专利名称：穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
背景技术：
炎症性肠病是临床上的多发病和难治性疾病，包括克罗恩氏病和溃疡性结肠炎。炎症性肠病经常从青少年时就发病，据报道发病率高达每年Γ10/10万人。而且其终身难愈，后期会发展成各种胃肠道疾病包括肠癌，伴随着较高的死亡率。目前临床上主要通过抗生素抑制肠道菌群，从而对疾病进程进行控制，但在治疗过程缺乏直接有效的治愈手段，而且所用的药物具有强烈的副作用。
炎症性肠病的病因和发病机制不明确，可能的致病原因有环境微生物因素、免疫因素或遗传因素。目前通过外源化学物刺激诱导肠粘膜产生免疫反应建立自肠炎模型，有报道称2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的肠炎模型与人类的克罗恩氏病相似，而硫酸葡聚糖(DSS)诱导的肠炎模型与人类的溃疡性结肠炎相似，故本发明采用TNBS以及DSS来诱导小鼠肠炎模型。喜炎平注射液的主要成份是穿心莲内酯磺化物，其主要用于抗病毒、消炎、抗菌、镇咳及增强免疫力，该注射液是中药制剂，呈淡黄色至橙黄色的澄明液体。具体来说有如下药理作用1、抗病毒对腺病毒IIKADV3)、流感病毒甲1、流感病毒甲I1、流感减毒甲II1、呼吸道道合胞病毒(RSV)等(体外试验)有灭活作用；2、抗菌对革兰氏阳性细菌包括致病性大肠杆菌、伤寒杆菌、肺炎双球菌、流感杆菌、对金黄葡萄球菌、溶血性链球菌、变形杆菌、痢疾杆菌等细菌均有明显的杀灭和抑制作用；3、解热消炎对多种内毒素、肺炎球菌、溶血性链球菌所致的发热有解热作用。其口服300 mg/kg的解热作用与同等剂量的阿司匹林相当。对多种致炎因素如蛋白、组织胺、二甲笨等所致的毛细血管通透性增高、巴豆汕出血性渗出等具有不同程度的对抗作用；4、镇咳舒张气管、支气管平滑肌，缓解平滑肌痉挛，抑制浆液分泌，祛痰镇咳；5、增强机体免疫提高血清白介素水平，增强白细胞和单核巨噬细胞的吞噬能力，提高脾内T、B细胞密度、促进免疫球蛋白形成。其中可以应用于消化科急性肠胃炎、急性细菌性痢疾、急性黄疸型肝炎、腹泻。从现有技术可以获知喜炎平对细菌引起的急性肠胃炎、急性细菌性痢疾有效，但对临床上发病率很高的炎症性肠病即克罗恩氏疾病和溃疡性结肠炎的治疗作用尚未见报道。发明目的本发明提供喜炎平的新用途，即穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。弥补现有技术空白，为老药新用。技术方案
穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用所述的炎症性肠病为克罗恩氏疾病或溃疡性结肠炎。有益效果本发明首次提出穿心莲内酯磺化物在炎症性肠病方面的应用，有非常大的应用前景和商业回报。现有技术只是认为穿心莲内酯磺化物在细菌性引起的肠炎有效。其机理也是因为穿心莲内酯磺化物具有抗菌的作用。但本发明中所述的炎症性肠病与现有细菌性肠炎不同克罗恩氏病的病症包括腹部常感不适或隆起、严重腹泻、抽筋、作呕及大便出血等，病情严重时肠道更会出现纤维化并收窄 ，使患者食欲不振及体重下降。患者的结肠、小肠或胃部会出现发炎、充血或淋巴胀大的迹象。溃疡性结肠炎，病灶局限于结肠粘膜及粘膜下层，多位于乙状结肠和直肠，也可延伸至降结肠，甚至整个结肠。症状有腹泻、腹痛、厌食、发热、消瘦及粪便有血等。这两种疾病发病原因尚不明确，目前都没有很好的根治方法，病人常需长期用药，病情易反复发作，病人的生活质量受到严重干扰，其治疗属世界难题。