抗凝血剂解毒剂的制作方法【专利摘要】本发明涉及针对抗凝血剂、特别是针对达比加群的抗体分子，以及所述抗体分子作为此类抗凝血剂的解毒剂的用途。【专利说明】抗凝血剂解毒剂【
技术领域：
】[0001]本发明涉及医药领域，尤其是抗凝血疗法的领域。现有技术[0002]抗凝血剂为预防血液凝固的物质；即，抗凝血剂可以使血液停止凝固。抗凝血剂广泛用作治疗人血栓性疾病的药物，例如在易感者中预防原发性及继发性深静脉血栓形成、肺栓塞、心肌梗塞及中风。[0003]一类重要的口服抗凝血剂通过拮抗维生素K的作用而起作用，例如包括华法林在内的香豆素类。第二类化合物通过辅因子间接抑制凝血，例如抗凝血酶III或肝素辅因子II。此包括数种低分子量的肝素产物，其通过抗凝血酶III主要催化抑制Xa因子(以及针对凝血酶的程度较小)(贝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、达替肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕月干素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin),小链寡糖(磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))通过抗凝血酶III仅抑制Xa因子。类肝素(达那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮肤素(dermatansulfate))通过两种辅因子起作用，且抑制Xa因子及凝血酶两者。第三类则为凝血的直接抑制剂。直接Xa因子抑制剂包括阿哌沙班(apixaban)、伊度沙班(edoxaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban),且直接凝血酶抑制剂包括二价水蛭素(比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(Iepirudin)Ji西卢定(desirudin))以及单价化合物阿加曲班(argatroban)及达比加群(dabigatran)。[0004]由于血液凝固为停止出血的生物机制，因此抗凝血疗法的副作用是可能发生不期望的出血事件。因此需要提供一种能够阻止所述抗凝血剂相关的出血事件发生的解毒剂(antidote)(Zikria及Ansell，CurrentOpinioninHematology2009,16(5):347-356)。一种实现此目标的方法为在给药抗凝血剂后中和患者体内所存在的抗凝血剂化合物活性。[0005]目前可使用的抗凝血剂解毒剂为鱼精蛋白(用于中和肝素)及维生素K(用于中和类似华法林的维生素K拮抗剂)。对于罹患严重创伤及严重出血且接受低分子量肝素治疗的患者而言，新鲜冷冻血浆及重组因子VIIa也可作为非特异性解毒剂使用(LauritzenB.等人，Blood，2005，607A-608A)。也有报导指出鱼精蛋白片段(美国专利第6，624，141号)及小合成肽(美国专利第6，200,955号)作为肝素或低分子量肝素解毒剂；且凝血酶突变蛋白(美国专利第6，060,300号)可用作凝血酶抑制剂的解毒剂。已有报导指出凝血酶原中间体及衍生物可用作水蛭素及合成凝血酶抑制剂解毒剂(美国专利第5，817，309号及第6，086，871号)。对于Xa因子直接抑制剂而言，已有报导指出失活Xa因子类似物可用作解毒剂(W02009042962)。此外，重组VIIa因子已经用于逆转抗凝血酶III依赖性Xa因子之间接抑制剂(例如磺达肝素及艾卓肝素)的效应(BijsterveldNR等人，Circulation,2002,106:2550-2554；BijsterveldNR等人，BritishJ.0fHaematology,2004(124):653-658)。有关抗凝血剂逆转的方法的综述提供于Schulman及Bijsterveld,TransfusionMedicineReviews2007:21⑴，37-48中。[0006]国际专利申请案W02011089183公开可结合及中和达比加群活性的抗体。[0007]对于抗凝血疗法提供改良的解毒剂存在需求，且具体地，为针对类似达比加群的直接凝血酶抑制剂提供解毒剂，该特异性解毒剂至今尚无人公开。[0008]发明概述[0009]在一个方面中，本发明涉及一种能够中和抗凝血剂的活性的抗体分子。[0010]在另一方面中，该抗体分子针对抗凝血剂具有结合特异性。[0011]在另一方面中，该抗凝血剂为一种直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或维生素K拮抗剂。[0012]在另一方面中，该抗凝血剂为达比加群(dabigatran)、阿加曲班(argatroban)、美拉加群(melagatran)、希美加群(ximelagatran)、水蛭素(hirudin)、比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(Iepirudin)、地西卢定(desirudin)、阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban)、去纤维蛋白多核苷酸(defibrotide)、雷马曲班(ramatroban)、抗凝血酶III或Drotrecoginα。