用于小体积施用的同种异型选择的抗体的超滤浓缩的制作方法
【专利摘要】本文公开了高浓度抗体或免疫球蛋白制剂用于以小于3ml、小于2ml或小于1ml的体积而皮下施用、肌肉内施用、经皮肤施用或其它局部(区域性)施用的方法、组合物以及用途。优选地，所述制剂含有pH为约5.2的高浓度制剂(HCF)缓冲液，所述缓冲液包含磷酸盐、柠檬酸盐、聚山梨酯80以及甘露醇。所述制剂更优选地包含至少100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或300mg/ml的抗体。用于制备所述高浓度制剂的方法包括超滤和渗滤以浓缩所述抗体并且将培养基交换成HCF缓冲液。其它实施方案涉及非G1m1(nG1m1)同种异型抗体如G1m3和/或nG1m1,2抗体的用途。与G1m1抗体相比，所述nG1m1抗体显示出减小的免疫原性。
【专利说明】用于小体积施用的同种异型选择的抗体的超滤浓缩
[0001]发明 人:Li Zeng、Rohini Mitra、Edmund A.Rossi> Hans J.Hansen、DavidM.Goldenberg
[0002]相关申请
[0003]本申请根据美国法典第35篇第119条(e)款要求2011年5月2日提交的临时美国专利申请序号61/481，489和2011年7月20日提交的临时美国专利申请序号61/509，850的权益。
[0004]序列表
[0005]本申请含有一个序列表，所述序列表已经由申请系统(EFS-Web)以ASCII格式提交并且特此以引用的方式整体并入。于2012年4月27日创建的所述ASCII副本命名为IMM332W0.txt并且大小为26，386字节。
发明领域
[0006]本发明涉及免疫球蛋白、抗体和/或抗原结合抗体片段的稳定的、高度浓缩的制剂的组合物和生产方法以及用途。在优选的实施方案中，免疫球蛋白、抗体或其片段可以是非特异性的人免疫球蛋白(例如，IVIg);结合抗原的抗体，如结合CD22的抗体(例如，依帕珠单抗(epratuzumab))、结合0)20的抗体(例如，维妥珠单抗(veltuzumab) ；GA101)、结合⑶74的抗体(例如，米拉珠单抗(miIatuzumab))或结合HLA-DR的抗体(例如，IMMU-114或hL243)，虽然可以使用对抗其它抗原性靶标的抗体。在更优选的实施方案中，抗体或其片段的同种异型被选择为非Glml人同种异型，如Glm3。甚至更优选的是nGlml，2无效同种异型。抗体或其片段可以是裸露的(未缀合的)或可以与至少一种治疗剂或诊断剂缀合，所述治疗剂或诊断剂不是细胞毒性剂或放射性核素。浓缩的抗体制剂对各种疾病的治疗有用，所述疾病如自身免疫性疾病、免疫失调疾病、感染性疾病、癌症(例如，癌瘤、肉瘤、黑素瘤、神经胶质瘤、成神经细胞瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤、T-细胞淋巴瘤或白血病、多发性骨髓瘤或非霍奇金淋巴瘤)、心血管疾病、神经疾病或代谢疾病。在其它的优选实施方案中，浓缩的抗体制剂可以通过皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用来施用，虽然涵盖其它的施用方式(例如，鞘内、腹膜内、眼内、颅内等等)。在最优选的实施方案中，抗体或其片段在微酸性的水性缓冲溶液中被浓缩到至少80mg/ml、更优选地至少100mg/ml、更优选地至少125mg/ml、更优选地至少150mg/ml、更优选地至少175mg/ml、更优选地至少200mg/ml、更优选地至少225mg/ml、更优选地至少250mg/ml、更优选地至少300mg/ml。所述制剂的其它组分可以包括:缓冲剂，如柠檬酸盐或磷酸盐；盐，如氯化钠；表面活性剂，如聚山梨酯80 ;和/或多元醇，如甘露醇。
[0007]背景
[0008]已经提议施用单克隆抗体或其片段用于诊断和/或治疗各种各样的疾病状态，如癌症、感染性疾病、自身免疫或免疫功能障碍疾病、神经疾病、心血管疾病以及代谢疾病。(参见，例如 Nadler 等,1980, Cancer Res 40:3147-54 ；Ritz 和 Schlossman, 1982, Blood59:1-11 ；ffaldmann, 2003, Nature Med 9:269-77 ；Ibbotson 等，2003，Am J CardiovascDrugs 3:381-86 ；Domer 等，2009，Nat Rev Rheumatol 5:433-41 ;Pul 等，2011，ExpertOpin Biol Ther 11:343-57)。还具体来说通过皮下注射而使用人免疫球蛋白混合物用于治疗肝炎以及通过静脉内输注用于治疗各种自身免疫性疾病(参见，例如Powell 等，2006，Clin Transplant 20:524-25 ；Stiehm, 1997, Pediatr Infect Dis J16:696-707 ;Zandman 等，Clin Rev Allergy Immunol [2011 年 7 月 6 日的印刷前电子出版物];Kaveri 等，2011，Clin Exp Tmmunol 164:2-5)。
[0009]虽然静脉内输注已经是抗体施用的标准方式，但是输注相关的反应(如皮疹、荨麻疹、红斑、瘙痒、低血压、支气管痉挛或过敏)可能是严重的并且会明显限制抗体输注的速率。(参见，例如 Kang 和 Saif, 2007.J Supportive Oncol 5:451-57 ；Vogel, 2010, ClinJ Oncol Nursingl4:E10-21)o在某种程度上为了解决输注相关反应的发生，已经提议皮下施用治疗性抗体(Lundin 等,2002, Blood 100:768-73 ；Kavanaugh 等,ArthritisRheum，2009，60:976-86 ;Negrea 等，2011，Haematologica96:567-73)。还给出肌肉内施用，如对于 IVIg 而言(Marzano 等，2010，Minerva Med 101:373-83 ；PauweIyn等，2010，Transplant Proc42:4399-402 ;Filipponi 等，2010，Dig Liver Dis 42:509-14)。另一种替代方案是经皮肤施用(例如，Burton等，2011，Pharm Res 28:31-40 ；ffendorf等，2011，Pharm Res 28:22-30 ;Koutsonanos 等，2009，PLoS One 4:e4773)。虽然输注部位反应可能仍然发生，但是皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用将通过避免对长时间的静脉内施用及专用的输注套房和工作人员的需要而产生减少的医疗保健成本，并且还可能减少全身性输注反应的发生(Lundin 等，2002.Blood 100:768-73 ；ffasserman, 2008, PatientPreference and Adherence, 2:163-66 ;Negrea等，2011，Haematologica 96:567-73),以及是对患者更耐受和方便的(包括自我施用的可能性)。因为与皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用相关的较低注射体积，所以存在对长期稳定的并且可以被皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用(或通过要求小体积注射液的其它路径而施用)的更浓缩的抗体或免疫球蛋白制剂的需要。
[0010]概述
`[0011]本发明涉及治疗性免疫球蛋白、单克隆抗体或其抗原结合片段的稳定的、高度浓缩的制剂的组合物和生产方法以及用途；和用于低体积注射的用途。虽然本领域中已知许多的抗体生产方法并且可以使用这些方法，但优选地是将编码抗体或片段的表达载体转染至哺乳动物细胞系如SpEEE, SpESF或SpESF-X中(参见，例如美国专利号-J, 531，327 ；7，537,930 ;7，608，425 ;以及7，785, 880 ;每一个所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。更优选地，转染和抗体表达均发生在无血清的培养基中，以减小生产费用并且去除污染性蛋白质源。将抗体产生至细胞培养基中，用于进一步纯化。
[0012]在其它的优选实施方案中，可以通过连续色谱法、例如通过亲和柱色谱法和离子交换柱色谱法而从细胞培养基中纯化所述抗体。非限制性的实例包括在蛋白质A上的亲和色谱法、在Q-SEPHAR0SE⑧上的阴离子交换色谱法以及在SP-SEPHAR0SE ?上的阳离子交换色谱法。更优选地，使抗体在pH 5的柠檬酸盐缓冲液中结合至SP-SEPHAR0SE ?树脂，并且用含0.15M NaCl的pH 6的柠檬酸盐缓冲液从柱上洗脱下来。来自SP-SEPHAR0SE ?柱的洗出液可以通过例如用于病毒去除的20nm过滤器来过滤。纯化的抗体然后可以例如使用具有50KD MW截止过滤器的AMICON ?超滤单元来渗滤，以便将培养基交换成高浓度制剂缓冲液(HCF缓冲液)并且浓缩抗体用于储存。在最优选的实施方案中，HCF缓冲溶液可以包含磷酸盐缓冲液(pH 5.2)、氯化钠、聚山梨酯80、柠檬酸盐以及甘露醇。聚山梨酯80用来减少蛋白质聚集，而甘露醇使抗体在水性培养基中稳定。渗滤将抗体浓缩至优选地至少80mg/ml、更优选地至少100mg/ml、更优选地至少150mg/ml、更优选地至少200mg/ml、更优选地至少300mg/ml的最终浓度。浓缩的抗体展现出少的聚集或没有聚集，并且优选地在2°C至8°C下呈液体形式稳定至少10个月。在甚至更优选的实施方案中，聚山梨酯80在超滤步骤之后被添加至浓缩的抗体中。