本发明采用与临床上克罗恩氏病的病理非常相近的TNBS诱导的小鼠结肠炎模型以及与临床上溃疡性结肠炎病理非常相近的DSS诱导的小鼠结肠炎模型，综合运用Western blot、H&E染色及ELISA等方法，考察穿心莲内酯磺化物对克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的治疗效果。实验结果显示经穿心莲内酯磺化物治疗的TNBS模型小鼠体重下降较模型组减慢，结肠组织炎症损伤明显减轻，提示水溶性穿心莲内酯磺化物腹腔注射给药可明显改善小鼠TNBS肠炎，且其疗效明显优于临床常用药地塞米松。同时，实验结果亦显示经穿心莲内酯磺化物治疗的DSS模型小鼠体重下降较模型组减慢，DAI指数降低，结肠组织炎症损伤明显减轻。穿心莲内酯磺化物可剂量依赖性抑制结肠炎小鼠结肠组织中TNF-α，IL-1 β，IL-17，IL-6，IFN-y的分泌，提示穿心莲内酯磺化物腹腔注射给药可明显改善小鼠的溃疡性结肠炎，且其疗效明显优于临床常用药柳氮磺胺吡啶。以上结果表明，穿心莲内酯磺化物可显著改善TNBS和DSS诱导的小鼠结肠炎，提示穿心莲内酯磺化物可用于克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎的治疗。
图1为穿心莲内酯磺化物改善TNBS诱导的小鼠体重降低；各组小鼠直肠推注TNBS造成结肠炎模型,各剂量穿心莲内酯磺化物腹腔注射给药,每天一次,连续3天。每天称取小鼠体重。结果以mean 土 SEM表示，n=6，*P < O. 05,林P < 0.01。图2为穿心莲内酯磺化物改善TNBS诱导的小鼠结肠长度的缩短；其中A为各组小鼠结肠的外观，B为各组小鼠结肠长度的统计值，mean 土 SEM，n=6, *P < 0.05，#P <0. 01。图3为穿心莲内酯磺化物改善TNBS诱导的小鼠结肠组织病变；各组结肠组织进行MPO的测定，并进行H&E染色及组织学的评分。其中A为各组小鼠结肠组织的H&E染色，B为各组小鼠结肠组织的病理评分，C为各组小鼠结肠组织中MPO活力测定结果；mean 土SEM, n=6,*P < O. 05, < 0.01。图4为穿心莲内酯磺化物抑制TNBS诱导的小鼠结肠中炎症因子的升高；提取小鼠结肠组织蛋白，Elisa测定各因子的含量。mean 土 SEM，n=6，*P < 0. 05,林P < 0. Ol0图5为穿心莲内酯磺化物改善DSS诱导的小鼠体重降低及疾病活动程度
各组小鼠饮用DSS 5天造成溃疡性结肠炎模型，各剂量穿心莲总内酯磺化物腹腔注射给药，每天一次，连续10天。每天称取小鼠体重(A)观测小鼠腹泻便血情况计算DAI指数⑶。结果以mean 土 SEM 表示，n=6，*P < O. 05, **P < 0.01。图6为穿心莲总内酯磺化物改善DSS诱导的小鼠结肠长度的缩短；其中A为各组小鼠结肠的外观，B为各组小鼠结肠长度的统计值；mean 土 SEM，n=6, *P < 0.05，#P <0. 01。图7为穿心莲内酯磺化物改善DSS诱导的小鼠结肠组织病变；各组结肠组织进行MPO的测定，并进行H&E染色及组织学的评分。A为各组小鼠结肠组织的H&E染色，B为各组小鼠结肠组织的病理评分，C为各组小鼠结肠组织中MPO活力测定结果；mean 土 SEM，n=6，*P < 0. 05,林P < 0. Olo
图8为穿心莲内酯磺化物抑制DSS诱导的小鼠结肠中炎症因子的升高提取小鼠结肠组织蛋白，Elisa测定各因子的含量。mean 土 SEM，n=6，*P < O. 05,**P < 0. Olo
