使用唾液酸酶抑制剂改进的血小板保存的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种血小板添加液(PAS)，这种血小板添加液具有一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及一种或多种PAS组分，所述组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。本发明还涉及多种方法、组合物和试剂盒，它们用于通过将分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂一起保存来增加血小板的体内循环时间。另外，本发明涉及多种方法和组合物，它们用于降低在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中的唾液酸酶活性并且抑制一种或多种细菌的细菌增殖。
【专利说明】使用唾液酸酶抑制剂改进的血Λ?、板保存
[0001]相关申请
[0002]本申请是2012年5月17日提交的美国申请号13/474，473的一个部分继续申请；2012年5月17日提交的美国申请号13/474,627的一个部分继续申请；以及2012年5月17日提交的美国申请号13/474,679的一个部分继续申请，并且要求以下美国临时申请号的权益:2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613，876 ;2012年3月21日提交的美国临时申请号61/613，837 ;2011年7月I日提交的美国临时申请号61/503，984 ;以及2011年5月17日提交的美国临时申请号61/487，077。
[0003]以上申请的全部教授内容通过引用结合在此。
[0004]政府支持
[0005]本发明全部或部分得到美国国家心肺及血液研究所(National Heart, Lung, andBlood Institute)的批准号3R01HL089224-03S1的支持。该政府部门享有本发明的某些权利。
[0006]发明背景
[0007]预期用于输注的收集的血小板极易腐坏。血小板是无核骨髓来源的血细胞，它通过粘附至血管损伤位点并通过促进血浆纤维蛋白凝块的形成而保护受伤的哺乳动物免于失血。由于骨髓衰竭而耗尽循环血小板的人遭受威胁生命的自发性出血，并且不太严重的血小板缺乏导致创伤或手术之后的出血并发症。
[0008]随着循环血小板计数降低(例如，约70，000个/μ L)，患者变得越来越容易皮肤出血。血小板计数少于20，000个/ μ L的患者极易出现粘膜表面的自发性出血，尤其是在骨髓障碍或衰竭引起血小板减少的时候。与骨髓障碍(如再生障碍性贫血、急性和慢性白血病、转移癌)相关的血小板缺乏以及由癌症治疗(如电离辐射或化学疗法)引起的缺乏都导致了重大公共卫生问题。罹患与大手术、损伤以及败血症相关的血小板减少的患者也需要输注大量的血小板。
[0009]半个世纪以前，在医疗护理方面的主要进步是发展血小板输注来矫正这类血小板缺乏，这使得在美国在现有输注率下每年有大约260万血小板输注。然而，收集用来输注的血小板极易腐坏，因为当保存在室温或低于室温下时，它们很快失去体内止血活性。止血活性广义地是指血小板群介导出血停止的能力。
[0010]血小板与所有其他可移植的组织不同，它们不能耐受冷藏并且如果经受即使非常短时间的冷冻也会迅速从接受者的循环中消失。重要的是，使血小板存活变短的冷却效应被认为是不可逆的并且冷却的血小板变得不适合用于输注。血小板损伤的第一可见效应之一是从盘状形态向球形形状的不可逆转换，以及由于钙依赖性凝溶胶蛋白活化和磷酸肌醇介导的肌动蛋白聚合所致的血小板表面上的刺状突起外观。当血小板暴露在低于20°C的温度下时，它们在形状上迅速经历这些改变。
[0011]在输注之前将血小板保持在室温下的这一需要施加了对血小板保存的独特的一套昂贵且复杂的后勤需要(logistical requirement)。因为血小板在室温下是代谢活跃的，它们需要在气体可渗透的容器中持续搅拌以允许气体交换，从而防止代谢性酸中毒的毒性后果。室温保存条件导致大分子降解和血小板止血功能降低，这一组缺点被称为“保存损害”。此外，在室温下保存促进细菌生长，从而引起更高的细菌感染风险，这有效地将这种保存的持续时间限制为约5天。就此方面，到目前为止血小板的细菌污染是最频繁的血液组分使用的感染性并发症。在目前的比率下，I, OOO单位之一至2，000单位之一的血小板被细菌充分污染，从而对接受者造成重大风险。
[0012]因此，仍然存在着开发出改善或延长人血小板在室温或低于室温下保存时体内止血活性的药剂、溶液和方法的迫切需要。存在着这样做并且抑制细菌增殖的另一种更重要的需要。
[0013]发明概述
[0014]本发明涉及一种血小板添加液(PAS)，该血小板添加液包含一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及一种或多种包含以下各项的PAS组分:盐(例如，钠源、氯化物源、钾源、镁源、钙源以及它们的组合)、柠檬酸盐源(例如，柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸以及它们的组合)和/或碳源(例如，乙酸盐、葡萄糖、蔗糖及其任意组合)。本发明的PAS维持在范围在大约6.4与大约7.6之间的pH下。在一个实施例中，本发明的PAS进一步包括磷酸盐源(例如，单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠以及它们的组合)。乙酸盐源可包括例如乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁或其组合。在一方面，钠源可以是氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠或其组合。类似地，氯化物源可以是氯化钠、氯化镁、氯化钾或其组合。在一个实例中，钾源可以是氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾或其组合。镁源的实例包括氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁以及它们的组合。在一个实施例中，钙源涵盖氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙或其组合。
