对乙型肝炎病毒感染或其与丁型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病结合的治疗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及亲环蛋白抑制剂在治疗乙型肝炎及丁型肝炎病毒感染中的用途，其任选地与干扰素或替比夫定、拉米夫定、恩曲他滨、恩替卡韦、阿德福韦或替诺福韦联合使用。
【专利说明】对乙型肝炎病毒感染或其与丁型肝炎病毒感染及相关肝脏疾病结合的治疗
【背景技术】
[0001]本发明涉及结合亲环蛋白(cyclophilin)的非免疫抑制性环孢素类似物，即亲环蛋白抑制剂，尤其涉及其在治疗单独的乙型肝炎病毒(HBV)或其结合丁型肝炎病毒(HDV)感染及由此类感染引起的肝脏疾病中的制药用途。
[0002]环孢素及非免疫抑制性类似物包含一类结构上独特的环状聚-N-甲基化十一肽，其通常具有药理学活性，尤其是免疫抑制或消炎活性。被分离的环孢素首先为天然存在的真菌代谢物环孢素(Ciclosporin)或环孢灵(Cyclosporine),也称为环孢素A (CsA)。已识别强烈结合亲环蛋白但不具有免疫抑制性的环孢素。PCT/EP2004/009804、W02005/021028或TO2006/071619(其以全文引用的方式并入本文中)揭示结合亲环蛋白且也已发现对丙型肝炎病毒(HCV)具有抑制作用的非免疫抑制性环孢素。W02006/038088(以全文引用的方式并入本文中)描述在HCV`治疗中使用阿拉泊韦(alisporivir)的方法及组合物。阿拉泊韦(DEB025或Debio-025)为亲环蛋白(Cyp)抑制剂，且其作为抗HCV试剂的作用模式为经由抑制与HCV复制直接有关的宿主蛋白，尤其亲环蛋白A。
[0003]乙型肝炎病毒(HBV)为最小的人类DNA病毒(I)。HBV基因组为具有编码HBV蛋白的重迭阅读框的部分双链环状DNA:包膜蛋白-1)小，乙型肝炎表面抗原(HBsAg) ；ii)中等-preS2加上HBsAg ；iii)大-preSl加上preS2加上HBsAg:核衣壳蛋白,乙型肝炎核心抗原(HBcAg)。乙型肝炎e抗原(HBeAg)为HBV复制期间产生的与核衣壳HBcAg共享90%氨基酸的非结构性蛋白。已确定HBV的八个基因型(指定为A至H)，各自具有不同的地理分布。病毒为非细胞致病性的，其中病毒特异性细胞免疫性为暴露于HBW6个月消退肝脏疾病的急性感染或常常与进行性肝脏损伤有关的长期HBV感染)的结果的主要决定因素。通过常规诊断免疫分析法在血清中检测到HBsAg为感染HBV的关键诊断标记，且在血清中持续检测到HBsAg超过6个月为慢性HBV感染标志(2，3，4)。临床上显著的HBV复制的最佳标记为血清中的HBV DNA含量，如通过基于敏感聚合酶链反应(PCR)的分析所检测的。
[0004]全世界超过3.5亿人长期感染HBV，且因此发展成严重肝脏疾病(诸如慢性肝炎、肝硬化、肝脏衰竭及肝细胞癌(HCC))的风险增大。慢性HBV感染的自然演变包括四个连续阶段:(I)早期“免疫耐受”阶段-高度病毒复制及最少肝脏炎症；⑵免疫反应性阶段-肝脏炎症明显及血清转氨酶增多；其中一些患者进展至(3) “非复制”阶段-血清转化至抗HBe ;病毒血症不可检测或程度低(通过基于PCR的分析低于2000IU/ml);肝脏炎症消退；及(4)HBeAg阴性慢性乙型肝炎-归因于防止HBeAg产生但并不妨碍病毒复制的特异性病毒突变的出现。该形式的CHB特征在于血清HBV DNA及血清转氨酶(ALT及AST)含量波动及进行性肝脏疾病。重要的是注意到慢性乙型肝炎(CHB)可能以乙型肝炎e抗原(HBeAg)阳性或HBeAg阴性CHB的形式存在。CHB患者的纵向研究指示发展成肝硬化的5年累积发生率介于8%至20%范围内。肝脏失代偿的5年累积发生率为约20%(2)。在世界范围内HCC的发生率已增加且目前构成最常见癌症的第五位(2，3，4)。每年HBV相关HCC的发生率很高，当确定为肝硬化时，在2%至5%范围内(2)。[0005]CHB治疗的主要目标为永久抑制HBV复制并改善肝脏疾病。临床上重要的短期目标为实现HBeAg血清转化、血清ALT及AST正常化、消退肝脏炎症及防止肝脏失代偿(2)。治疗的最终目标为实现持久应答以防止肝硬化、肝癌的发展并延长存活。由于感染肝细胞核中病毒共价闭合环状DNA(ccc HBV DNA)的特定形式的持久性，HBV感染不能完全根除。然而，治疗诱发的血清HBsAg清除为慢性HBV感染终止的标记且与最佳长期结果有关(2，3)。