[0013]稳定的、高度浓缩的抗体具有用于制备用于优选地通过皮下施用、经皮肤施用或肌肉内施用而向受试者施用的药剂的用途。然而，熟练的技术人员将认识到本领域中已知的其它施用形式，如可以使用静脉内施用、腹膜内施用、心室内施用、眼内施用和/或鞘内施用。
[0014]有用的抗体可以结合本领域中已知的任何疾病相关的抗原。在疾病状态例如是癌症的情况下，许多由肿瘤细胞表达或以另外的方式与肿瘤细胞相关的抗原是本领域中已知的，所述抗原包括但不限于:碳酸酐酶IX、α-胎蛋白、0-辅肌动蛋白-4^3、对么33抗体有特异性的抗原、ART-4、Β7、Ba 733、BAGE, BrE3-抗原、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8/m、CCCL19、CCCL21、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A, CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、CDC27、CDK_4/m、CDKN2A、CXCR4、CXCR7、CXCL12、HIF-1 α、结肠特异性抗原 p (CSAp)、CEA (CEACAM5)、CEACAM6、c_met、DAM、EGFR、EGFRvII1、EGP-U EGP-2、ELF2-M、Ep-CAM、Flt_l、Flt_3、叶酸盐受体、G250 抗原、GAGE、gplOO、GROB,HLA-DR、HMl.24、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和它的亚基、HER2/neu、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF-1)、HSP70-2M、HST-2、la、IGF-`1R、IFN-Y、IFN-α、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6,IL-8,IL-12,IL-15,IL-17,IL-18,IL-23,IL-25、胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)、KC4-抗原、KS-1-抗原、KS1-4、Le-Y, LDR/FUT、巨噬细胞游走抑制因子(MIF)、MAGE, MAGE-3、MART-1、MART-2、NY-ESO-U TRAG-3、mCRP、MCP-1、MIP-1A、MIP-1B、MIF、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC13、MUC16、MUM-1/2, MUM-3、NCA66、NCA95、NCA90、胰腺癌粘蛋白、胎盘生长因子、p53、PLAGL2、前列腺酸性磷酸酶、PSA、PRAME, PSMA,P1GF、ILGF、ILGF-1R、IL-6、IL-25、RS5、RANTES、T101、SAGE、S100、存活素、存活素 _2B、TAC、TAG-72、腱生蛋白、TRAIL 受体、TNF- α、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TR0P-2、VEGFR、ED-B纤连蛋白、WT-1、17-1A-抗原、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5a、补体因子C5、血管生成标记物、bcl_2、bcl_6、Kras、cMET、致癌基因标记物以及致癌基因产物(参见，例如Sensi等，Clin Cancer Res 2006，12:5023-32 ；Parmiani 等，J Tmmunol 2007， 178:1975-79 ;Novellino 等，Cancer Tmmunol Immunother2005，54:187-207)。优选地，抗体结合 CD74、CD20、CD22 或 HLA-DR0
[0015]可以使用的示例性抗体包括但不限于:hRl (抗IGF-1R，2010年3月12日提交的美国专利申请序号12/722,645)、hPAM4(抗粘蛋白，美国专利号7，282，567)、hA20 (抗CD20，美国专利号 7，251，164)、hA19 (抗 CD19，美国专利号 7，109，304)、hIMMU31 (抗 AFP，美国专利号7, 300，655)、hLLl (抗CD74，美国专利号7，312，318)、hLL2 (抗CD22，美国专利号 7，074，403)、hMu-9(抗 CSAp，美国专利号 7，387，773)、hL243 (抗 HLA-DR，美国专利号7,612，180)、hMN-14(抗 CEACAM5，美国专利号 6,676,924)、hMN-15 (抗 CEACAM6，美国专利号 7，541，440)、hRS7(抗 EGP-1，美国专利号 7，238，785)、hMN_3 (抗 CEACAM6，美国专利号7，541，440)、Abl24和Ab125 (抗CXCR4，美国专利号7，138，496)，每一个引用的专利或申请的实施例部分以引用的方式并入本文。更优选地，抗体是hA20 (维妥珠单抗)、hLL2 (依帕珠单抗)、hLLl (米拉珠单抗)或hL243 (IMMU-114)。
[0016]有用的替代抗体包括但不限于:阿昔单抗(abciximab)(抗糖蛋白IIb/IIIa);阿仑单抗(alemtuzumab)(抗 CD52);贝伐单抗(bevacizumab)(抗 VEGF)；西妥昔单抗(cetuximab)(抗EGFR);吉妥珠单抗(gemtuzumab)(抗CD33);替伊莫单抗(ibritumomab tiuxetan)(抗 CD2O);帕尼单抗(panitumumab)(抗 EGFR)；利妥昔单抗(rituximab)(抗0)20);托西莫单抗(tositumomab)(抗0)20);曲妥珠单抗(trastuzumab)(抗 ErbB2);阿巴伏单抗(abagovomab)(抗 CA-125);阿德木单抗(adecatumumab)(抗 EpCAM) ；atIizumab (抗 IL-6 受体)；贝那利珠单抗(benralizumab)(抗 CD125) ;CC49(抗 TAG-72) ;AB-PG1-XG1_026 (抗 PSMA,美国专利申请 11/983，372，保藏为 ATCC PTA-4405 和 PTA-4406) ；D2/B(抗 PSMA，WO 2009/130575);托珠单抗(tociIizumab)(抗 IL-6 受体)；巴利昔单抗(basiIiximab)(抗 0)25);达利珠单抗(daclizumab)(抗 0)25)；依法利珠单抗(efalizumab)(抗 QHla) ；GA101 (抗CD20 ；Glycart Roche);莫罗莫那-CD3 (muromonab_CD3)(抗 CD3 受体)；那他珠单抗(natal izumab)(抗 α 4 整联蛋白);奥马珠单抗(omalizumab)(抗 IgE)；抗 TNF- α抗体，如 CDP571 (Ofei 等，2011，Diabetes45:881_85)、MTNFA1、M2TNFA1、M3TNFA1、M3TNFAB1、M302B、M303 (Thermo Scientific, Rockford, IL);英夫利昔单抗(infliximab)(Centocor, Malvern, PA);塞妥珠单抗(certo I izumab pegol) (UCB, Brussels, Belgium)；抗 CD40L (UCB, Brussels, Belgium);阿达木单抗(adalimumab) (Abbott, Abbott Park, IL)；贝利单抗(Benlysta) (Human Genome Sciences);用于治疗阿尔茨海默病的抗体,如Alz50 (Ksiezak-Reding等，1987，J Biol Chem 263:7943-47)、罗氏单抗(gantenerumab)、索拉珠单抗(solanezumab)以及英夫利昔单抗(infliximab);抗纤维蛋白抗体,像59D8、T2Gls、MHl ;抗111￥ 抗体，如 P4/D10 (美国专利申请序号 ll/745，692)、Ab 75,Ab 76,Ab 77 (Paulik等，1999，Biochem Pharmacol 58:1781-90)；以及对抗病原体的抗体，如CR6261 (抗流行性感冒)、艾韦单抗(exbivirumab)(抗肝炎B)、泛维珠单抗(felvizumab)(抗呼吸道合胞体病毒)、夫瑞韦如(foravirumab)(抗狂犬病病毒)、莫维珠单抗(motavizumab)(抗呼吸道合胞体病毒)、帕利珠单抗(Palivizumab)(抗呼吸道合胞体病毒)、帕诺库单抗(panobacumab)(抗假单胞菌)、瑞非韦鲁(rafivirumab)(抗狂犬病病毒)、瑞加韦单抗(regavirumab)(抗巨细胞病毒)、司韦单抗(sevirumab)(抗巨细胞病毒)、tivirumab (抗肝炎B)以及乌珠单抗(urtoxazumab)(抗大肠杆菌(E.coli))。