具体实施例方式1.1实验材料1.1.1实验试剂TNBS (Sigma, USA) ；DSS (36000-50000 KD) (MP, USA) ;TNF_ α、IL-1 β、IFN-Y、IL-6 Elisa试剂盒(达科为，中国)；MP0检测试剂盒购自南京建成生物试剂有限公司；蛋白裂解液购自碧云天生物技术有限公司；其余试剂均为国产分析纯。1.1. 2实验仪器垂直平板电泳仪和转膜仪(Bio-Rad，USA); X光胶片洗片机(虎丘影像科技有限公司)；TY-80R脱色摇床(江苏省金坛市医疗仪器厂)；核酸检测仪(Effendorf，德国)；酶标仪(TECAN,瑞士)。显微镜(1X51, Olympus, Japan)。1.1. 3实验动物C57/BL6小鼠，6 8周龄，雌性，体重20 土 2 g购自南京大学模式动物中心。在22土 2 °C、自由取食、自由饮水和12 h昼夜交替的条件下饲养。1. 2实验方法1. 2.1 TNBS诱导结肠炎模型的建立取6 8周龄，18 22 g的C57/6雌性小鼠，小心将3. 5 F软管经由肛门插入结肠，插入深度约3. 5 cm。用I ml—次性无菌注射器将TNBS经软管注入结肠，每只小鼠注射TNBS剂量为100 mg/kg，溶剂为40%乙醇PBS溶液，注射后，将小鼠倒立30秒，以防止TNBS漏出，并使之分布于整个结肠。空白对照组用相同的方法注射100 μ I溶剂(40%乙醇溶液)。1. 2. 2 DSS诱导结肠炎模型的建立以蒸馏水配制浓度为2. 5%的DSS，模型组及各给药组自由饮用5天进行造模，视肠炎发病程度确定处死小鼠的时间。每天称量小鼠体重，观察小鼠腹泻及便血的情况。肠炎发病程度的评价指标为小鼠的体重减少的情况及疾病活动程度评分(Disease activityindex, DAI)。
评分指标疾病活动指数(DAI):体重下降的百分率(体重不变为O分，下降1% -5%为I分，下降5% -10%为2分，下降10% -15%为3分，>15%为4分)、大便黏稠度(正常为O分，松散但不附着于肛周为2分，腹泻为4分)和大便出血(正常O分，隐血阳性为2分，显性出血为4分)的均数即为DAI。DAI综合评分介于0-4分之间，O分代表正常，4分代表炎症最大活动度。1. 2. 3给药方式及剂量对于TNBS模型，穿心莲内酯磺化物溶于PBS进行腹腔注射，剂量分别为5，2. 5及1.25 mg/kg,阳性对照药组腹腔注射给予地塞米松2 mg/kg。从造模当天开始,每天称量小鼠体重，记录相比较造模当天体重值的增加或减少量。对于DSS模型，穿心莲总内酯磺化物溶于PBS进行腹腔注射，剂量分别为5，2. 5及1. 25 mg/kg,阳性对照药组灌胃给予柳氮磺胺吡啶500 mg/kg。
1. 2. 4检测指标1. 2. 4.1结肠形态及长度实验结束时摘眼球取血并处死小鼠，取出结肠(肛门至盲肠段)，测量长度，拍照。
1.2. 4.2组织石蜡切片，H&E染色及评分取一段远端结肠，以10%福尔马林固定，石蜡包埋切片并进行H&E染色。由专业病理人员光学显微镜观察肠壁有无下列病变并进行评分(I)粘膜上皮细胞有无变性、坏死及其程度；(2)黏膜固有层有无充血、水肿、炎细胞浸润；(3)粘膜下层、肌层、浆膜层有无充血、水肿、炎细胞浸润。根据病变由轻到重的程度分别记分为O. 5分(轻微)，I分(轻度)，2分(中度)，3分(重度)，4分(极重度)，无明显病变记为O分，累加所有分数，得出总分，计算出每组每只动物的平均分。1. 2. 4. 