[0015]在一个具体实施例中，本发明的PAS包含一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；在约IOOmM与约300mM之间的范围内的量的钠源；在约40mM与约IlOmM之间的范围内的量的氯化物源；在约2mM与约20mM之间的范围内的量的柠檬酸盐源；在约IOmM与约50mM之间的范围内的量的乙酸盐源；在约5mM与约50mM之间的范围内的量的磷酸盐源；在约0.5mM与约IOmM之间的范围内的量的钾源；在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的镁源；以及在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的钙源；其中该PAS维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下(例如，约7.1至约7.4，或约7.2)。
[0016]在又另一个实施例中，本发明是涉及具有分离的血小板的血小板组合物；本发明的PAS ;以及血浆，其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。在一方面，该血浆以按体积计约I %与约50 %之间范围内的量存在(例如，在20 %与40 %之间的血浆，或30%的血浆)。在又一个实施例中，血小板添加液以按体积计约50%与约99%之间的范围内的量存在。
[0017]本发明进一步涉及适合于血小板保存的具有本发明的PAS的袋或容器。该袋或容器可进一步包含分离的血小板并且/或者维持在约6.4与约7.6之间的范围内的pH下。
[0018]本发明涉及一种保存血小板的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。该方法包括使分离的血小板与在此描述的PAS接触的步骤。该唾液酸酶抑制剂可以是例如胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；奥司他韦(Oseltamivir) ((3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酯；扎那米韦(Zanamivir) ((2R，3R，4S)-4-胍基 _3_(丙-1-稀-2-基氛基)-2-((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3,4- 二氧-2H-批喃-6-羧酸)；拉尼娜米韦(Laninamivir) ((4S, 5R, 6R)-5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6- 二氧-4H-批喃-2-竣酸)；以及帕拉米韦(Peramivir) ((lS，2S，3S，4R)-3-[(lS)-l-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4-( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸)或其药学上可接受的盐。在一个实施例中，唾液酸酶抑制剂是2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。该方法允许分离的血小板保存约I天至约21天的一段时间。该分离的血小板被保存在约1°C与约24°C之间的温度下。在一个实施例中，该方法包括以下步骤:冷却血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后使该血小板组合物复温回至室温。在一方面，在一个时间段内将血小板群用唾液酸酶抑制剂进行处理，其中该时间段是在约I分钟至约8小时之间的范围内。
[0019]本发明涉及用于制备血小板以供保存的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。这些方法包括使分离的血小板与如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触。该聚糖修饰剂可以是例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。在一方面，还可以将使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
[0020]本发明还涉及制备血小板以供保存的方法。该方法包括以下步骤:从一位或多位个体中分离血小板；并且使所分离的血小板与唾液酸酶抑制剂接触,该唾液酸酶抑制剂的量足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解。在一方面，出现了血小板受体损失(例如，GPIba损失、GPV损失或者两者)的减少。