[0017]有用的抗体或抗原结合片段可以是嵌合的、人源化的或人的。对亲本鼠抗体而言使用嵌合抗体是优选的，因为它们拥有人抗体恒定区序列并且因此不会引起像鼠抗体那样强烈的人抗小鼠抗体(HAMA)反应。使用人源化的抗体是甚至更优选的，以便进一步减小诱导HAMA反应的可能性。用于通过用相对应的人抗体构架区和恒定区序列替换鼠构架区和恒定区序列来进行鼠抗体的人源化的技术是本领域中众所周知的并且已经被应用于众多的鼠抗癌症抗体中。抗体人源化还可以涉及用相对应的来自亲本鼠构架区序列的残基置换一个或多个人构架氨基酸残基。如下所讨论，用于生产人抗体的技术也是众所周知的。
[0018]治疗性制剂可以包含抗体片段，如F (ab' ) 2、Fab、scFv、Fv或使用所述F (ab' )2、Fab,scFv的部分或全部轻链和重链的融合蛋白。抗体还可以是多价的、或多价且多特异性的。抗体可以包括IgGl、IgG2a、IgG3或IgG4的人恒定区。
[0019]在更优选的实施方案中，抗体的同种异型可选择为使宿主对所施用的抗体的免疫原性反应最小化，如下所更详细地讨论。优选的同种异型是非Glml同种异型(nGlml)，如Glm3、Glm3, 1、Glm3, 2或Glm3，I, 2。非Glml同种异型对抗体免疫反应性减少而言是优选的。出人意料地，未发现浓缩的nGlml抗体的重复皮下施用诱导明显的免疫反应，尽管皮下施用的免疫原性增强。
[0020]各种实施方案可以涉及本发明方法和组合物治疗疾病的用途，所述疾病包括但不限于:非霍奇金淋巴瘤、B细胞急性和慢性淋巴白血病、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、急性和慢性骨髓样白血病、T细胞淋巴瘤和白血病、多发性骨髓瘤、神经胶质瘤、华氏巨球蛋白血症、癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤以及皮肤癌。癌瘤可以包括口腔、胃肠道、肺道、肺、乳房、卵巢、前列腺、子宫、子宫内膜、宫颈、膀胱、胰腺、骨、脑、结缔组织、肝、胆囊、肾、皮肤、中枢神经系统以及睾丸的癌瘤。
[0021]另外，本发明方法和组合物可以用来治疗自身免疫性疾病,例如急性免疫性血小板减少、慢性免疫性血小板减少、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、糖尿病(例如，少年糖尿病)、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、大动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮症、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽`肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣或纤维性肺泡炎。
[0022]在替代实施方案中，浓缩的抗体制剂可以具有治疗代谢疾病(如2型糖尿病或淀粉样变性)、心血管疾病(如动脉粥样硬化)或神经疾病(如阿尔茨海默病)的用途。对治疗此类病状有用的抗体是本领域中已知的，如下所更详细地讨论。
[0023]在某些实施方案中，可以通过与作为本发明的一部分的一种或多种其它治疗剂的联合治疗来增强疾病治疗。在本发明中有用的已知治疗剂包括:免疫调节剂(如细胞因子、淋巴因子、趋化因子及生长因子以及它们的抑制剂)、鞘氨醇抑制剂、激素、激素拮抗剂、寡核苷酸(如siRNA或RNAi)、光活性治疗剂、抗血管生成剂以及促凋亡剂。其它更多的传统治疗剂(如细胞毒性药物或放射性核素)可以在浓缩的抗体之前、与其同时或在其之后施用。
[0024]附图简述
[0025]提供以下附图来说明本发明的优选实施方案。然而，所要求保护的主题决不受附图中所公开的说明性实施方案限制。
[0026]图1.从细胞培养基中抗体的柱色谱法纯化的示例性实验方案。[0027]图2.超滤浓缩的抗体的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳:㈧非还原性凝胶，⑶还原性凝胶。两种凝胶示出(泳道I)丽标准物；(泳道2) hLLl IgG，起始IgG溶液(lOmg/mL)；(泳道3)储存2个月之后的浓缩的hLLl IgG(215mg/mL)；(泳道4)hA20IgG,起始IgG溶液(5.lmg/mL);(泳道 5)储存 10 个月之后的浓缩的 hA20IgG (162mg/mL);(泳道 6) hL243IgG,起始IgG溶液(8.9mg/mL)；(泳道7)储存10个月之后的浓缩的hL243IgG(101mg/mL)。所使用的 MW 标准物分别是 6.5KD、14KD、21KD、31KD、45KD、66KD、97KD、116KD 以及 200KD。
[0028]图3.超滤浓缩的抗体的等电聚焦凝胶示出(泳道1)口1标准物；(泳道2)111^1186，起始IgG溶液(10mg/mL);(泳道3)储存2个月之后的浓缩的hLLlIgG(215mg/mL);(泳道4)hA20IgG，起始IgG溶液(5.lmg/mL)；(泳道5)储存10个月之后的浓缩的hA20IgG(162mg/mL)；(泳道6)hL243IgG，起始IgG溶液(8.9mg/mL)；(泳道7)储存10个月之后的浓缩的 hL243IgG(101mg/mL)。所使用的 MW 标准物分别是 6.5KD、14KD、21KD、31KD、45KD、66KD、97KDU16KD 以及 200KD。
[0029]图4.储存10个月之后的超滤浓缩的hLLlIgG溶液(215mg/mL)的代表性SE HPLC色谱图。
[0030]图5.储存10个月之后的超滤浓缩的hA20IgG溶液(162mg/mL)的代表性SE HPLC色谱图。
[0031]图6.储存10个月之后的超滤浓缩的hL243IgG溶液(101mg/mL)的代表性SE HPLC色谱图。
[0032]图7.维妥珠单抗(SEQ ID NO:33)与利妥昔单抗(SEQ ID NO:34)重链恒定区序列的比较。相同的残基由星号表明。两种不同的同种异型抗体的重链恒定区序列中仅有四个氨基酸残基不同。这两种抗体之间轻链恒定区序列是相同的。
[0033]图8.hL243的氨基酸序列。hL243IgG4P重链的整个可变区和恒定区序列如SEQ IDN0:37所示，其中恒定区加有下划线。hL243IgG4P重链的单独恒定区序列如SEQ ID NO:38所示。hL243轻链的整个可变区和恒定区序列如SEQ ID NO:39所示，其中恒定区加有下划线。hL243轻链的单独恒定区序列如SEQ ID N0:40所示。
[0034]详述
[0035]定义
[0036]提供以下定义有利于理解本文中的公开内容。在没有确切定义一个术语的情况下，所述术语根据它的平常意义和普通意义来使用。
[0037]如本文中所使用，“一个(种)”和“所述”可以是指单数或复数，除非上下文另外阐明仅意指单数。
[0038]“抗体”是指全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程所形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)；或免疫球蛋白分子的免疫活性的(即，抗原结合的)部分，像抗体片段。
[0039]“抗体片段”是抗体的一部分,如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv、单域抗体(DAB 或 VHH)等，包括 IgG4 的半分子(van der Neut Kolfschoten 等，2007, Science317:1554-1557)。无论结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原结合。例如，抗⑶74抗体片段与⑶74的表位结合。术语“抗体片段”还包括由可变区组成的分离的片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段；重组的单链多肽分子，其中轻链可变区和重链可变区由肽接头(“scFv蛋白”)连接；以及由模仿高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元。[0040]“嵌合抗体”是一种重组蛋白，其含有的可变域包括来源于一种物种的抗体(优选地啮齿动物抗体)的互补决定区(CDR)，而抗体分子的恒定域来源于人抗体的那些恒定域。对于兽医应用而言，嵌合抗体的恒定域可以来源于其它物种(如猫或狗)的那些恒定域。
[0041]“人源化抗体”是一种重组蛋白，其中来自一种物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的CDR从啮齿动物抗体的可变重链和可变轻链转移至人重链可变域和轻链可变域(包括人构架区(FR)序列)中。抗体分子的恒定域来源于人抗体的那些恒定域。