[0013]在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯(dabigatranexetilate)及/或达比加群的0_酰基葡糖苷酸的抗体分子。[0014]在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其对于人而言具有降低的免疫原性。[0015]在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其具有改良的理化性质，尤其是在水性溶剂中具有改良的溶解度。[0016]在另一方面中，本发明涉及一种针对达比加群、达比加群酯和/或达比加群的O-酰基葡糖苷酸的抗体分子，其在宿主细胞中具有改良的生产能力，尤其是造成改良的产物收率。[0017]在另一方面中，该抗体分子为多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的片段，尤其为Fab、Fab’或F(ab’)2片段、单链抗体，尤其为单链可变片段(scFv)、域抗体、纳米抗体、双价抗体(diabody)或DARPin。[0018]在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于医药中。[0019]在另一方面中，本发明涉及一种如上所述的抗体分子，其用于治疗或预防抗凝血疗法所产生的副作用。[0020]在另一方面中，该副作用为出血事件。[0021]在另一方面中，本发明涉及一种治疗或预防抗凝血疗法所产生的副作用的方法，该方法包括将有效量的如上所述抗体分子给药至有此需要的患者。[0022]在另一方面中，本发明涉及包含所述抗体分子以及容器和标签的试剂盒。【专利附图】【附图说明】[0023]图1:利用凝血酶凝血时间测试，观察到凝血时间会随着达比加群浓度增加而增长。200nM的浓度会造成凝血时间比基线增加约5倍，且该浓度用于第一组及第二组实验中。最后一组实验中采用500nM的浓度(超治疗浓度)。[0024]图2:四种针对达比加群的不同抗体(A至D)均可使人血浆中达比加群所延长的凝血时间中和。人血浆中的基线凝血时间为10.9秒，当使200nM达比加群与血浆预先培养时，凝血时间延长至51秒。将各抗体添加至经200nM达比加群预先培养的血浆中，并再培养5分钟。随后，通过添加凝血酶，开始凝血酶凝血时间。各抗体会以不同程度逆转达比加群的凝血时间。浓度最高的溶液会造成抗凝血活性的最大逆转。[0025]图3:将浓度递增的多克隆抗体(抗体D)添加至已与200nM达比加群预先培养的人血浆中，测量其作用。基线凝血时间为11秒，添加达比加群延长凝血时间至63.7秒。随后，测定递增浓度的抗体对逆转达比加群所延长凝血酶凝血时间的作用。最低浓度将凝血酶凝血时间降低至43.9秒。较高的浓度将凝血酶凝血时间完全降至基线水平，并造成达比加群的抗凝血作用的完全中和。添加非特异性兔多克隆抗体(方块)对逆转达比加群的抗凝血作用无影响。[0026]图4:将浓度递增的多克隆抗体(抗体D)添加至已与500nM达比加群预先培养的人血浆中，测量其影响。基线凝血时间为10.9秒，添加该较高浓度达比加群时，延长凝血时间至111.7秒(增加约10倍)。抗体的1:2稀释液或原液逆转达比加群所延长凝血酶凝血时间的效应与浓度具有相关性。最高浓度也会使凝血酶凝血时间完全逆转至基线水平，且甚至使超治疗浓度的达比加群的抗凝血作用完全中和。[0027]图5:小鼠单克隆抗体(克隆22)逆转人血浆及人全血中达比加群的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠单克隆抗体添加至已与30nM达比加群预先培养的人血浆或全血中。通过添加1.5至2U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将存在及不存在该化合物下的凝血时间差异定义为100%达比加群活性。该抗体以剂量依赖性方式抑制达比加群-介导的凝血时间延长。[0028]图6:自克隆22抗体产生的小鼠Fab逆转人血浆中达比加群的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠Fab添加至已与7nM达比加群预先培养的人血浆中。也测试完整抗体，作为阳性对照组。通过添加0.4U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将达比加群介导的凝血时间增加的完全阻断定义为100%抑制。该Fab以剂量依赖性方式抑制人血浆中达比加群所诱发的凝血时间延长。[0029]图7:小鼠单克隆抗体(克隆22)逆转人血浆中的达比加群酰基葡糖苷酸的抗凝血作用。将浓度递增的小鼠抗体添加至已与7nM达比加群酰基葡糖苷酸或达比加群预先培养的人血浆中。通过添加0.4U/ml的凝血酶开始该测试，并测量凝血时间。