[0021]本发明 涵盖用于增加分离的血小板的体内循环时间的方法。这些方法包括以下步骤:从一位或多位个体获得分离的血小板；用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂来处理血小板，从而获得处理的血小板；并且将处理的血小板输注到有需要的个体中，从而获得输注的血小板。与没有经受唾液酸酶抑制剂的血小板相t匕，这些输注的血小板的循环时间是更长的。在一方面，这些方法包括将该血小板组合物保存在室温下一段时间。在另一方面，这些方法包括冷却该血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后使该血小板组合物复温回至室温。
[0022]本发明的又一个实施例包括具有唾液酸酶抑制剂和血小板群的血小板制剂；其中稳定的血小板制剂通过以下方法来制备:从一个供体中获得血小板群；并使用有效量的唾液酸酶抑制剂处理血小板。这种血小板制剂适合于在保存之后给予人体，而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或者没有血小板清除的显著增加。类似地，本发明的血小板制剂还包括从供体中分离的血小板；以及一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
[0023]本发明进一步涉及试剂盒和系统。本发明的试剂盒包括能够接收和容纳血小板群的无菌容器，其中该容器是大致上与环境隔离的，以及如在此所述的无菌量的唾液酸酶抑制剂和任选地适合的包装材料和使用说明书。在一个实例中，该容器适合于冷保存血小板。该试剂盒可进一步包含一定量的至少一种聚糖修饰剂，如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。类似地，本发明包括一种系统，该系统具有适合于血液保存的一个无菌袋或容器；以及一定量的如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
[0024]本发明涉及用于降低在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中的唾液酸酶活性并抑制一种或多种细菌增殖的方法。这些方法包括以下步骤:使该血小板产品制剂与一定量的如在此所述的唾液酸酶抑制剂接触，从而获得唾液酸酶处理的血小板产品制剂；其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板产品制剂相比，唾液酸酶活性降低并且一种或多种细菌的增殖受到抑制。抑制的细菌的类型包括通常在血小板产品制剂中找到的那些细菌。这类细菌的实例包括:曲霉菌(Aspergillus)、芽孢杆菌属(Bacillussp)、艾氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、梓樣酸杆菌属(Citrobacter sp)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、类白喉菌(Diphtheroid)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogene) >河生肠杆菌(Enterobacter amnigenus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、Btt邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌属(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、产酸克雷伯菌(K.0xytoca))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp)、李斯特菌属(Listeria sp)、微球菌属(Micrococcus sp)、消化链球菌(Peptostreptococcus)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp)、沙门菌属(Salmonella sp)、沙雷菌属(Serratia sp)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、葡萄球菌属(Staplhylococcus sp)(凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、链球菌属(Streptococcus sp)、(解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、牛链球菌(S.bovis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、草绿色链球菌(S.viridans))、以及小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。这些方法进一步包括以下步骤:评定唾 液酸酶抑制剂处理的血小板产品制剂的细菌增殖以及将该评定与一个对照进行比较。可以将一种或多种聚糖修饰剂添加到血小板中。这类聚糖修饰剂包括例如CMP唾液酸、CMP唾液酸前体、UDP半乳糖或其组合。在一方面，可以将使CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸的酶添加到血小板中。