[0006]当前七种药物可用于治疗CHB-常规的干扰素、聚乙二醇化干扰素及直接抗病毒剂。直接抗病毒剂(核苷/酸类似物(nucleos/tide analogue))属于三种类别:L_核苷(拉米夫定(Iamivudine)、替比夫定(telbivudine)及恩曲他滨(emtricitabine));脱氧鸟苷类似物(恩替卡韦(entecavir))及核苷膦酸酯(阿德福韦(adefovir)及替诺福韦(tenofovir))，其主要作为链终止剂直接干扰HBV DNA复制(2，3，4)。在HBeAg阳性患者中，当用以下药物治疗一年时病毒治疗应答率(无法检测到血清HBV DNA)为:peg-干扰素25% ;拉米夫定36%-40% ;恩替卡韦67% ;替比夫定60% ;替诺福韦74%(2)。一年后HbsAg损失极低-在O与3%之间。在HBeAg阴性CHB患者中，当用以下药物治疗一年时无法检测到HBV DNA的应答率为:peg-干扰素63% ;拉米夫定72% ;恩替卡韦90% ;替比夫定88% ;替诺福韦91%。使用任何直接抗病毒剂时，HBsAg损失为0%。当前可获得的治疗为次优的且需要更佳疗法以满足CHB的治疗 目标。干扰素治疗的关键限制为显著的副作用、HBV DNA抑制速率低及ALT正常化速率低；使用直接抗病毒剂的治疗的关键限制为:抗性发展；在停止疗法之后HBV复制重新开始，因而需要长期(终生)疗法；HBsAg清除速率极低；使用长期(终生)疗法时发生不良事件的风险增大。
[0007]一部分慢性HBV感染(血清HBsAg阳性)患者将共感染丁型肝炎病毒(HDV)。HDV为具有单链环状RNA基因组的缺陷病毒，其仅可联合乙型肝炎病毒一起引起急性或慢性肝脏疾病(I)。由HDV RNA表达的唯一蛋白为丁型肝炎抗原，其为病毒的核衣壳。HDV并不编码其自身包膜蛋白(HBsAg)且必须自乙型肝炎病毒“借”该包膜蛋白。因此，感染HDV仅发生在HBV存在时-与HBV同时(共感染)或随后发生，感染的持续时间由HBsAg阳性的持续时间确定。在HBsAg阳性患者中，HDV主动感染是由在血清中检测到HDV RNA、对肝细胞中的丁型肝炎抗原进行免疫组织化学染色、或在血清中检测到IgM抗HDV而证实(2)。
[0008]在世界范围内，HDV在地中海国家、南非及中非地区及南美具有最高地域分布。估计所有乙型肝炎病毒携带者中有5%感染HDV(5)。在HBV流行率低的国家(诸如北美及北欧)，HDV感染主要局限于处于非经肠HBV暴露风险中的人群，如静脉内药物使用者。自具有高HDV地域性的地区移民已使若干欧洲国家的流行率增加，最近在慢性HBV患者中占约10%。
[0009]慢性丁型肝炎的唯一批准疗法为结果不能令人满意的干扰素α。添加利巴韦林至干扰素中并不改善应答。阻断HBV复制的直接抗病毒剂显示对HDV复制无影响。与单独干扰素相比，干扰素加上拉米夫定或干扰素加上阿德福韦的组合并不改善应答(2，3，6)。因此，慢性丁型肝炎的治疗仍为主要的未满足的医学需要，因为HDV诱发的肝脏损坏会引起肝硬化、肝脏失代偿及在一些情况下由于肝衰竭而死亡。
[0010]因此，本发明的目标为提供治疗仅具有乙型肝炎病毒感染的患者或具有乙型肝炎病毒及丁型肝炎病毒感染及通过此类感染诱发的肝脏疾病或病症(诸如慢性肝炎、肝硬化、肝脏失代偿及HCC)的患者的新方法。[0011]我们已意外发现亲环蛋白抑制剂(尤其阿拉泊韦)具有针对乙型肝炎病毒的抗病毒性质，其可有效地用于治疗HBV感染。尤其是，我们已发现阿拉泊韦会消除(或干扰)HBV复制且减少肝细胞中HbsAg产生。此外，亲环蛋白抑制剂(尤其阿拉泊韦)也可用于治疗慢性丁型肝炎。
[0012]因此，本发明提供使用阿拉泊韦的新的抗HBV及抗HDV治疗。
[0013]此外，本发明提供治疗患者中HBV及/或HDV感染及所诱发肝脏疾病的方法，其包含单独施用或与直接抗病毒剂或干扰素_α组合施用有效量的亲环蛋白抑制剂(尤其阿拉泊韦)。本发明进一步提供用于治疗HBV感染及相关肝脏疾病且也用于治疗感染HBV及HDV的患者及相关肝脏疾病的阿拉泊韦。
【发明内容】
[0014]进一步地，描述 以下内容:
[0015]1.1.一种治疗患者中乙型肝炎病毒感染及HBV诱发病症的方法，其包含向该患者施用阿拉泊韦。