3组织总蛋白的提取及western blot取一小段结肠组织(约10 mg)提去总蛋白。组织用300 μ I裂解液进行匀浆。冰浴O. 5 h，4。。离心12000 g，10 min，取上清。用BCA测定蛋白含量。制备12%的SDS-PAGE胶，以20 yg蛋白量上样电泳。恒压条件下，积层胶内电泳电压为80 V，分离胶电压为100V。电泳结束后，用湿法转膜转至PVDF膜(350 mA,90 min)。膜用5%脱脂奶粉封闭，室温I h。膜与一抗共孵，室温2 h，PBST洗涤三次，与适当稀释的二抗共孵，室温I h，膜同法洗涤三次，与底物共孵I min。膜与X-感光胶片在暗盒曝光。1. 2. 4. 4组织髓过氧化物酶(myeloperoxidase, ΜΡ0)活力测定将提取的结肠组织蛋白进行MPO活力测定。实验步骤参照南京建成试剂盒说明书。1. 2. 4. 5 酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)结肠组织蛋白匀浆上清中细胞因子的测定根据北京达科为ELISA试剂盒描述的方法进行。大致流程如下从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条，其它板条密封放回4°C。除空白孔外，分别将标本或不同浓度标准品(100 μ /孔)加入相应孔中，除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(50 μ /孔)，混匀，37 1孵箱孵育90 min。洗板5次。除空白孔夕卜，加入酶结合物工作液(100 μ /孔)。用封板胶纸封住反应孔，37 1孵箱孵育30 min。洗板4次。加入显色剂100 μ /孔，避光37 1孵箱孵育15 min。加入终止液100 μ /孔，混匀后即刻测量0D450值(5 min内)。每个标准品和标本的OD值应减去零孔的OD值。以标准品浓度作横坐标，OD值作纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点，通过标本的OD值可以在标准曲线上计算出其浓度。若标本OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测，计算浓度时应乘以稀释倍数。1. 2. 5统计方法结果以mean 土 SEM表示,先使用单因素方差分析(ANOVA),有差异后两组之间的比较使用Student，s_t test检验,两组以上比较使用Dunnett’ s test检验,P < O. 05认为有显著差异，P < O. 01认为有极显著差异。1. 3实验结果1. 3.1穿心莲内酯磺化物改善TNBS诱导的小鼠体重降低 TNBS肠炎造模之后，小鼠体重当天就会有明显下降，如果炎症持续，随着实验天数的增加，小鼠体重将持续减小；一般情况下，小鼠体重可以因炎症的自愈而缓慢回升，如果药物有改善效果，将加速其恢复过程。正常对照组因为40%乙醇的作用，会在1-2天内导致小鼠体重微弱降低，并在之后迅速回升。如图1所示，正常组小鼠的体重在微弱下降之后逐日缓慢增加；模型组小鼠的体重在造模后出现下降，持续至第三天；给予2 mg/kg地塞米松可以显著改善因肠炎导致的小鼠体重减轻；2.5与5 mg/kg的穿心莲内酯磺化物对小鼠体重减轻亦有良好的改善效果，且5 mg/kg的穿心莲内酯磺化物效果优于阳性对照药地塞米松，在第三天基本上与正常组相当。1. 3. 