[0042]“人抗体”是从转基因小鼠中获得的抗体，所述转基因小鼠已经被基因工程化以作为对抗原挑战的反应而产生特异性人抗体。在此技术中，将人重链基因座和轻链基因座的元件引入至来源于胚胎干细胞系的小鼠品系中，所述胚胎干细胞系含有内源重链基因座和轻链基因座的靶向破坏。转基因小鼠可以合成对人抗原有特异性的人抗体，并且小鼠可以用来产生分泌人抗体的杂交瘤。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7:13 (1994)、Lonberg 等，Nature368:856 (1994)以及 Taylor 等，Int.1mmun.6:579(1994)描述。完全人抗体还可以通过基因转染或染色体转染方法以及曬菌体展示技术来构建，所有所述方法和技术是本领域中已知的。(参见，例如McCafferty等，Nature 348:552-553 (1990)，公开了从来自未免疫供体的免疫球蛋白可变域基因库(repertoire)中体外产生人抗体及其片段)。在此技术中，将抗体可变域基因框内克隆至丝状噬菌体的主要或次要外壳蛋白基因中，并且作为功能性抗体片段展示在噬菌体颗粒表面上。因为丝状颗粒含有噬菌体基因组的单链DNA拷贝，所以基于抗体功能性质的选择也导致编码展现出那些性质的抗体的基因的选择。以此方式，噬菌体模拟B细胞的一些性质。可以在各种形式下进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见例如Johnson和Chiswell, Current Opinion in Structural Biology 3:5564-571(1993)。还可以由体外活化的B细胞来产生人抗体。(参见，美国专利号5，567，610和5，229，275)。
[0043]“治疗剂”是对疾病的治疗有用的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括但不限于:抗体、抗体片段、药物、细胞因子或趋化因子抑制剂、促凋亡剂、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、siRNA, RNA1、螯合剂、硼化合物、光活性剂、染料以及放射性同位素。
[0044]“诊断剂”是对诊断疾病有用的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于:放射性同位素、染料、造影剂、荧光化合物或分子以及增强剂(例如，顺磁离子)。优选地，诊断剂选自由以下组成的组:放射性同位素、增强剂以及荧光化合物。
[0045]“免疫缀合物”是抗体与原子、分子或更高有序的结构(例如，与脂质体)、治疗剂或诊断剂的缀合物。“裸抗体”是没有与任何其它药剂缀合的抗体。
[0046]“裸抗体”通常是没有与治疗剂缀合的完整抗体。之所以如此是因为抗体分子的Fe部分提供效应子功能，如补体结合和ADCC (抗体依赖的细胞毒性)，其使可导致细胞溶解的机制得以实施。然而，Fe部分可能不是治疗功能所需要的，而其它机制(如凋亡)可以得以发挥作用。裸抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体两者；以及某些重组抗体，如嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[0047]如本文中所使用，术语“抗体融合蛋白”是重组产生的抗原结合分子，其中抗体或抗体片段被连接至另一种蛋白质或肽，如相同的或不同的抗体或抗体片段或DDD肽或AD肽。融合蛋白可以包含单一抗体组分、不同抗体组分的多价或多特异性的组合或同一抗体组分的多个拷贝。融合蛋白可以另外地包含抗体或抗体片段和治疗剂。适用于此类融合蛋白的治疗剂的实例包括免疫调节剂和毒素。一种优选的毒素包含核糖核酸酶(RNA酶)，优选地为重组RNA酶。
[0048]“多特异性抗体”是可以同时结合至少两个具有不同结构的靶标(例如，两个不同的抗原、在同一抗原上的两个不同表位、或半抗原和/或抗原或表位)的抗体。“多价抗体”是可以同时结合至少两个具有相同或不同结构的靶标的抗体。价态表明抗体对单一抗原或表位具有多少个结合臂或位点；即，一价的、二价的、三价的或多价的。抗体的多价性意味着抗体可以使用多种相互作用结合抗原，从而增加结合抗原的亲合力。特异性表明抗体能够结合多少个抗原或表位；即，单特异性的、双特异性的、三特异性的、多特异性的。使用这些定义，天然抗体(例如，IgG)是二价的，因为它具有两个结合臂，但所述抗体是单特异性的，因为它结合一个表位。多特异性的、多价的抗体是含有多于一个具有不同特异性的结合位点的构建体。
[0049]“双特异性抗体”是可以同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)可以具有:至少一个臂，其特异性地结合例如B细胞抗原或表位、T细胞抗原或表位、骨髓样细胞抗原或表位、浆细胞抗原或表位以及肥大细胞抗原或表位；和至少一个其它的臂，其特异性地结合带有治疗剂或诊断剂的可靶向的缀合物。可以使用分子工程来产生各种双特异性抗体。
[0050]单克隆抗体的制备
[0051]本文中所描述 的组合物、制剂以及方法可以包括单克隆抗体。特定抗原的啮齿动物单克隆抗体可以通过本领域技术人员已知的方法来获得。(参见，例如Kohler和 Milstein, Nature 256:495(1975)，和 Coligan 等，(编著)，CURRENT PROTOCOLS INIMMUNOLOGY,第 I 卷，第 2.5.1-2.6.7 页(John ffiley&Sons 1991))。用于克隆鼠免疫球蛋白可变域的一般技术已经例如由 Orlandi 等，Proc.Nat' I Acad.Sc1.USA86:3833 (1989)的出版物公开。
[0052]嵌合抗体
[0053]嵌合抗体是一种重组蛋白，其含有的可变域包括来源于一种动物物种(如啮齿动物抗体)的CDR，而抗体分子的其余部分(即恒定域)来源于人抗体。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员众所周知的。例如，Leung等，Hybridoma 13:469 (1994)公开了他们如何通过使编码LL2单克隆抗体(抗⑶22抗体)的Vk和Vh域的DNA序列与对应的人恒定区结构域和IgG1恒定区结构域组合来产生LL2嵌合体。此出版物还分别提供了 LL2轻链可变区和重链可变区(V1^PVh)的核苷酸序列。
[0054]人源化抗体
[0055]嵌合单克隆抗体可以通过用一个或多个不同的人FR替换嵌合抗体可变域中的鼠FR的序列来人源化。确切地说，将小鼠CDR从小鼠免疫球蛋白的可变重链和可变轻链转移至相对应的人抗体的可变域中。因为简单地将小鼠⑶R转移至人FR中经常导致抗体亲和力的减少或甚至丧失，所以可能要求额外的修饰以便恢复鼠抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区中的一个或多个某些人残基用它们的鼠对应物替换以获得对其表位拥有良好结合亲和力的抗体来完成。(参见，例如Tempest等，Biotechnology 9:266(1991)和Verhoeyen等，Science 239:1534(1988))。用于产生人源化抗体的技术例如由Jones等,Nature 321:522 (1986) >Riechmann 等,Nature 332:323 (1988) >Verhoeyen 等,Science239:1534(1988)、Carter 等，Proc.Nat' I Acad.Sci.USA 89:4285 (1992), Sandhu, Crit.Rev.Biotech.12:437(1992)以及 Singer 等，J.1mmun.150:2844(1993)公开。
[0056]人抗体
[0057]完全人抗体可以从转基因的非人动物中获得。(参见，例如Mendez等，NatureGenetics, 15:146-156，1997 ;美国专利号5，633，425)。用于使用组合方法或被人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物来产生完全人抗体的方法是本领域中已知的(例如，Mancini 等,2004, New Microbiol.27:315-28 ；Conrad 和 Scheller, 2005, Comb.Chem.HighThroughput Screen.8:117-26 ；Brekke 和 Loset,2003, Curr.0pin.Pharmacol.3:544-50 ；每个文献以引用的方式并入本文)。此类完全人抗体预计展现出比嵌合抗体或人源化抗体甚至更少的副作用，并且在体内用作基本上内源性的人抗体。在某些实施方案中，所要求保护的方法和工序可以使用由此类技术产生的人抗体。
[0058]在一种替代方案中，曬菌体展示技术可以用来产生人抗体(例如,Dantas-Barbosa等，2005, Genet.Mol.Res.4:126-40，所述文献以引用的方式并入本文)。还可以从正常的人或从展现出特定疾病状态(如癌症)的人中产生人抗体(Dantas-Barbosa等，2005)。从患病的个体中构建人抗体的优点是:可以使循环抗体库偏向于对抗疾病相关抗原的抗体。
