGl或1:4000稀释的IgG2a，并于室温孵育2h，然后加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202显色，当出现蓝色时加入50 μ I/孔IMmH2SO4终止反应并于450nm读数OD值。抗体效价的判定标准为:取大于标准差3倍的0.D值所对应的最大稀释度为抗体效价。12.动物细胞免疫评估采用夹心ELISA对肝片吸虫感染引起的外周血中细胞因子水平进行测定，所用试剂均为商品试剂盒。分别于96孔板加入50μ I/孔的捕获抗体(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFN y , 1:250)进行抗体包被，并于4°C过夜。在用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h后分别加入5(^1/孔倍比倍稀释的标准抗体(起始浓度11^4，8叩/1111 ；IL5,10ng/ml ；IFN y , 50ng/ml)及50 μ I/孔的血清样品，并于4°C过夜。洗涤3次后加入生物素标记的抗体(终浓度IL4，IL5，IFN Y I μ g/ml),于室温孵育Ih后加入AMDEX链霉亲和素孵育30min。洗涤3次后加Λ 50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202显色，当出现蓝色时加入50 μ I/孔lMmH2S04终止反应并于450nm读数OD值。13.T细胞增殖试验 于大鼠第二次免疫后14天获取大鼠脾脏，在无菌条件下获取脾单细胞培养物，用红细胞裂解液处理后重悬细胞，以IO6/孔的细胞密度在96孔板上培养脾细胞(培养液为Sigma公司的RPM1-1640)。然后分别加入重组表达的CatLl蛋白(10 μ g/ml)，刀豆蛋白A(ConA, I μ g/ml)进行体外刺激培养。以RPMI基础培养基作为对照组。培养48小时后，力口A 10% Alamar Blue (Invitrogen)后24小时于540nm读取OD值，以此测定T细胞的体外增殖情况。注:所有数据采用Graphpad Prism 4.0软件进行处理,使用ANOVA方法并结合Mann Whitney U test进行分析处理，P < 0.05判为差异显著，P 0.001判为差异极显者。实验例:本发明主要分为两大板块。一是设计并构建实验所需质粒，一是对疫苗免疫大鼠的效果评价。以下将结合附图进行详细阐述:一、设计并构建实验所需质粒首先，为获取候选疫苗基因FhCat LI，将从牛体肝脏中获取的新鲜虫体用于提取mRNA(具体提取方法见QIAGEN mRNA试剂盒)。然后将用RT-PCR方法获取FhCat LI基因的cDNA及所需要的ORF片断，并将其连接到pMD-18克隆载体中，形成pMD-Cat LI质粒，然后进行PCR测序鉴定(见图4)，测序结果见图7 (SEQ ID N0.2)，与预期结果完全吻合。接下来就进行FhCat LI ORF片断的表达，此时可用设计好的引物(Pel，Pe2)以pMD-Cat LI为模板，扩增目标基因片断，构建表达质粒pET32a- Cat LI，经测序等鉴定为阳性质粒后转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)，在37°C和适当浓度IPTG的刺激下获得高度表达的Cat LI蛋白，然后将此蛋白经HiS-Tag柱纯化后透析，最后收获蛋白，蛋白浓度为1.54mg/ml。整个蛋白的表达见图5，其中A为蛋白在ImM IPTG刺激下获得的SDS-PAGE蛋白条带，B为过柱纯化后获得的片断SDS-PAGE蛋白条带，所有条带大小均符合蛋白预期分子量。在运用western blotting方法鉴定此蛋白前,需要获得Cat LI的多克隆抗体,为此，将5只6-7周龄雌性SD大鼠分别后腿肌肉注射30 μ g/只的纯化后的Cat LI蛋白，总共进行3次免疫,每次间隔I周,最后I次免疫后I周采血分离血清用于western blotting。在获得Cat LI的多克隆抗体后，将方法2中利用His-Tag融合蛋白纯化试剂盒纯化后的蛋白进行SDS-PAGE (30V，Ih)电泳后转至尼龙膜上进行Western blotting鉴定。将膜用15ml IXTBS清洗2次后加入5%脱脂奶粉TBS液封闭未结合蛋白位点。经过2次IXTTBS再清洗后，将尼龙膜抚育在多克隆抗体中lh，用所获得的Cat LI多克隆血清(1:300稀释)，再经2次I X TTBS清洗后加入羊抗鼠IgG (1:5000)孵育8h，经2次I X TTBS清洗后加入发和光底物Chemi Glow,然后进行成像处理以鉴定蛋白的表达情况。结合在真核细胞Cos7中的表达(图6A)并进行的Western blotting鉴定,可以确定所获得的目的蛋白为正确的FhCat LI蛋白。然后设计合成单链抗体ScFvm45的核苷酸序列。