[0016]1.2.一种抑制HBV复制及HBsAg产生的方法，其包含施用阿拉泊韦。
[0017]1.3.一种治疗患者中的丁型肝炎病毒感染及HDV诱发病症的方法，其包含向该患者施用阿拉泊韦。
[0018]1.4.一种抑制HDV复制及HBsAg产生的方法，其包含施用阿拉泊韦。
[0019]1.5.一种减少HBV或HDV诱发的肝脏损坏及减少肝脏细胞死亡的方法，其包含施用阿拉泊韦。
[0020]1.6.一种使血清ALT含量正常化的方法，其包含施用阿拉泊韦。
[0021]1.7.一种减轻或消退肝脏炎症的方法，其包含施用阿拉泊韦。
[0022]2.阿拉泊韦在制备用于如以上所定义的任何方法中的药物组合物的用途。
[0023]3.阿拉泊韦在制备用于如以上所定义的任何方法中的药物的用途。
[0024]4.阿拉泊韦与抑制HBV复制的直接抗病毒剂组合在制备用于如以上所定义的任何方法的药物的用途。
[0025]5.阿拉泊韦与干扰素组合在治疗HBV感染及相关肝脏疾病的患者及感染HBV及HDV及相关肝脏疾病的患者中的用途。
[0026]附图简要说明
[0027]图1显示用5微克/毫升浓度的阿拉泊韦观察到细胞内HBV DNA含量明显下降(于72小时下降10倍)。
[0028]如图2中可见，当与ΝΜ811的作用相比时，5.0微克/毫升浓度的阿拉泊韦在减少细胞培养上清液中的HBV DNA含量中显示更大作用。
[0029]图3说明在DEB025存在下，自经瞬时转染细胞(Huh7)或自经稳定转染(HepG2215)细胞分泌的HBV DNA呈现剂量依赖性减少。
[0030]图4说明在DEB025存在下，在Huh7及H印G2215细胞中的细胞质HBV DNA呈现剂量依赖性减少。
[0031]图5说明在DEB025 (DEB)、替比夫定(TELB)及DEB+TELB存在下H印G2215细胞中分泌的HBV DNA减少。[0032]图6说明在DEB025(DEB)、替比夫定(TELB)及DEB+TELB存在下，！fepG2215细胞中的细胞HBV DNA减少。
[0033]发明详细描述
[0034]如本文中所用，“乙型肝炎病毒感染患者”意指感染任何乙型肝炎病毒基因型(例如基因型A、B、C、D等)的患者。在一些实施例中，患者感染丁型肝炎病毒。在一些实施例中，乙型肝炎病毒感染患者可也感染丁型肝炎病毒。
[0035]在本发明中，干扰素可为聚乙二醇化或非聚乙二醇化的且可包括如下干扰素，诸如:Intron-A?，干扰素 a-2b (Schering Corporation, Kenilworth, NJ) ;PEG_ Intron?，peg 干扰素 a-2b (Schering Corporlntrontion, Kenilworth, NJ) ; Roferon?,重组干扰素 a -2a(Hoffmann-La Roche, Nutley, NJ) ； Pegasys?，peg 干扰素 a-2a(Hoffmann-LaRoche, Nutley, NJ) ； Berefor?，可获得的干扰素 α 2 (Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc., Ridgefield, CT) ； Sumiferon?，天然 α 干扰素的经纯化惨合物(Sumitomo, Japan) ； Wellferon?，淋巴细胞样干扰素 a nl (GlaxoSmithKline)；Intergen?，复合 α 干扰素(InterMune Pharmaceuticals, Inc.，Brisbane, CA 及Amgen, Inc., Newbury Park, CA) ； Alferon.?,天然 α 干扰素的混合物(InterferonSciences 及 Purdue Frederick C0., CT) ； Viraferon?；及此类干扰素的组合。