[0059]在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等(2005)从骨肉瘤患者中构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。通常，从循环血液淋巴细胞中获得总RNA(同上)。从U、Y以及K链抗体库克隆重组的Fab并且将其插入至噬菌体展示文库中(同上)。使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引物，将RNA转变为cDNA并且用来制作FabcDNA 文库(Marks 等，1991，J.Mol Biol.222:581—97)。根据 Andris-Widhopf 等(2000 年，在 Phage Display Laboratory Manual, Barbas 等(编著)，第 I 版，Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Sp`ring Harbor, NY第9.1至9.22页中所述,所述文献以引用的方式并入本文)进行文库构建。用限制性核酸内切酶消化最终的Fab片段并且插入至噬菌体基因组中，以制作噬菌体展示文库。此类文库可以通过标准的噬菌体展示方法来筛选。熟练的技术人员将认识到此技术仅是示例性的，并且可以使用任何用于通过噬菌体展示而制作和筛选人抗体或抗体片段的已知方法。
[0060]在另一种替代方案中，使用如上所讨论的标准免疫实验方案，已经被基因工程化以产生人抗体的转基因动物可以用来产生对抗基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠中获得人抗体的方法由Green等，Nature Genet.7:13 (1994)、Lonberg等，Nature368:856(1994)以及 Taylor 等，Int.1mmun.6:579 (1994)描述。这样一个系统的非限制性实例是来自 Abgenix (Fremont, CA)的 XenoMouse ? (例如，Green 等,1999, J.1mmunol.Methods 231:11-23，所述文献以引用的方式并入本文)。在XenoMouse?和类似的动物中，小鼠抗体基因已经被灭活并且被功能性人抗体基因替换，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
[0061]用含有人IgH和IgK基因座的部分的种系配置的YAC (酵母人工染色体)来转化XenoMouse?，所述基因座部分包括大部分可变区序列连同附属基因和调控序列。人可变区库可以用来获得产抗体的B细胞，所述B细胞可以通过已知的技术加工成杂交瘤。用靶标抗原免疫的XenoMouse ?将通过正常的免疫反应产生人抗体，所述人抗体可以通过以上讨论的标准技术收犾和/或广生。可犾得多种XenoMouse⑧说系，其中每一种都能够广生不同类别的抗体。已经显示转基因产生的人抗体具有治疗潜力，同时保持正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等，1999)。熟练的技术人员将认识到所要求保护的组合物和方法不限于使用XenoMouse ?系统，而是可以使用任何已经被基因工程化以产生人抗体的转基因动物。
[0062]杭体克降和产牛
[0063]各种技术(如嵌合或人源化抗体的产生)可以涉及抗体克隆和构建的工序。感兴趣的抗体的抗原结合V K (可变轻链)和Vh (可变重链)序列可以通过各种分子克隆工序(如RT-PCR、5’-RACE以及cDNA文库筛选)来获得。来自表达鼠抗体的细胞的抗体的V基因可以通过PCR扩增来克隆并且测序。为了证实其真实性，可以将克隆的\和Vh基因在细胞培养物中表达为嵌合抗体，如由Orlandi等(Proc.Natl Acad Sci, USA, 86:3833 (1989))所描述。基于V基因序列，然后可以设计并且构建人源化抗体，如由Leung等(Mol.1mmunol., 32:1413(1995))所描述。
[0064]cDNA可以通过一般的分子克隆技术由任何已知的产生鼠抗体的杂交瘤系或转染细胞系制备(Sambrook 等，Molecular Cloning, A laboratory manual,第2 版(1989))。可以使用引物 VK1BACK 和 VKlFOR (Orlandi 等，1989)或由 Leung 等(BioTechniques, 15:286(1993))描述的延伸的引物组来扩增抗体的V κ序列。可以使用引物对 VH1BACK/VH1F0R(Orlandi 等，1989)或由 Leung 等(Hybridoma, 13:469(1994))描述的与鼠IgG的恒定区退火的引物来扩增Vh序列。可以通过长寡核苷酸模板合成与PCR扩增的组合来构建人源化V基因，如由Leung等(Mol.1mmunol., 32:1413 (1995))所描述。
[0065]可以将Vk的PCR产物亚克隆进入分期载体(staging vector),如基于pBR327的分期载体(VKpBR)，所述分期载体含有Ig启动子、信号肽序列以及适宜的限制位点。可以将Vh的PCR产物亚克隆进入类似的分期载体，如基于pBluescript的VHpBS。含有Vk和Vh序列连同启动子和信号肽序列一起的表达盒可以从VKpBR和VHpBS中切除并且分别连接入适当的表达载体，如pKh和pGlg (Leung等，Hybridoma, 13:469 (1994))。可以将表达载体共转染进入适当的细胞并且监测上清液中嵌合、人源化或人抗体的产生。或者，可以切除Vk和Vh表达盒并且亚克隆进入单一表达载体,如pdHL2,如由Gillies等(J.1mmunol.Methods125:191(1989))所描述并且还在 Losman 等，Cancer, 80:2660 (1997)中所示。
[0066]在一个替代实施方案中，表达载体可以被转染进入已经在无血清培养基中预适应转染、生长以及表达的宿主细胞。可以使用的示例性细胞系包括Sp/EEE、Sp/ESF以及Sp/ESF-X细胞系(参见，例如美国专利号7，531，327 ;7，537，930以及7，608，425 ;每一个所述专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。这些示例性细胞系基于Sp2/0骨髓瘤细胞系、用突变型Bcl-EEE基因转染、暴露于甲氨蝶呤以扩增转染的基因序列并且预适应无血清细胞系以用于蛋白质表达。
[0067]抗体同种异型[0068]治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性反应的持续时间减少相关(Baert等，2003，N Engl J Med 348:602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫反应的程度可以部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等，2011，Genes and Immunity12:213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链Y -型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976，J Immunol117:1056-59)。
[0069]对于常见的IgGl人抗体而言，最普遍的同种异型是Glml (Stickler等，2011，Genes and Immunity 12:213-21)。然而，Glm3同种异型也频繁地出现在白种人(Caucasians)中(同上)。已经报道了当向非Glml (nGlml)接受者(如Glm3患者)施用时，Glml抗体含有倾向于诱导免疫反应的同种异型序列(同上)。当向Glml患者施用时，非Glml同种异型抗体不是作为免疫原性的(同上)。
[0070]人Glml同种异型包含重链IgGl的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nGlml同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。Glml和nGlml同种异型两者均包含Kabat位置357上的谷氨酸残基，并且所述同种异型有时称为DEL和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO:34)和维妥珠单抗(SEQ ID N0:33)，在图7中显示出Glml和nGlml同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
[0071]Jefferis和Lefranc (2009，mAbsl: 1-7)综述了作为IgG同种异型的特征的序列变化和它们对免疫原性的影响。他们报道了与Glml7同种异型中的Kabat214上的赖氨酸残基相比，Glm3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nGlml, 2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。Glml, 2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc (2009)报道了 κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Kml同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Kml, 2同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