根据文献报道的单链抗体片断ScFvm45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF,同时合成SF的isotype序列。其中的isotype序列是SF的同形异构体，不具有特异结合DEC205的功能。具体的结构见图3，其中加粗红色斜体分别为CACC接头序列和BamH I酶切位点；下划线为序列的信号肽SP，该序列广泛应用于真核表达系统，可促进目的基因表达；黄色序列为Linker (G4S)3 ；Linker前为重链VH，后为轻链VL (见图2)。合成scFvNLDC-1 45的核苷酸序列后即可构建质粒pVAXl- SF-Cat LI。将pVAXI和合成的SF进行体外连接后 转化大肠杆菌T0P10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒pVAXl- SF及方法I中获得的pMD-Cat LI分别用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物转化到感受态细胞JM109中，利用质粒提取试剂盒(QIANGEN)提取质粒并进行测序鉴定后获得pVAXl-SF- Cat LI阳性质粒。然后PCR鉴定(见图3)，并进行序列测定(见图7 (SEQ ID N0.3))，所得结果证明序列完全正确，获得P VAX 1- SF-Cat LI阳性质粒，与此质粒同时构建的还有其他几个质粒(见图1 )，分别都进行了鉴定后宣告本实验所需要的所有质粒构建完成。接下来要进行动物试验，其前提是要获得足够的质粒，所以进行了 DNA质粒的大量制备方法是将阳性质粒转染至大肠杆菌后接种500ml含有5(^8/!111氨苄西林的1^培养基中，371:培养1611。将培养物于41: 6000g离心30min后收集沉淀，并按照QIAGEN-tip 500试剂盒说明进行质粒的大量提取。获得的质粒用UV260nm测定其浓度后储存于4°C备用。二、对疫苗免疫大鼠的效果评价在获得大量质粒后，需要对大鼠进行免疫，并对免疫效果进行评价。在获得大量肝片吸虫囊蝴后(见方法9)，本试验将将70只6-8周龄雌性SD大鼠随机分成7组，每组10只，分别在腿部肌肉注PBS空白对照，40μ g/只pVAXl空质粒，pVAXl-Cat LI，pVAXl- SF,pVAXl-1SOSF-Cat LLpVAXl-SF-Cat LI 和 pcDNA-Cat LI (对照质粒，由实验室保存)质粒，总共进行2次免疫，每次间隔7天。第2次免疫后14天将其中35只大鼠采血I次进行抗体水平测定，同时将其中的35只(每组5只)用作囊蝴感染，每只大鼠经口感染30个囊蝴，在感染后63天即可处死大鼠，采集血液和脾脏以备实验。在接下来的动物体液免疫评估中，采用间接ELISA对肝片吸虫特异性IgGl和IgG2a进行测定，即应用本试验pET32a表达载体表达的CatLl蛋白(5mg/ml，50 μ I/孔)包被96孔ELISA平板，于4°C过夜。然后用200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育，在进行2次TBST洗涤后加入50μ I/孔的倍比系列稀释的血清(起始浓度1:100)，于4°C孵育过夜。将平板洗涤后加入1:6000稀释的IgGl或1:4000稀释的IgG2a，并于室温孵育2h，然后加入50 μ I/孔的50% ΤΜΒ-50%Η202显色，当出现蓝色时加入50 μ I/孔IMmH2SO4终止反应并于450nm读数OD值。抗体效价的判定标准为:取大于标准差3倍的0.D值所对应的最大稀释度为抗体效价。所得的抗体效价见图8，结果显示pVAXl-SF-Cat LI免疫可刺激机体产生高滴度的I gG I，且 I gG I 的水平较 I gG2a 高。pVAX I 空质粒，pVAX 1-Cat LI，pVAX 1-SF，pVAX 1-1 SOSF-CatLI和pcDNA-Cat LI免疫大鼠后产生的IgGl均显著低于pVAXl-SF-Cat LI，但在IgG2a上，组间无统计学差异。动物细胞免疫评估采用夹心ELISA对肝片吸虫感染引起的外周血中细胞因子水平进行测定，所用试剂均为商品试剂盒。分别于96孔板加入50 μ I/孔的捕获抗体(IL4，1:500 ;IL5，1:500 ；IFNy ,1:250)进行抗体包被，并于 4°C过夜。在用 200 μ I 4%BSA PBS/孔孵育2h后分别加入50 μ I/孔倍比倍稀释的标准抗体(起始浓度IL4，8ng/ml ；IL5, IOng/ml ；IFNy ,50ng/ml)及50 μ I/孔的血清样品，并于4°C过夜。洗涤3次后加入生物素标记的抗体(终浓度IL4，IL5，IFNy I μ g/ml)，于室温孵育Ih后加入AMDEX链霉亲和素孵育30min。洗涤3次后加入50 μ I/孔50% ΤΜΒ-50%Η202显色，当出现蓝色时加入50 μ I/孔IMmH2SO4终止反应并于450nm读数OD值。