[0036]可使用的缀合干扰素包括例如与人类白蛋白缀合的Albuferon(Human GenomeScience)。干扰素与诸如聚 乙二醇(PEG)或聚丙二醇、聚氧乙烯化多元醇的水溶性聚合物或聚烷醚均聚物、其共聚物及其嵌段共聚物缀合。作为基于聚烷醚的聚合物的替代物，可有效使用非抗原性材料，诸如葡聚糖、聚乙烯吡咯啶酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、基于碳水化合物的聚合物及其类似物。干扰素-聚合物结合物描述于US4766106、US4917888、EPA O 236987,EPA O 510 356及W095/13090中。由于聚合修饰充分地降低抗原应答，故外来干扰素无需为完全自体的。用于制备聚合物缀合物的干扰素可自哺乳动物提取物(诸如人类、反刍动物或牛干扰素)制备或重组产生。其他形式的干扰素包括干扰素β、Y、τ及ω，诸如由Serono制造的Rebif (干扰素β Ia)、由Viragen制造的Omniferon (天然干扰素)或由Boehringer Ingelheim制造的ω干扰素。口服干扰素，诸如由Amarillo Biosciences制造的口服干扰素α。
[0037]可使用的干扰素的其他实例包括聚乙二醇化干扰素α，例如聚乙二醇化干扰素a -2a、聚乙二醇化干扰素a _2b、聚乙二醇化复合干扰素或聚乙二醇化纯化干扰素-α产物。聚乙二醇化干扰素a-2a描述于欧洲专利593，868(以全文引用的方式并入本文)中，且可以例如商标名PEGASYS? (Hoffmann-La Roche)购得。聚乙二醇化干扰素a _2b描述于例如欧洲专利975，369 (以全文引用的方式并入本文)中，且例如以商标名PEG-1NTRON A? (Schering Plough)购得。聚乙二醇化复合干扰素描述于W096/11953 (以全文引用的方式并入本文)中。
[0038]在优选实施例中，在本发明方法中所用的干扰素为聚乙二醇化干扰素。在其他实施例中，干扰素选自干扰素a-2a、干扰素a _2b、复合干扰素、经纯化干扰素α产物或聚乙二醇化干扰素a _2a、聚乙二醇化干扰素a-2b及聚乙二醇化复合干扰素、天然α的混合物及其组合。
[0039]使用干扰素α的方法优选使用聚乙二醇化干扰素a _2b，且聚乙二醇化干扰素a -2b的量为以每周、一周三次、每隔一天或每天计每周0.5微克/公斤至2.0微克/公斤。
[0040]如本文中所用，“微克/公斤”意指每公斤欲治疗哺乳动物(包括人类)的体重以微克计的药物。
[0041]如本文中所用，术语“治疗(treatment/treat) ”是指防治性或预防性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包含治疗处于感染疾病的风险中或疑似已感染疾病的患者以及生病或已经诊断为患有疾病或医学病状的患者，且包括抑制临床复发。可向具有医学病症或最终可患该病症的个体施用治疗，以预防病症或复发病症、治愈病症或复发病症、延迟其发作、减轻其严重程度或改善其一或多种症状，或者以延长个体的存活至超出未使用该治疗时的预期存活。
[0042]“治疗方案”意指疾病的治疗模式，例如HBV疗法期间所用的给药模式。治疗方案可包括诱导方案及维持方案。
[0043]词组“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病的初始治疗的治疗性方案(或治疗性方案的一部分)。诱导方案的一般目标为在治疗方案的初期期间 向患者提供高含量的药物。诱导方案可(部分或完全)使用“载药方案”，其可包括施用比医师在维持方案期间会使用的剂量更大剂量的药物、比医师在维持方案期间施用药物更频繁地施用药物或两者皆有。
[0044]词组“维持方案”或“维持期”是指在治疗疾病期间用于维持患者的治疗性方案(或治疗性方案的一部分)，例如以便使患者长时间(数月或数年)保持缓解状态。维持方案可使用连续疗法(例如以规则时间间隔(例如每周、每月、每年等)施用药物)或间歇疗法(例如间断治疗、间歇治疗、复发时治疗或达到特定预定标准[例如疼痛、疾病表现等]后治疗)。
[0045]如本文中所用，除非上下文另有指示，否则使用术语“约”意指+10%或-10%的范围。
[0046]在其他实施方案中，干扰素α为聚乙二醇化干扰素a _2a，且所施用聚乙二醇化干扰素a -2a的量为以每周、一周三次、每隔一天或每天计，每周20微克/公斤至250微克/公斤。干扰素peg_IFNa2a优选以180微克的量每周施用一次。
[0047]在特定实施方案中，在本文方法中使用的示例性干扰素为选自以下的干扰素:Intron-A? ；:PEG-1ntron? ； Roferon? ； Pegasys? ; Bereibr? ； Sumiferon? ;
Wellferon i< Infergen? ； Alferon? ； Viraferon? ； Albuferon? (Human GenomeScience) ；Rebif ；Omniferon ;0mega 及其组合。