[0072]对于治疗性抗体而言，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别是对治疗各种各样血液恶性肿瘤和/或自身免疫性疾病有用的、对抗CD20的人源化和嵌合IgGl抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1和图7中所示，利妥昔单抗(Glml7，I)是DEL同种异型IgGl，在利妥昔单抗中的赖氨酸相对维妥珠单抗中的精氨酸在Kabat位置214(重链CHl)上具有额外序列变化。已经报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如 Morchhauser 等，2009，J Clin Oncol 27:3346-53 ；Goldenberg等，2009，Blood 113:1062-70 ；Robak&Robak, 2011, BioDrugs 25:13-25)，这种作用已经被归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的更低免疫原性。
[0073]表1.利妥昔单抗对维妥珠单抗的同种异型
【权利要求】
1.一种皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用治疗性的抗体或免疫球蛋白的方法，所述方法包括: a)在高浓度制剂缓冲液中产生浓缩的抗体或免疫球蛋白溶液；以及 b)通过皮下递送、肌肉内递送或经皮肤递送而向患者施用所述浓缩的抗体或免疫球蛋白溶液； 其中，所施用的浓缩的抗体溶液的体积选自由以下组成的组:3ml或更少、2ml或更少以及Iml或更少。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或免疫球蛋白被浓缩到至少80mg/ml、至少100mg/ml、至少 125mg/ml、至少 150mg/ml、至少 175mg/ml、至少 200mg/ml、至少 225mg/ml、至少 250mg/ml 或至少 300mg/ml。
3.如权利要求1所述的方法，其中所施用的抗体或免疫球蛋白的量选自由以下组成的组:40mg、80mg、160mg、240mg 以及 320mg。
4.如权利要求1所述的方法，其中重复所述施用。
5.如权利要求1所述的方法，其中皮下施用的、肌肉内施用的或经皮肤施用的抗体在比静脉内施用相同抗体低的剂量下有效。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述高浓度制剂缓冲液的PH为5.2并且包含柠檬酸盐、磷酸盐、氯化钠、聚山梨酯80以及甘露醇。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述高浓度制剂缓冲液包含6.2mM 一水合柠檬酸、105mM氯化钠、1.2mM二水合柠檬酸钠、8.7mM磷酸氢二钠、5.5mM磷酸二氢钠、0.1%聚山梨酯80以及66mM甘露醇。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述高浓度制剂缓冲液进一步包含精氨酸和谷氨酸。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述聚山梨酯80在所述抗体或免疫球蛋白被浓缩之后添加至所述浓缩的抗体或免疫球蛋白溶液中。
10.如权利要求9所述的方法，其中在所述抗体或免疫球蛋白被浓缩之后添加聚山梨酯80减少了浓缩过程中所形成的沉淀的量。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或免疫球蛋白通过超滤和渗滤来浓缩。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是非Glml(nGlml)抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述抗体具有Glm3重链同种异型。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述抗体具有nGlml,2重链无效同种异型(nullallotype)。
15.如权利要求12所述的方法，其中所述抗体具有Km3轻链同种异型。
16.如权利要求12所述的方法，其中所述抗体包含重链恒定区氨基酸残基精氨酸-214、谷氨酸-356、甲硫氨酸-358以及丙氨酸-431。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体重链恒定区的氨基酸序列是SEQIDNO:33 或 SEQ ID NO:38。
18.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列是SEQIDN0:40。
19.如权利要求13所述的方法，其中，当向所述患者施用时，所述Glm3同种异型抗体的免疫原性比Glml同种异型抗体小。
20.如权利要求1所述的方法，其中，在所述抗体被浓缩之前，通过在蛋白质A树脂、阴离子交换树脂以及阳离子交换树脂上的连续柱色谱法而从细胞培养基中纯化所述抗体。
21.如权利要求20所述的方法，其中使所述抗体在包含25mM柠檬酸盐(pH5.0)的缓冲液中结合至所述阳离子交换树脂，并且用包含25mM柠檬酸盐(pH 6.0)、150mM氯化钠的洗脱缓冲液从所述阳离子交换树脂上洗脱下来。
22.如权利要求21所述的方法，其中从所述阳离子交换树脂上洗脱下来的所述抗体通过在包含7.4mM柠檬酸盐(pH 5.2)的高浓度制剂缓冲液中的渗滤和超滤而进行浓缩。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组:单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段、双特异性抗体、多特异性抗体、免疫缀合物以及抗体融合蛋白。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述免疫缀合物包含至少一种非细胞毒性的治疗剂或诊断剂。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、酪氨酸激酶抑制剂、生长因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、激素以及酶。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-a (TNF)、TNF-β、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素- Y、命名为“SI因子”的干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、苗勒抑制物质、小鼠促性腺素相关的肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子_11、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-U IL-1 a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL_25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素以及LT。
27.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体是裸抗体。
28.如权利要求27所述的方法，其进一步包括向所述个体施用至少一种治疗剂。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:药物、前药、毒素、酶、酪氨酸激酶抑制剂、鞘氨醇抑制剂、免疫调节剂、细胞因子、激素、第二抗体、第二抗体片段、免疫缀合物、放射性核素、反义寡核苷酸、RNA1、抗血管生成剂、促凋亡剂以及细胞毒性剂。