将该化合物介导的凝血时间增加的完全阻断定义为100%抑制。该抗体以剂量依赖性方式抑制人血浆中达比加群酰基葡糖苷酸所诱发的凝血时间延长。[0030]图8:所选嵌合抗体在凝血酶凝血时间测试中抑制达比加群活性。添加递增浓度的抗体至已与7nM达比加群一起预培育的人类血浆中。完整抗体亦作为阳性对照进行测试。由添加0.4U/mL凝血酶开始分析并且测量凝血时间。将达比加群介导的凝血时间增加完全阻断定义为100%抑制。抗体以剂量依赖性方式抑制人类血浆中由达比加群诱发的凝血时间延长。[0031]图9:FabVH5c/Vkl8(SEQIDNO:99及SEQIDNO:100)及VH5c/Vk21(SEQIDN0:99及SEQIDNO:101)在凝血酶凝血时间血浆分析中抑制达比加群活性。如上所述进行分析。[0032]图10:FabVH5c/Vkl8(SEQIDN0:99及SEQIDNO:100)及VH5c/Vk21(SEQIDN0:99及SEQIDNO:101)在血浆和全血凝血酶凝血时间测试中抑制达比加群活性。如上所述进行分析。[0033]图11:Fab-达比加群复合物的晶体结构。A:Fabl8/15(W02011089183)与达比加群的复合物的晶体结构。B:FabVH5c/Vkl8(SEQIDN0:99及SEQIDNO:100)与达比加群的复合物的晶体结构。C:在含有Fabl8/15的晶体结构中所见的达比加群的构型。D:在具有VH5c/Vkl8的晶体结构中所见的达比加群的伸长构型。[0034]图12:所计算的包含CDR(左侧)或完整Fv区(右侧)的(A)Fabl8/15、(B)FabVH5c/Vkl8及(C)FabVH5c/Vkl8的空间聚集趋势(SAP)。[0035]图13:用相应Fab表达构建体转染的CHO细胞在分批补料运行之下得到(A)Fab18/15(B)FabVH5c/Vkl8和(C)FabVH5c/Vk21的效价。[0036]发明详述[0037]在一个方面中，本发明涉及一种能够中和抗凝血剂的活性的抗体分子。[0038]抗体(也称为免疫球蛋白，缩写为Ig)为发现于脊椎动物血液或其他体液的Y球蛋白，且可通过免疫系统用以识别及中和外来物体，例如细菌及病毒。所述抗体通常为由各具有两个大重链及两个小轻链的基本结构单元所组成，以形成(例如)具有I个单元的单体、具有2个单元的二聚体或具有5个单元的五聚体。抗体可通过非共价键相互作用而结合至称为抗原的其他分子或结构。此结合是特异性的，也就是抗体会以高亲和力方式仅结合至特定结构。被抗体所识别的抗原的独特部分称为抗原表位或抗原决定基。结合至该抗原表位的抗体部分有时称为互补位，其位于该抗体的所谓的可变域或可变区(Fv)中。该可变域包括三个被骨架区(FR)隔开的所谓的互补决定区(CDR)。[0039]在本发明上下文中，所提及的⑶R是根据Chothia的定义(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.1987，196:901-917)以及Kabat(E.A.Kabat,Τ.T.Wu、H.Bilofsky、Μ.Reid-Miller及H.Perry,SequenceofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda(1983))。[0040]本领域已经进一步开发出抗体，且使所述抗体成为医学及技术中具有多功能的工具。因此，在本发明上下文中，术语“抗体分子”或“抗体”(本文作为同义词使用)并不只包括自然界中所发现的抗体(该抗体包括例如两条轻链及两条重链，或仅包括两条重链(如在骆驼物种中))，也包括所有包含至少一个具有抗原结合特异性的互补位及具有与免疫球蛋白可变域类似结构的分子。[0041]因此，本发明的抗体分子可为多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、抗体的片段，尤其为Fv、Fab、Fab’或F(ab’)2片段、单链抗体，尤其为单链可变片段(scFv)、小模块免疫药物(SMIP)、域抗体、纳米抗体、双价抗体。[0042]多克隆抗体是指具有不同氨基酸序列的抗体分子的集合，且可通过本领域公知的方法，从接受抗原免疫的脊椎动物的血液中获得。[0043]单克隆抗体(mAb或moAb)为氨基酸序列相同的单一特异性抗体，单克隆抗体可通过杂交瘤技术,从被称为杂交瘤的杂交细胞株制备产生的，该称为杂交瘤的杂交细胞是指可产生特异性抗体的B细胞与骨髓瘤(B细胞癌)细胞融合的克隆(KohlerG、MilsteinC，Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature1975；256:495-7)。或者，单克隆抗体可通过在宿主细胞中的重组表达法制备(NorderhaugL、OlafsenT、MichaelsenTE、Sandlie1.(1997年5月)，“Versatilevectorsfortransientandstableexpressionofrecombinantantibodymoleculesinmammaliancells”，JTmmunolMethods204(I):77-87;参见下文)。