[0048]在一些实施方案中，使用阿拉泊韦来治疗患者中的乙型肝炎病毒感染及/或治疗患者中的丁型肝炎病毒感染。在另一方面，阿拉泊韦与直接抗病毒剂或干扰素组合施用。
[0049]在一些其他实施方案中，描述一种治疗患者中的乙型肝炎病毒感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韦及任选地向患者施用干扰素或直接抗病毒剂。在另一方面，阿拉泊韦用于改善肝脏炎症、减少肝脏细胞死亡(如通过ALT含量所评估)及预防肝脏疾病的进展。[0050]在另一实施方案中，描述了用于本文所披露的任何方法的包含阿拉泊韦的药物组合物，及包含该药物组合物以及施用该组合物的说明书的包装。
[0051]在另一实施方案中，阿拉泊韦可与其他促进疗法治疗的抗病毒功效的标准治疗药剂一起施用。
[0052]本文中使用直接抗病毒剂来意指干扰乙型肝炎病毒(HBV)复制周期中的特定步骤的药剂。抑制HBV复制的直接抗病毒剂可为例如任何当前批准用于治疗HBV的抗HBV药剂，也即替比夫定、拉米夫定、恩曲他滨、恩替卡韦、阿德福韦及替诺福韦。
[0053]在上述治疗中，有效剂量的标准治疗药剂以组合物形式施用，也即其可一起(也即同时)施用，但也可独立或依序施用。一般而言，组合疗法通常一起施用，基本原理为该同时施用在病毒上诱发同时多重压力。给定的特定剂量将取决于药物的吸收、失活及排泄率以及其他因素。应注意，剂量值也将随欲减轻的病状的严重程度而变化。如本文中所用，术语“共施用”或“组合施用”或“与...组合施用”或其类似术语意在涵盖向单一患者施用所选治疗剂，且意欲包括药剂不必通过同一施用途径或在同一时间施用的治疗方案。固定组合也属于本发明的范畴内。与仅应用一种药学活性成分的单一疗法相比或与当前的标准治疗疗法相比，施用本发明的医药组合会产生有益效果，例如协同或加成治疗效果。本文所述方法中所用的治疗可通过任何常规途径施用。一或多种组分可非经肠施用，例如呈可注射溶液或悬浮液的形式或呈可注 射沉积制剂的形式。阿拉泊韦优选将以胶囊、片剂或供饮用溶液或悬浮液的形式经口施用。包含阿拉泊韦的供经口施用的药物组合物通常另外包含一或多种药学上可接受的载体物质。此类组合物通常为浓缩的且施用之前需要与适当稀释剂(例如水)组合。供非经肠施用的药物组合物通常也包括一或多种赋形剂。任选的赋形剂包括等张剂、缓冲剂或其他PH控制剂及防腐剂。可添加此类赋形剂以便维持组合物及获得优选范围的PH值(约6.5-7.5)及容积渗透浓度(约300mOsm/L)。
[0054]如本文中所描述的阿拉泊韦是以单一剂型或一种以上剂型施用；可每天每次施用一或多种经口剂型。在一些实施方案中，阿拉泊韦是以200mg至IOOOmg的剂量施用。
[0055]可使用标准方案监测治疗方案的功效。治疗后可测定血清中的HBV含量及量测血清ALT含量。举例而言，可评估患者血清中HBV DNA的存在。在治疗期间可以规则时间间隔量测HBV DNA(IU/mL)，例如在第I天(给药前及给药后4、8及12小时)及在第2天、第3天、第8天、第15天、第29天给药前及在第12周、第24周、第36周、第48周、第72周(若适用)及在追踪时。
[0056]将使用国际上接受的参数(2，3，4)监测疗法的功效:
[0057]1.1.监测具有乙型肝炎病毒的患者中的应答
[0058]a)使用基于灵敏定量PCR的分析监测血清HBV DNA含量以评估对病毒复制的影响。
[0059]b)在HBeAg阳性患者中-HBeAg连同相应抗HBe —起经监测以确定是否已发生HBe-血清转化。
[0060]c)监测血清ALT及/或AST含量以评估对肝脏炎症及肝脏细胞死亡的影响。
[0061]d)监测血清HBsAg-定性及定量，因为HBsAg清除将指示最佳治疗结果。
[0062]e)赋予对所用治疗的抗性的HBV基因组中的突变的发展。
[0063]1.2监测具有丁型肝炎病毒的患者中的应答。除以上所列用于HBV感染的标记外，也将使用以下HDV特异性测试:
[0064]a)监测血清HDV RNA含量以评估对丁型肝炎病毒复制的影响。
[0065]b)通过免疫组织化学在肝脏组织中检测到D抗原可提供其他指示正在进行的HDV复制的信息。
[0066]以下实施例说明上文中描述的本发明。
实施例
[0067]实验设计及人类细胞株:
[0068]实验已使用若干已确定为活体外研究乙型肝炎病毒或丁型肝炎病毒生命周期的模型的源自人类肝细胞瘤的细胞株:HepG2及HuH-7 (HBV阴性)、PLC/PRF/5 (HBV阳性，仅产生HBsAg)及H印G2.2.15 (HBV阳性，支持完全HBV复制)，且评估各种化合物对病毒复制及病毒蛋白质生成的影响。
[0069]A)研究亲环蛋白抑制剂尤其是DEB025(阿拉泊韦)对乙型肝炎病毒复制及HBsAg生成的抗病毒活性
[0070]HeDG2215细朐株(源自HepG2细朐)经HBV DNA稳定转染且支持完全HBV复制，产生感染性病毒粒子及HBsAg。如先前所述(7，8)，添加亲环蛋白抑制剂之前在12孔培养盘中培养H印G2215细胞7天。
[0071]以0.25微克/毫升、1.0微克/毫升或5.0微克/毫升的NM811或DEB025处理细胞；在基线、分别添加NM811或DEB025后的6、24、48及72小时分别采集细胞及上清液。
[0072]为评估亲环蛋白A在HBV复制中的作用，用针对亲环蛋白A的&1?嫩转染!1印62215细胞且仅用培养基或用添加NM811或DEB025的培养基培育。类似地，将通过对亲环蛋白B、C及D具特异性的siRNA评估CypB、C及D在HBV及HDV复制中的作用。
[0073]用含有具有亚型adw2的L 5个HBV DNA基因组的pBlueScript KS (+)载体的质粒转染 HuH-7 细胞。使用 10 μ I Superfect 试剂(Qiagen, Crawley, UK)以每个 60_mm 直径培养皿5 μ g质粒DNA转染亚汇合HuH-7细胞。如(7)所述，转染后18小时用补充有10%FCS的培养基替代上清液，且培养细胞3天。
[0074]PLC/PRF/5细朐(Alexander细朐株)含有经糖合的HBV DNA片段且仅产生HBsAg，但不支持完全HBV复制(9)。其类似于作为非活性HBsAg携带者的患者(也即慢性HBV感染的非复制阶段)中的肝细胞。采用该细胞株以特定地评估亲环蛋白抑制剂独立于完全病毒粒子产生对HBsAg生成的影响。
[0075]结果
[0076]I)图1:亲环蛋白抑制剂NM811及DEB025均使细胞内HBV核衣壳关联的HBV DNA含量降低。与NM811或DEB025不存在下的H印G2215细胞相比，HBV DNA减少在2倍与10倍之间。观察到使用DEB025 (5微克/毫升)时细胞内HBV DNA含量最显著减少(72小时的时减少10倍)，其大于使用NIM811在72小时观察到的减少。
[0077]2)图2:与NIM811的作用相比时，DEB025 (5.0微克/毫升)在减少细胞培养上清液中的HBV DNA含量中显示更大作用。
[0078]B)研究亲环蛋白抑制剂尤其是DEB025(阿拉泊韦)对丁型肝炎病毒复制的抗病毒[0079]丁型肝炎病毒(HDV)的感染始终与辅助病毒-乙型肝炎病毒的存在有关。该依赖性的基础为HBV包膜蛋白是HDV进入肝细胞及新HDV粒子装配所需要的。一旦进入易感染细胞内部，HDV的单链环状RNA基因组可使用宿主RNA聚合酶的再定向通过RNA定向的RNA合成而复制。活体外，可研究不存在辅助HBV的情况下所培养细胞株内的HDV基因组复制。举例而言，当细胞经HDV序列的cDNA形式转染时引发复制(10)。此外，可通过与针对SAg的mRNA—起共转染HDV RNA来满足需要(11)。
_0] C)研究亲环蛋白抑制剂(特别是DEB025(阿拉泊韦))与靶向HBV-DNA聚合酶的肓接抗病毒剂(替比夫定)的组合对乙型肝炎病毒复制的抗病毒活性
[0081]用一定浓度范围(0.25微克/毫升、1.0微克/毫升、5.0微克/毫升或20微克/毫升)的单独的阿拉泊韦、单独的替比夫定或阿拉泊韦与替比夫定的组合处理产生完全HBV病毒粒子及HBsAg粒子的经稳定转染0fepG2215)及经瞬时转染(HUH-7)的细胞。为确定各亲环蛋白的参与性，用对亲环蛋白(Cyp) A、C或D具特异性的siRNA转染!fepG2215细胞且另外用阿拉泊韦处理此类细胞。在基线、处理后24、48及72小时采集细胞质提取物及上清液。通过定量细胞内及分泌的HBV-DNA(实时qPCR)及HBsAg含量(ELISA)评估抗病毒活性的动力学。