2穿心莲内酯磺化物改善TNBS诱导的小鼠结肠组织病变小鼠经TNBS造模后结肠长度明显缩短(图2)，结肠黏膜呈明显的急性炎症反应，表现为部分表面上皮脱落，局部黏膜层细胞坏死，大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主(图3)。MPO测试结果也表明大量髓系细胞浸润到结肠组织中。穿心莲内酯磺化物给药后可明显改善小鼠结肠病变，表现对上皮组织的脱落的减少，炎症细胞的浸润程度减轻，MPO含量的降低及病理评分的降低，呈现出显著地剂量依赖性。1.3.3穿心莲内酯磺化物抑制TNBS诱导的炎症因子表达炎症的发生离不开炎症因子的作用。如图4所示，TNBS造模诱导以后，模型组小鼠结肠组织中IL 6，TNF a，IFN y, IL-1 β的蛋白水平明显升高。穿心莲内酯磺化物给药以后，IL 6,TNF a ,IFN Y , IL-1 β的分泌被明显抑制。由此可见，穿心莲内酯磺化物给药可以显著抑制各致炎因子的表达。1. 3. 5穿心莲内酯磺化物改善DSS诱导的小鼠体重降低及疾病活动程度模型组小鼠饮用DSS 4 5天后出现懒动、拱背、厌食、体重下降、粪便隐血阳性，DAI评分增高，停止饮用DSS后体重继续下降，至9-10天开始恢复。DAI指数亦有相同趋势，如图5所示。穿心莲总内酯磺化物给药后可剂量依赖性地延缓、对抗DSS引起的体重下降及DAI指数的升高，其中高剂量组效果最为明显，接近于正常组。阳性对照组即使给予高达500 mg/kg的柳氮磺胺吡啶也不足以对抗DSS所导致的小鼠体重下降和结肠的缩短，穿心莲内酯磺化物的效果要显著强于柳氮磺胺吡啶。1. 3. 6穿心莲内酯磺化物改善DSS诱导的小鼠结肠组织病变小鼠饮用DSS后结肠长度明显缩短(图6)，结肠黏膜呈明显的急性炎症反应，表现为部分表面上皮脱落，局部黏膜层细胞坏死，大量炎症细胞浸润，以中性粒细胞、淋巴细胞为主(图7)。MPO测试结果也表明大量髓系细胞浸润到结肠组织中。穿心莲总内酯磺化物给药后可明显改善小鼠结肠病变，表现对上皮组织的脱落的减少，炎症细胞的浸润程度减轻，MPO含量的降低及病理评分的降低，呈现出显著地剂量依赖性。1.3.7穿心莲内酯磺化物抑制DSS诱导的炎症因子表达肠炎的发生伴随着大量炎症因子的 表达。如图8所示，DSS诱导以后，模型组小鼠结肠组织中TNF a，IL-1 β , IFN y, IL17的蛋白水平明显升高。穿心莲总内酯磺化物给药以后，可显著下调这些细胞因子的分泌。由此可见，穿心莲内酯磺化物给药可以显著抑制各致炎因子的表达。
权利要求
1.穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用，其特征在于所述的肠炎为克罗恩氏病或溃疡性结肠炎。
全文摘要
本发明涉及穿心莲内酯磺化物在制备治疗炎症性肠病药物中的应用。本发明采用与临床上克罗恩氏病的病理非常相近的TNBS诱导的小鼠结肠炎模型以及与临床上溃疡性结肠炎病理非常相近的DSS诱导的小鼠结肠炎模型，综合运用Westernblot、H&E染色及ELISA等方法，考察穿心莲内酯磺化物对克罗恩氏病和溃疡性结肠炎的治疗效果。结果表明，穿心莲内酯磺化物可显著改善TNBS和DSS诱导的小鼠结肠炎，提示穿心莲内酯磺化物可用于克罗恩氏病以及溃疡性结肠炎的治疗。
文档编号A61P29/00GK103006640SQ20121051985
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者谢宁, 杨小玲, 吕武清, 刘地发, 程帆, 李志勇, 曾发林 申请人:江西青峰药业有限公司