[0044]对人的应用而言，往往需要降低源自其他物种(如小鼠)的抗体的免疫原性。这可通过构建嵌合抗体，或通过称为“人源化”的方法来实现。在本文中，“嵌合抗体”应理解成将包含衍生自一种物种(例如小鼠)的序列部分(例如可变域)融合至衍生自不同物种(例如人)的序列部分(例如恒定域)的抗体。“人源化抗体”为一种包括源自非人物种可变域的抗体，其中某些氨基酸发生突变，使该可变域整体序列更类似接近于人可变域的序列。抗体的嵌合化及人源化的方法也是本领域公知的(BillettaR、LobuglioAF,“Chimericantibodies”.IntRevTmmunol.1993;10(2-3):165-76；RiechmannL、ClarkM、WaldmannH>WinterG(1988),“Reshapinghumanantibodiesfortherapy”，Nature:332:323)。[0045]此外，已经开发基于衍生自人基因组序列的产生抗体的技术，例如通过噬菌体展不技术或使用转基因动物(W090/05144；D.Marks、H.R.Hoogenboom、Τ.P.Bonnert>J.McCafferty>A.D.Griffiths及G.Winter(1991),“By-passingimmunisation.HumanantibodiesfromV-genelibrariesdisplayedonphage.^J.Mo1.Biol.，222，581-597；Knappik等人，J.Mol.Biol.296:57-86,2000；S.Carmen及L.Jermutus,“Conceptsinantibodyphagedisplay，，，BriefingsinFunctionalGenomicsandProteomics20021(2):189-203;LonbergN、HuszarD,“Humanantibodiesfromtransgenicmice，，，IntRevImmunol.1995;13(I):65-93;BriiggemannM、TaussigMJ,“Productionofhumanantibodyrepertoiresintransgenicmice，，，CurrOpin810七6吐1101.1997年8月，8(4):455-8)。所述抗体为本发明上下文中的“人抗体”。[0046]本发明的抗体分子也包括保持抗原结合特性的免疫球蛋白片段，如Fab、Fab’或F(ab’)2片段。通过免疫球蛋白的断裂(例如通过蛋白消化)或通过重组表达所述片段可获得所述片段。例如通过常规技术，例如使用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶(W094/29348)或内切蛋白酶Lys-C(Kleemann等人，Anal.Chem.80,2001-2009,2008)可实现免疫球蛋白消化作用。以木瓜蛋白酶或Lys-C消化抗体通常会产生两个相同的称为Fab片段的抗原结合片段(每一片段具有单一的抗原结合位点)及残留的Fe片段。经胃蛋白酶处理则会产生F(ab’)2。通过宿主细胞中重组表达制备Fab分子的方法详细说明于下文中。[0047]已开发出多种技术以将免疫球蛋白可变域或衍生自所述可变域的分子置于不同的分子背景内。根据本发明，这些也应视为“抗体分子”。一般而言，这些抗体分子在尺寸上小于免疫球蛋白，且包括单一氨基酸链或由数条氨基酸链组成。例如单链可变片段(scFv)为免疫球蛋白重链及轻链的可变区的融合体，利用短接头(通常为丝氨酸(S)及甘氨酸(G))连在一起(W088/01649;W091/17271;Huston等人，InternationalReviewsofImmunology,第10卷，1993，195-217)。“单域抗体”或“纳米抗体”在单一的Ig样域中具有抗原结合位点(W094/04678；W003/050531；ffard等人，Nature.1989年10月12日；341(6242):544-6;Revets等人，ExpertOpinBiolTher.5(1):111-24,2005)。可将一或多个具有针对相同或不同抗原的结合特异性单域抗体连在一起。双价抗体为由两条氨基酸链组成的二价抗体分子，其包含两个可变域(W094/13804;HolIiger等人，ProcNatlAcadSciUSA.1993年7月15日；90(14):6444-8)。抗体样分子的其他实例为免疫球蛋白超家族抗体(IgSF;Srinivasan及Roeske,CurrentProteinPept.Sc1.2005,6(2):185-96)。有一种不同概念产生所谓的小模块免疫药物(SMIP)，其包括连接至单链铰链的Fv域及缺乏恒定域CHl的效应子结构域(W002/056910)。[0048]在另一方面中，本发明的抗体分子甚至可能与免疫球蛋白可变域仅具有远距结构相关性，或根本没有所述相关性，只要其具有相当于免疫球蛋白可变域的特定的结合特异性及亲和力即可。所述非免疫球蛋白“抗体模拟物”(有时称为“支架蛋白”)可能基于A蛋白、载脂蛋白、纤维结合蛋白域、锚蛋白通用序列重复域及硫氧还蛋白的基因(Skerra，CurrentOpinioninBiotechnology2007,18(4):295-304)。