[0082]在H印G2215及HUH-7细胞中，阿拉泊韦处理法在所有时间点均导致细胞内及分泌的HBV-DNA的剂量依赖性减少，与未经处理的对照相比分别减少70% (p=0.004)及63%(ρ〈0.001)。阿拉泊韦与替比夫定的组合在减少细胞内(ρ=0.001)及分泌的(ρ=0.028)HBV-DNA中具有更大作用，且相较于单独的阿拉泊韦或替比夫定，HBsAg的减少>3倍。在用相应siRNA转染后，CypA, C或D表现明显降低，其与HBV-DNA及HBsAg含量明显下降(ρ〈0.001)有关。阿拉泊韦处理CypA、C或D的沉默细胞使HBV-DNA及HBsAg含量进一步降低，在CypC或CypD沉默细胞中的抗病毒作用大于CypA沉默细胞(silenced cell)(ρ〈0.001)。`
[0083]此类结果显示，阿拉泊韦干扰多个位点的HBV复制，且其抗病毒活性与靶向病毒DNA聚合酶的直接抗病毒剂(诸如替比夫定)具有协同作用。
[0084]1.细胞培养及转染
[0085]如此前所述(12)，在补充有10%胎牛血清、青霉素及链霉素的DMEM培养基(Dulbecco's modified Eagle’s medium)中培养人类肝癌细胞株 HuH7 且在 37°C 下 5%C02中培育。对于转染研究，在6孔培养盘或60-mm直径petri培养皿中接种细胞培养物一夜，且根据制造商的说明书使用DMRIE-C试剂(Gibco BRL)分别用5 μ g及10 μ g的HDAg mRNA与HDV RNA(基因组长度的1.2倍)的50:50混合物转染。在转染后，培育培养物一夜，更换培养基，且继续培育长达再2至7天。
[0086]2.定量细胞质及细胞上清液中的HBV DNA
[0087]如先前所述(8，9)，通过定量细胞培养上清液中的病毒核衣壳关联HBV DNA (细胞质)及HBV DNA含量评估HBV复制。提取核衣壳HBV DNA且通过TaqMan实时PCR (ABIPrism7700)定量。使用b肌动蛋白作为看家基因(house-keeping gene)使细胞内HBVDNA正常化。用QIAmp DNA微型试剂盒(Qiagen, Sussex, UK)提取分泌的HBV DNA且也通过TaqMan定量。如(9，10)所描述，用HBV DNA质粒的连续稀释液以及EuroH印HBV DNA标准物验证每一操作中HBV DNA定量的灵敏度。[0088]3.HBsAg 定量
[0089]使用已知量的HBsAg的连续稀释液以Elisa(Abazyme, Needham, MA)定量细胞培养上清液(来自2215及PLC/PRF/5细胞)中的HBsAg含量(9)。
[0090]4.SiRNA 转染
[0091]使用siRNA (Dharmacon Inc., Lafayette, CO)以 50% 密度接种 HepG2215 细胞且培育48小时。随后，洗涤细胞且添加NM811或DEB025(BL)。在6小时、24小时(更换培养基)及48小时收集细胞及上清液样品。如上所述，自样品中提取总DNA且通过实时PCR定量HBV DNA。总RNA以苯酹、氯仿提取。用Quantitect逆转录试剂盒(Qiagen)逆转录RNA 且用 SYBR Green Quantitect 试剂盒使用 Quantitect 引物(Qiagen, Sussex, UK)定量cDNA。
[0092]5.HBsAg的免疫印迹分析
[0093]48小时后，以胰蛋白酶处理细胞(PLC/PRF/5或H印G2215细胞)并在磷酸盐缓冲生理食盐水中洗涤两次且再悬浮于溶解缓冲液中。如所描述立1，在单克隆抗HBsIgG存在或不存在下培养的细胞中，通过western印迹法分析PLC/PRF/5细胞中人类IgG及HBsAg的存在。
[0094]6.丁型肝炎RNA的体外转录
[0095]如先前所描述(13)，在用限制酶NotI线性化后，用T7MEGAscript试剂盒(Ambion)自质粒 pBS δ 1.2G、pBS δ 1.2AG、pBS δ 1.2G(2xS)及 pBS δ 1.2AG(2xS)转录 1.2倍基因组长度的HDV RNA0在用HindIII线性化后，通过使用T7m-Message m_Machine试剂盒(Ambion)自质粒pX9_I/II转录HD Ag的加帽mRNA (Capped mRNA)。在通过PstI消化线性化后，用T7MEGAscript自ρΤΜ δ SalA及ρΤΜ δ SalB转录未经标记单体基因组及反基因组HDV RNA。
[0096]7.HDV RNA 的 Northern 分析