结果见图9，显示pVAXl-SF-Cat LI能刺激大鼠产生 IL4 和 IL5，且较 pVAXl 空质粒，pVAXl-Cat LI, pVAXl-SF 和 pcDNA-Cat LI 显著增加，而IFNy的规律却与IL4和IL5不同，各组间无明显差异。为进行T细胞增殖试验，于大鼠第二次免疫后14天获取大鼠脾脏，在无菌条件下获取脾单细胞培养物，用红细胞裂解液处理后重悬细胞，以IO6/孔的细胞密度在96孔板上培养脾细胞(培养液为Sigma公司的RPM1-1640)。然后分别加入重组表达的CatLl蛋白(10 μ g/ml),刀豆蛋白A (ConA, I μ g/ml)进行体外刺激培养。以RPMI基础培养基作为对照组。培养48小时后，加入10% Alamar Blue (Invitrogen)后24小时于540nm读取OD值，以此测定T细胞的体外增殖情况。图10表明，与pVAXl-Cat LI及pcDNA- Cat LI相比，pVAX 1-SF-Cat LI能刺激大鼠脾细胞显著增殖。最后，本研究对疫苗的保护效率进行了直观评价，于第2次免疫后14天将将其中的35只(每组5只)用作囊蝴感染，每只大鼠经口感染30个囊蝴，在感染后63天即可处死大鼠，根据最后获得的肝片吸虫数量来评估疫苗保护率。保护率的计算按照(PVAX1空质粒免疫组的虫体数量减去pVAXl-SF-Cat LI或pcDNA-Cat LI免疫组虫体的数量)除以pVAXl空质粒免疫组的虫体数量的百分数来记录。试验结果(见图ll)，pVAXl-SF-Cat LI获得83.1%保护率，而对照组pcDNA-Cat LI却只获得36.3%减 虫率。本发明利用树突状细胞(DC)的表面分子DEC-205的单链抗体SCFVNU)G_145靶向DC细胞，提高了 Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat LI的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高了 FhCat LI DNA疫苗的免疫保护率，且与常用的以pcDNA3.1为骨架且无DC靶向的疫苗(本研究为pcDNA-Cat LI)相比，具有很大的技术优势，可用于我国抗肝片吸虫病DNA疫苗的开发。参考文献:1.Mas-Coma MS, Esteban JGj Bargues MD.Epidemiology of humanfascioliasis: a review and proposed new classification.Bulletin of the WorldHealth Organization 1999，77(4):340 - 6.
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权利要求
1.一种提高肝片吸虫Cat LI (FhCat LI) DNA疫苗免疫保护率的方法，所述方法包括以下步骤: 1)运用反转录聚合酶链式反应RT-PCR扩增目的基因肝片吸虫CatLI，将扩增得到的Cat LI基因回收后连接入pMD18-T载体，获得pMD-Cat LI (SEQ ID N0.2)； 2)利用大肠杆菌工程菌(Escherichiacoli)和真核细胞Cos7表达目的蛋白； 3)制备CatLI多克隆抗体 4)纯化和鉴定目的蛋白 5)设计合成单链抗体ScFvm45的核苷酸序列SEQID N0.1:用单链抗体片断ScFvm45序列，在其5’和3’分别加入CACC碱基和BamH I序列后进行全基因合成，合成片断命名为SF,同时合成SF的i sotype序列； 6)构建并鉴定编码SCFVNU)e_145及目的蛋白的真核表达质粒:将pVAXl和合成的SF进行体外连接后转化大肠杆菌T0P10，然后提取质粒进行鉴定，测序正确的阳性重组质粒P VAX 1- SF及步骤I中获得的pMD-Cat LI分别用BamH I酶切，回收到的目的片段以T4 DNA连接酶连接过夜，连接产物转化 到感受态细胞JM109中，提取质粒并进行测序鉴定后获得PVAXl-SF- Cat LI 阳性质粒，pVAXl- SF-Cat LI 中 SF-Cat LI 序列为 SEQ ID N0.3 ； 7)动物免疫及感染试验； 8)动物体液及细胞免疫评价； 9)免疫保护率评价。
全文摘要
一种提高肝片吸虫Cat L1(FhCat L1)DNA疫苗免疫保护率的方法，所述方法从提高其抗原在树突状细胞中的呈递作用入手，利用树突状细胞(DC)的表面分子的DEC-205的单链抗体scFvNLDC-145能靶向DC细胞的重要作用机理，提高Spragae-Dawley大鼠在免疫编码FhCat L1的DNA疫苗后对肝片吸虫感染的抵抗力，从而提高FhCat L1的DNA疫苗的免疫保护率。
文档编号A61P33/12GK103083684SQ20121050885
公开日2013年5月8日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者罗洪林 申请人:西南大学