本发明上下文中的优选实施方案为经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin’s;Steiner等人，JMolBiol.2008年8月24日；382(5):1211-27；StumppMT、AmstutzP,CurrOpinDrugDiscovDevel.2007年3月；10(2):153-9)。[0049]可将抗体分子融合(成为融合蛋白)或另外连接(通过共价键或非共价键)至对该抗体分子的特性具有所需影响的其他分子实体。例如可能需要改善抗体分子的药代动力学性质、例如体液(如血液)中的稳定性，特别是在单链抗体或域抗体的情况下。已在此方面开发诸多技术，尤其为延长所述抗体分子在循环中的半衰期，如聚乙二醇化(W098/25971；W098/48837；W02004081026);将抗体分子融合或共价连接至对血清蛋白(如白蛋白)具有亲和力的另一抗体分子(W02004041865；W02004003019);或使抗体分子表达为具有全部或部分血清蛋白(如白蛋白或转铁蛋白)的融合蛋白(W001/79258)。[0050]在另一方面中，所述抗体分子对抗凝血剂具有结合特异性。“结合特异性”指抗体分子对该抗凝血剂的结合亲和力显著高于对结构上无关的分子的结合亲和力。[0051]亲和力为抗体分子上的单一抗原结合位点与单一抗原表位之间的相互作用。其以缔合常数KA=kass/kdiss或解尚常数KD=kdiss/kass表不。[0052]在本发明的一方面中，如通过表面等离子共振分析法(MalmqvistM.,“SurfacePlasmonresonancefordetectionandmeasurementofantibody-antigenaffinityandkinetics.”，CurrOpinImmunol.1993Apr;5(2):282-6)所测定，该抗体与抗凝血剂的结合亲和性的KD值范围为0.1pM至100μM，优选为IpM至100μΜ，优选为IpM至IμΜ。也可使用动态排除分析(KinExA)技术，测量抗体亲和性(Dariing,R.J.及BraultP-A.,“Kineticexclusionassaytechnology-CharacterizationofMolecularInteractions.”，ASSAYandDrugDevelopmentTechnologies.2004年12月，2(6):647-657)。[0053]可通过称为亲和性成熟的方法来增强抗体分子的结合亲和性(Marks等人，1992，Biotechnology10:779-783;Barbas,等人，1994，Proc.Nat.Acad.Sci,USA91:3809-3813；Shier等人，1995，Genel69:147-155)。因此，本发明也包括亲和性成熟的抗体。[0054]在本发明另一方面中，该抗体分子能够中和抗凝血剂的活性。即，在与该抗体分子结合之后，该抗凝血剂即无法发挥其抗凝血活性，或此活性程度已显著下降。优选地，当针对所讨论的抗凝血剂采用适当的活性分析，特别是采用对凝血酶敏感的凝血分析，如蛇静脉酶(ecarin)凝血时间或凝血酶凝血时间测定时(H.Bounameaux、MarbetGA、LammleB,等人，“Monitoringofheparintreatment.Comparisonofthrombintime,activtedpartialthromboplastintime,andplasmaheparinconcentration,andanalysisofthebehaviourofantithrombinIII，，，AmericanJournalofClinicalPathologyl98074(l):68-72)，抗体结合后的抗凝血活性会下降至少2倍、5倍、10倍或100倍。[0055]为了制备本发明的抗体分子，本领域技术人员可自多种本领域公知的方法中选择(Norderhaug等人，JTmmunolMethodsl997,204(1):77-87；Kipriyanow及LeGall,MolecularBiotechnology26:39-60,2004；Shukla等人，2007，J.ChromatographyB,848(1):28-39)。[0056]抗凝血剂为本领域公知的，如上文所述。在本发明另一方面中，该抗凝血剂为直接凝血酶抑制剂、Xa因子抑制剂或维生素K拮抗剂。维生素K拮抗剂的实施例为包括华法林在内的香豆素类。Xa因子的间接主要抑制剂的实例为通过抗凝血酶III的活化产生作用的肝素类物质，其包括数种低分子量的肝素产物(贝米肝素(bemiparin)、舍托肝素(certoparin)、达替肝素(dalteparin)、依诺肝素(enoxaparin)、那屈肝素(nadroparin)、帕肝素(parnaparin)、瑞肝素(reviparin)、亭扎肝素(tinzaparin))、某些寡糖(磺达肝素(fondaparinux)、艾卓肝素(idraparinux))、类肝素(达那肝素(danaparoid)、舒洛地特(sulodexide)、硫酸皮肤素(dermatansulfate)),及直接Xa因子抑制剂(阿哌沙班(apixaban)、奥米沙班(otamixaban)、利伐沙班(rivaroxaban))。