30.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体结合选自由以下组成的组的抗原:碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CD1、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA、CEACAM5、CEACAM-6、c-MET, B7、纤连蛋白的ED-B、因子H、FHL-1、Flt_3、叶酸盐受体、GROB, HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HMl.24、胰岛素样生长因子-1 (ILGF-1)、IFN- y、IFN- a、IFN- β、IL-2, IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP-lB、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、MUC5a、MUC5c、MUC16、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl.24、EGP-1 (又称为 TROP-2)、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le (y)、RANTES、T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF- a、TRAIL受体(Rl和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5a、补体因子C5以及致癌基因产物。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述浓缩的抗体或免疫球蛋白溶液包含结合相同或不同抗原的两种或更多种抗体。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述浓缩的抗体或免疫球蛋白溶液包含抗体的组合，其中每种抗体结合选自由以下组成的组的抗原:⑶19、⑶20、⑶22、⑶74、⑶79a、⑶40L、ILGF-Rl、TR0P2、CEACAM5、CECAM6、HLA-DR、IFN a、IL-6 以及 TNF- α。
33.如权利要求23所述的方法，其中所述双特异性抗体结合两种不同的抗原，每种抗原选自由以下组成的组:CD19、CD20、CD22、CD74、CD79a、CD40L、ILGF-Rl、TR0P2、CEACAM5、CECAM6、HLA-DR、IFN α、IL-6 以及 TNF- α。
34.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组:hRl(抗IGF-1R)、hPAM4 (抗粘蛋白)、hA20 (抗 CD20)、GAlOl (抗 CD20)、hA19 (抗 CD19)、hIMMU31 (抗 AFP)、hLLl (抗 CD74)、hLL2 (抗 CD22)、hMu-9 (抗 CSAp)、hL243 (抗 HLA-DR)、hL243IgG4P (抗HLA-DR)、hMN-14 (抗 CEACAM5)、hMN_15 (抗 CEACAM6)、hRS7 (抗 EGP-1)、hMN_3 (抗 CEACAM6)、Ab124 (抗 CXCR4)以及 Ab12 5 (抗 CXCR4)。
35.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体选自由以下组成的组:依帕珠单抗(epratuzumab)、维妥珠单抗(veltuzumab)、米拉珠单抗(milatuzumab)、hL243 (抗 HLA-DR)以及 hL243IgG4P (抗 HLA-DR)。
36.如权利要求1所述的方法，其中所述患者具有选自由以下组成的组的疾病:自身免疫性疾病、免疫失调疾病、感染性疾病、癌瘤、肉瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、阿尔茨海默病、2型糖尿病、I型糖尿病、淀粉样变性、心血管疾病、神经疾病以及代谢疾病。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组:急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、大动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮症、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣以及纤维性肺泡炎。
38.如权利要求36所述的方法，其中当所述皮下施用的、肌肉内施用的或经皮肤施用的抗体作为单一注射给予时，在80mg或更低、160mg或更低、240mg或更低、320mg或更低或400mg或更低的剂量下展现出对抗所述疾病的功效。
39.如权利要求23所述的方法，其中所述抗体片段选自由以下组成的组:F(ab')2、F (ab) 2> Fab> Fab'以及 scFv 片段。
40.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体包含选自由以下组成的组的人恒定区:IgGU IgG2a、IgG3 以及 IgG4。
41.如权利要求23所述的方法，其中所述双特异性抗体包含至少一个用于肿瘤相关的抗原的结合位点和至少一个用于半抗原的结合位点，并且所述方法进一步包括向所述患者施用可靶向构建体，其中所述可靶向构建体包含所述半抗原的至少一个拷贝并且被附接到至少一种诊断剂或治疗剂。
42.一种用于皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用的组合物，其包含处于高浓度制剂缓冲液中的治疗性抗体，其中所述缓冲液的pH为5.2并且包含柠檬酸盐、磷酸盐、氯化钠、聚山梨酯80以及甘露醇。
43.如权利要求42所述的组合物，其中所述高浓度制剂缓冲液包含6.2mM 一水合柠檬酸、105mM氯化钠、1.2mM 二水合柠檬酸钠、8.7mM磷酸氢二钠、5.5mM磷酸二氢钠、0.1%聚山梨酯80以及66mM甘露醇。
44.如权利要求42所述的组合物，其中所述高浓度制剂缓冲液进一步包含精氨酸和谷氨酸。
45.如权利要求42所述的组合物,其中所述抗体的浓度为至少80mg/ml、至少IOOmg/ml、至少 125mg/ml、至少 150mg/ml、至少 175mg/ml、至少 200mg/ml、至少 225mg/ml、至少250mg/ml 或至少 300mg/ml。
46.如权利要求42所述的组合物，其中所述`抗体是nGlml同种异型。
47.如权利要求46所述的组合物，其中所述抗体具有Glm3重链同种异型。
48.如权利要求47所述的组合物，其中所述抗体具有nGlml，2重链无效同种异型。
49.如权利要求46所述的组合物，其中所述抗体具有Km3轻链同种异型。
50.如权利要求46所述的组合物，其中所述抗体包含重链恒定区氨基酸残基精氨酸-214、谷氨酸-356、甲硫氨酸-358以及丙氨酸-431。
51.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体重链恒定区的氨基酸序列是SEQIDNO:33 或 SEQ ID NO:38。
52.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列是SEQIDN0:40。
53.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体是裸抗体。
54.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体与至少一种非细胞毒性的治疗剂或诊断剂缀合。
55.如权利要求54所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:免疫调节剂、细胞因子、趋化因子、酪氨酸激酶抑制剂、生长因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、成血因子、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、激素以及酶。
56.如权利要求54所述的组合物，其中所述治疗剂选自由以下组成的组:红细胞生成素、血小板生成素、肿瘤坏死因子-a (TNF)、TNF-β、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-Y、命名为“SI因子”的干细胞生长因子、人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体激素(LH)、肝生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、苗勒抑制物质、小鼠促性腺素相关的肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、整联蛋白、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-1、胰岛素样生长因子_11、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-U IL-1 a、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL_25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素以及LT。