[0097]使用QIAamp病毒RNA微型试剂盒(QIAGEN, Valencia, Calif)根据制造商的说明书纯化来自接种物或血清的病毒RNA(14，15)。接着在1.9M乙二醛(FisherScientific, Fair Lawn, N.J) -7.1mM 磷酸钠(ρΗ6.8)-4.5mM EDTA_35%DMS0 存在下，在 55°C下培育各种量的RNA50分钟。接着将样品加至含有IOmM磷酸钠(pH6.8)的1.5%琼脂糖凝胶上，且在150mA下经电泳4小时。对于上清液，使用一半RNA，而对于细胞RNA，加样5μ g。RNA经毛细管转移隔夜至ξ探针(Bio-Rad，Richmond，Calif)膜。转移后，烘烤或使用Stratalinker (Stratagene)UV交联该膜。如详细描述(15),使印迹杂交。杂交后,在70°C下相继用 400ml2XSSPE-0.1%SDS,400ml I X SSPE-0.1%SDS 及 200ml0.1 X SSPE-0.1%SDS 洗漆印迹。在70°C下干燥该膜且使其经受自动放射线成像及磷屏成像(Molecular Dynamics)分析。
[0098]8.血清样品中的实时PCR定量(如先前所述(16))
[0099]HDV RNA是通过使用QIAamp MinElute病毒真空装置(QIAGEN, Courtaboeuf, France)自250 μ I血清或血衆提取。如先前所述，合成cDNA且用Montage PCR 离心过滤装置(Millipore, Molsheim, France)纯化。
[0100]选择正向引物靶向基因组的核酶区域，且反向引物靶向反基因组核酶的区域I。杂交至与反向引物相同的区域的探针经设计以与反基因组序列退火，以避免与反向引物碱基配对。引物及探针的名称及序列如下:Delta-F(正向引物)，5’-GCATGGTCCCAGCCTCC-3’ ；Delta-R(反向引物)，5’-TCTTCGGGTCGGCATGG-3’ ；及Delta-P (探针)，5’ -FAM-ATGCCCAGGTCGGAC-MGB-3’。由于存在与 HDV-3 基因组序列的一个错配，特别设计以下第二直接引物用于扩增HDV-3分离株:T3-Delta-F，5’ -GCATGGCCCCAGCCTCC-3’。
[0101]通过使用TaqMan通用PCR母板混合物(AppliedBiosystems, Courtaboeuf, France)执行实时PCR。反应由一个5(TC下2分钟的起始步骤、随后95°C下10分钟及接着包括95°C下15秒及60°C下I分钟的45个扩增循环组成。用ABI PRISM7000序列检测系统(Applied Biosystems, Courtaboeuf, France)执行反应、数据获取及分析。
[0102]参考文献:
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【权利要求】
1.用于治疗患者中乙型肝炎病毒感染的阿拉泊韦。
2.用于治疗患者中丁型肝炎病毒感染的阿拉泊韦。
3.如权利要求1或2所述用途的阿拉泊韦，其中阿拉泊韦与直接抗病毒剂组合施用。
4.如权利要求1或2所述用途的阿拉泊韦，其中所述直接抗病毒剂选自基本上由替比夫定、拉米夫定、恩曲他滨、恩替卡韦、阿德福韦及替诺福韦组成的群。
5.如权利要求1或2所述用途的阿拉泊韦，其中阿拉泊韦与干扰素组合施用。
6.用于治疗患者中乙型肝炎病毒感染及丁型肝炎病毒感染的阿拉泊韦。
7.如权利要求6所述用途的阿拉泊韦，其中阿拉泊韦与直接抗病毒剂或干扰素组合施用。
8.治疗患者中乙型肝炎病毒感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韦，及任选地向该患者施用干扰素或直接抗病毒剂。
9.治疗患者中感染丁型肝炎病毒的感染的方法，其包括施用有效量的阿拉泊韦，及任选地向该患者施用干扰素或直接抗病毒剂。
10.预防患者中肝脏疾病进展的方法，其包括施用阿拉泊韦。
11.药物组合物，其 包含如权利要求1至7中任一项所述用途的阿拉泊韦。
【文档编号】A61K38/13GK103458913SQ201280017298
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年3月30日 优先权日:2011年4月1日
【发明者】N·纳乌莫夫 申请人:诺华股份有限公司