凝血酶抑制剂的实施例包括二价水蛭素(比伐卢定(bivalirudin)、来匹卢定(Iepirudin)、地西卢定(desirudin))、及单价化合物阿加曲班(argatroban)及达比加群(dabigatran)。[0057]因此，在另一方面中，该抗凝血剂为达比加群、阿加曲班、美拉加群、希美加群、水蛭素、比伐卢定、来匹卢定、地西卢定、阿哌沙班、伊度沙班、奥米沙班、利伐沙班、去纤维蛋白多核苷酸、雷马曲班、抗凝血酶III或Drotrecoginα。[0058]本发明上下文中优选的抗凝血剂为达比加群(CAS211914-51-1，N-[2-(4-甲脒基苯基氨基甲基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-5-基羰基]-N-(2-吡啶基)-β-丙氨酸)，其具有化学式(II):[0059]【权利要求】1.一种针对达比加群的抗体分子，其包含具有选自SEQIDN0:l、7、13、19、25、31、37、43、49、55、61及67的CDR1、选自SEQIDNO:2、8、14、20、26、32、38、44、50、56、62及68的CDR2及选自SEQIDNO:3、9、15、21、27、33、39、45、51、57及63的CDR3的重链可变域，以及具有选自SEQIDN0:4、10、16、22、28、34、40、46、52、58及64的CDR1、选自SEQIDN0:5、ll、17、23、29、35、41、47、53、59及65的CDR2及选自SEQIDNO:6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66及69的CDR3的轻链可变域。2.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:1的CDR1、SEQIDNO:2的CDR2及SEQIDNO:3的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:4的CDR1、SEQIDNO:5的CDR2及SEQIDNO:6的CDR3的轻链可变域。3.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:7的CDR1、SEQIDNO:8的CDR2及SEQIDNO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:10的CDRl、SEQIDNO:11的CDR2及SEQIDNO:12的CDR3的轻链可变域。4.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:13的CDR1、SEQID勵:14的0?2及SEQIDNO:15的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:16的CDRl、SEQIDNO:17的CDR2及SEQIDNO:18的CDR3的轻链可变域。5.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:19的CDR1、SEQIDN0:20的CDR2及SEQIDNO:21的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:22的CDRl、SEQIDNO:23的CDR2及SEQIDNO:24的CDR3的轻链可变域。6.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:25的CDR1、SEQIDNO:26的CDR2及SEQIDNO:27的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:28的CDRl、SEQIDNO:29的CDR2及SEQIDNO:30的CDR3的轻链可变域。7.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:31的CDR1、SEQIDNO:32的CDR2及SEQIDNO:33的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:34的CDRl、SEQIDNO:35的CDR2及SEQIDNO:36的CDR3的轻链可变域。8.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:37的CDR1、SEQIDNO:38的CDR2及SEQIDNO:39的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:40的CDRl、SEQIDNO:41的CDR2及SEQIDNO:42的CDR3的轻链可变域。9.