57.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体结合选自由以下组成的组的抗原--碳酸酐酶 IX、CCCL19、CCCL21、CSAp、CDl、CDla、CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CDl 1A、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD29、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD55、CD59、CD64、CD66a_e、CD67、CD70、CD70L、CD74、CD79a、CD80、CD83、CD95、CD126、CD132、CD133、CD138、CD147、CD154、AFP、PSMA,CEACAM5、CEACAM-6、B7、纤连蛋白的 ED-B、因子 H、FHL-1、Flt_3、叶酸盐受体、GROB、HMGB-1、缺氧诱导因子(HIF)、HMl.24、胰岛素样生长因子-1 (ILGF-1)、IFN1、IFN-a、IFN-β、IL-2、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、IL-6, IL-8, IL-12, IL-15, IL-17,IL-18、IL-25、IP-10、MAGE、mCRP、MCP-l、MIP-lA、MIP-lB、MIF、MUCl、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5、PAM4 抗原、NCA-95、NCA-90、la、HMl.24、EGP-1、EGP-2、HLA-DR、腱生蛋白、Le (y)、RANTES,T101、TAC、Tn 抗原、Thomson-Friedenreich 抗原、肿瘤坏死抗原、TNF- a、TRAIL 受体(Rl 和R2)、VEGFR、EGFR、P1GF、补体因子C3、补体因子C3a、补体因子C3b、补体因子C5a、补体因子C5以及致癌基因产物。
58.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体选自由以下组成的组:hRl(抗IGF-1R)、hPAM4 (抗粘蛋白)、hA20 (抗 CD20) ,GAlOl (抗 CD20)、hA19 (抗 CD19)、hIMMU31 (抗AFP)、hLLl (抗 CD74)、hLL2(抗 CD22)、hMu_9 (抗 CSAp)、hL243 (抗 HLA-DR)、hL243 IgG4P (抗HLA-DR)、hMN-14 (抗 CEACA M5)、hMN_15 (抗 CEACAM6)、hRS7 (抗 EGP-1)、hMN_3 (抗 CEACAM6)、Ab124 (抗 CXCR4)以及 Ab125 (抗 CXCR4)。
59.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体选自由以下组成的组:依帕珠单抗、维妥珠单抗、米拉珠单抗、hL243 (抗HLA-DR)以及hL243IgG4P (抗HLA-DR)。
60.如权利要求42所述的组合物，其中所述抗体是结合两种不同抗原的双特异性抗体，每种抗原选自由以下组成的组:CD19、CD20、CD22、CD74、CD79a、CD40L、ILGF-Rl、TR0P2、CEACAM5、CECAM6、HLA-DR, IFN α、IL-6 以及 TNF- α。
61.如权利要求42所述的组合物在制备用于治疗疾病的药剂中的用途，所述疾病选自由以下组成的组:自身免疫性疾病、免疫失调疾病、癌瘤、肉瘤、神经胶质瘤、黑素瘤、淋巴瘤、白血病、慢性淋巴细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、阿尔茨海默病、I型糖尿病或2型糖尿病、淀粉样变性以及动脉粥样硬化。
62.如权利要求61所述的用途，其中所述抗体存在于所述药剂中的量为SOmg或更低、160mg或更低、240mg或更低、320mg或更低或400mg或更低。
63.如权利要求61所述的用途，其中所述药剂用于皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用，并且待施用的体积选自由以下组成的组:3ml或更少、2ml或更少以及Iml或更少。
64.如权利要求61所述的用途，其中所述组合物中的抗体的浓度为至少80mg/ml、至少100mg/ml、至少 125mg/ml、至少 150mg/ml、至少 175mg/ml、至少 200mg/ml、至少 225mg/ml、至少 250mg/ml 或至少 300mg/ml。
65.如权利要求61所述的用途，其中当皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用时，所述抗体在比当静脉内施用时低的剂量下有效。
66.如权利要求61所述的用途，其中所述自身免疫性疾病选自由以下组成的组:急性特发性血小板减少性紫癜、慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、风湿热、多腺体综合征、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、大动脉炎、爱迪生氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、结节性多动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯丘氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、斯耶格伦氏综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮症、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳氏肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化症、脊髓痨、巨细胞动脉炎/多肌痛、恶性贫血、急进性肾小球肾炎、牛皮癣以及纤维性肺泡炎。
67.一种制备浓缩的抗体制剂用于皮下施用、肌肉内施用或经皮肤施用的方法，所述方法包括: a)通过在蛋白质A树脂、阳离子交换树脂以及阴离子交换树脂上的连续柱色谱法来纯化所述抗体； b)通过超滤来浓缩所述抗体；以及 c)使用渗滤将所述缓冲液交换成pH介于4.5与5.5之间的高浓度制剂缓冲液，所述高浓度制剂缓冲液包含柠檬酸盐、磷酸盐、氯化钠、聚山梨酯80以及甘露醇。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述高浓度制剂缓冲液进一步包含精氨酸和谷氨酸。`
69.如权利要求67所述的方法,其中所述抗体被浓缩到至少80mg/ml、至少100mg/ml、至少 125mg/ml、至少 150mg/ml、至少 175mg/ml、至少 200mg/ml、至少 225mg/ml、至少 250mg/ml 或至少 300mg/ml。
70.如权利要求67所述的方法，其进一步包括以选自由以下组成的组的体积，通过皮下递送、肌肉内递送或经皮肤递送来施用所述抗体:3ml或更少、2ml或更少以及Iml或更少。
71.如权利要求67所述的方法，其中所施用的抗体的量选自由以下组成的组:40mg、80mg、160mg、240mg 以及 320mg。
72.如权利要求67所述的方法，其中所述高浓度制剂缓冲液包含6.2mM —水合柠檬酸、105mM氯化钠、1.2mM二水合柠檬酸钠、8.7mM磷酸氢二钠、5.5mM磷酸二氢钠、0.1%聚山梨酯80以及66mM甘露醇。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述聚山梨酯80在所述抗体被浓缩之后添加至所述浓缩的抗体溶液中，以减少浓缩过程中所形成的沉淀的量。
74.如权利要求67所述的方法，其中所述抗体是非Glml(nGlml)抗体。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述抗体具有Glm3重链同种异型。
76.如权利要求75所述的方法，其中所述抗体具有nGlml，2重链无效同种异型。
77.如权利要求67所述的方法，其中所述抗体具有Km3轻链同种异型。
78.如权利要求74所述的方法，其中所述抗体包含重链恒定区氨基酸残基精氨酸-214、谷氨酸-356、甲硫氨酸-358以及丙氨酸-431。
79.如权利要求67所述的方法，其中所述抗体重链恒定区的氨基酸序列是SEQIDNO:33 或 SEQ ID NO:38。
80.如权利要求67所述的方法，其中所述抗体轻链恒定区的氨基酸序列是SEQIDN0:40。
81.如权利要求67所述的方法，其中所述抗体是结合两种不同抗原的双特异性抗体，每种抗原选自由以下组成的组:CD19、CD20、CD22、CD74、CD79a、CD40L、ILGF-RU TROP2、CEACAM5、CECAM6、HLA-DR、IFN α、IL-`6 以及 TNF- α。
【文档编号】A61K51/10GK103501825SQ201280020130
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2012年5月1日 优先权日:2011年5月2日
【发明者】L·曾, R·米特拉, E·A·罗西, H·J·汉森, D·M·戈德堡 申请人:免疫医疗公司