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:43的CDR1、SEQIDN0:44的CDR2及SEQIDNO:45的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:46的CDRl、SEQIDNO:47的CDR2及SEQIDNO:48的CDR3的轻链可变域。10.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:49的CDR1、SEQIDNO:50的⑶R2及SEQIDNO:51的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:52的CDRl、SEQIDNO:53的CDR2及SEQIDNO:54的CDR3的轻链可变域。11.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:55的CDR1、SEQIDNO:56的CDR2及SEQIDNO:57的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:58的CDRl、SEQIDNO:59的CDR2及SEQIDNO:60的CDR3的轻链可变域。12.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:61的CDR1、SEQIDNO:62的CDR2及SEQIDNO:63的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:64的CDRl、SEQIDNO:65的CDR2及SEQIDNO:66的CDR3的轻链可变域。13.如权利要求1的抗体分子，其包含具有SEQIDNO:67的CDRl、SEQIDNO:68的CDR2及SEQIDNO:9的CDR3的重链可变域，以及具有SEQIDNO:64的CDRl、SEQIDNO:65的CDR2及SEQIDNO:69的CDR3的轻链可变域。14.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:70的重链可变域及SEQIDNO:71的轻链可变域。15.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:72的重链可变域及SEQIDNO:73的轻链可变域。16.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:74的重链可变域及SEQIDNO:75的轻链可变域。17.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:76的重链可变域及SEQIDNO:77的轻链可变域。18.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:78的重链可变域及SEQIDNO:79的轻链可变域。19.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:80的重链可变域及SEQIDNO:81的轻链可变域。20.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:82的重链可变域及SEQIDNO:83的轻链可变域。21.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:84的重链可变域及SEQIDNO:85的轻链可变域。22.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:86的重链可变域及SEQIDNO:87的轻链可变域。23.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:88的重链可变域及SEQIDNO:89的轻链可变域。24.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:90的重链可变域及SEQIDNO:91的轻链可变域。25.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:92的重链可变域及SEQIDNO:93的轻链可变域。26.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:92的重链可变域及SEQIDN0:94的轻链可变域。27.如权利要求1至26中任一项的抗体分子，其中该轻链可变域融合于SEQIDNO:97的恒定域。28.如权利要求1至25中任一项的抗体分子，其中该重链可变域融合于SEQIDNO:98的恒定域。29.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:95的重链及SEQIDNO:96的轻链。30.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:99的重链及SEQIDNO:100的轻链。31.如权利要求1的抗体分子，其包含SEQIDNO:99的重链及SEQIDNO:101的轻链。32.如前述任一项权利要求的抗体分子，其为多克隆抗体；单克隆抗体；人抗体；人源化抗体；嵌合抗体；抗体的片段，特别是Fab、Fab’或F(ab’)2片段；单链抗体，特别是单链可变片段(scFv);小模块免疫药物(SMIP);域抗体；纳米抗体；双价抗体；或经设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)。33.如前述任一项权利要求的抗体分子，其用于医药中。34.如前述任一项权利要求的抗体分子，其用于治疗或预防抗凝血疗法的副作用及/或用于逆转抗凝血剂的过度给药。35.如权利要求34的抗体分子，其中该副作用为出血事件。36.一种治疗或预防抗凝血疗法的副作用或抗凝血疗法中的过度给药事件的方法，其包括向有此需要的患者给予有效量的前述任一项权利要求的抗体分子。37.一种制备如前述任一项权利要求的抗体分子的方法，其包括(a).提供宿主细胞，其包含一或多个编码与表达调控序列功能相关的抗体分子的核酸，(b).培养该宿主细胞,及(c).自该细胞培养物回收该抗体分子。38.试剂盒，其包含如权利要求1至32中任一项的抗体或其药物组合物。39.试剂盒，其包含:(a)如权利要求1至32中任一项的抗体或其药物组合物；(b)容器；及(C)标签。40.试剂盒，其包含如权利要求1至32中任一项的抗体，以及达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐。41.一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中中和或部分中和达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸的方法，其包括给予权利要求1-32中任一项的抗体或其药物组合物。42.一种在患者中中和或部分中和达比加群或达比加群的1-0-酰基葡糖苷酸的方法，该方法包括以下步骤:(a)确认患者正在接受达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗，且确认该患者服用的量；(b)在进行凝固或凝血试验或分析之前，用权利要求1至32中任一项的抗体中和达比加群或1-ο-酰基葡糖苷酸，其中达比加群或达比加群的1-0-酰基葡糖苷酸会干扰该试验结果或分析结果的精确读数；(c)使用来自患者的样品进行该凝固或凝血试验或分析，以确定达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸不存在的情况下血块形成的水平；和(d)调节达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐给药患者的量，以在患者中达到血块形成和分解之间的适当平衡。43.在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中降低达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸的血浆浓度的方法，其包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂中和患者中达比加群或1-ο-酰基葡糖苷酸的活性。44.一种在正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中逆转达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸的抗凝血作用的方法，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序，该方法包括给予逆转剂的步骤，该逆转剂可中和患者中达比加群或1-0-酰基葡糖苷酸的活性。45.一种在由于凝血功能损伤或创伤而正在经受出血或有出血危险的患者中逆转或降低达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸的活性的方法，其包括以下步骤:(a)测定患者中达比加群或达比加群的1-0-酰基葡糖苷酸存在的量；(b)给予有效量的药物以逆转或降低该患者中测定的达比加群或达比加群的1-ο-酰基葡糖苷酸的活性；(c)监测该患者的凝血酶凝固时间以确保达到达比加群或达比加群的1-0-酰基葡糖苷酸的活性的逆转或降低。46.权利要求43至45任一项的方法，其中所述逆转剂为针对达比加群的抗体分子。47.中和达比加群或达比加群的1-0-酰基葡糖苷酸活性的逆转剂，其用于正在用达比加群、达比加群酯、达比加群的前药或其药学上可接受的盐治疗的患者中，其中该患者有被认为威胁生命的或导致血流动力学损伤的大出血，或其中该患者需要紧急医疗程序。48.权利要求47的逆转剂，其为针对达比加群的抗体分子。【文档编号】A61P39/02GK103476459SQ201280015713【公开日】2013年12月25日申请日期:2012年3月27日优先权日:2011年3月30日【发明者】J.范莱恩,K.卡纳达,R.卡朋汉弗,N.奥埃尔,T.利岑布格尔,C.R.萨科,S.辛格,A.K.沃特曼申请人:勃林格殷格翰国际有限公司