[0025]本发明涵盖用于在保存过程中抑制血小板中的细菌增殖的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。这些方法包括使分离的血小板与一定量的如在此所述的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且在一个或多个时间点评定在分离的血小板中的细菌增殖；其中分离的血小板中的细菌增殖受到抑制。在一方面，使该血小板制剂与唾液酸酶抑制剂接触，该唾液酸酶抑制剂的量足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解。在一个实施例中，分离的血小板可以保存约I天至约21天的一段时间。分离的血小板可以例如在约1°C与约24°C之间的温度下保存。在一个实施例中，该方法涉及在室温下保存血小板组合物一段时间。在另一个实施例中，该方法包括冷却该血小板组合物至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后在输注到个体中之前使该血小板组合物复温回至室温。
[0026]本发明的又另一个实施例涉及制备供保存的血小板的方法，在此过程中唾液酸酶活性降低并且细菌增殖受到抑制，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的。该方法包括以下步骤:使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且评定在分离的血小板中的细菌增殖，其中与对照相比，在分离的血小板中的细菌增殖受到抑制。本发明进一步包括以下方法:通过从一位或多位个体中获得血小板群来增加血小板群的保存时间；并且用有效量的唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理的血小板。在一方面，在一个时间时间范围内使用唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间时间范围是在约I分钟至约8小时之间的范围内。这些步骤还可以用于通过降低唾液酸酶活性并抑制细菌增殖来增加血小板群的保存时间的方法。
[0027]本发明还涵盖输注分离的血小板的方法。这些方法包括以下步骤:从一位或多位个体中获得分离的血小板；使用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂来处理血小板，从而获得展现出抑制的细菌增殖的处理的血小板；并且将处理的血小板输注到有需要的个体中；其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比，细菌增殖受到抑制。
[0028]本发明涉及维持在保存之后被输注到接受者中的血小板的止血活性的方法。此方法通过以下方式来进行:使分离的血小板与一定量的唾液酸酶抑制剂接触从而获得处理的血小板；保存处理的血小板约I天与14天之间的一段时间；将所保存的、处理的血小板输注到有需要的接受者中，从而获得输注的血小板；其中这些输注的血小板与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比可以活化并形成凝块。
[0029]本发明还涵盖血小板制剂。这些血小板制剂包括唾液酸酶抑制剂和血小板群；其中这种稳定的血小板 制剂是通过在此所述的方法制备的。另外，本发明的血小板制剂包括从供体中分离的血小板；以及一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；其中这些血小板制剂与未用唾液酸酶抑制剂处理的血小板制剂相比展现出抑制的细菌增殖。
[0030]附图简要说明
[0031]图1A至图1C是描绘含有细胞内唾液酸酶的唾液酸化血小板和含唾液酸酶的细菌的图示。(A)细菌和血小板来源的唾液酸酶两者都从血小板表面除去了唾液酸，从而导致功能受损的血小板形成(I)。释放的唾液酸支持污染细菌的增殖(短虚线和2)，这导致血小板活化(3)、血小板-细菌聚集体形成(3)以及生物膜形成(长虚线和4)。(B)在输注时，巨噬细胞识别去唾液酸化的血小板并将它们从循环中除去。(C)添加唾液酸酶抑制剂DANA (2, 3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐)抑制了来源于血小板和细菌的唾液酸酶活性、防止了血小板去唾液酸化，使得在输注之后血小板不被巨噬细胞识别。
[0032]图2是显示人血小板在4°C下保存过程中损失唾液酸的条形图。在外源性核苷酸糖(a)缺乏、CMP唾液酸(CMP-SA)和UDP半乳糖(UDP-Gal) (b)或单独的UDP半乳糖(c)存在下，在4°C下保存血小板浓缩物(A:供体A和B:供体B) 5天。将第O天的血小板的唾液酸含量设为100%。
[0033]图3是显示人血小板唾液酸酶表面活性在冷保存之后增加的线形图。(A)描绘了在有或没有透化作用的情况下新鲜血小板的分析。(B)描绘了在pH5和6下新鲜完整的血小板(供体A和B)的分析。(C)描绘了在4°C保存5天之后的完整血小板(供体A和B)的相应分析。
[0034]图4示出了固定的、未透化的、静息室温(RT)(左图)和冷藏(右图)的人血小板的免疫荧光显微照片，表明在血小板的表面上存在唾液酸酶Neu3，但是不存在Neul。血小板冷藏(48h)增加了唾液酸酶(Neul)表面荧光，即暴露。在上图中使用了抗Neul抗体。在下图中使用了抗Neu3抗体。
[0035]图5显示了在冷保存48h并复温之后小鼠血小板唾液酸酶表面活性增加。在室温下持续O至2.5h以荧光(吸收强度(Al))来测量血小板来源的唾液酸酶活性。将保存在低温(4°C，较暗的圆圈)下的血小板与新鲜血小板(RT，较淡的圆圈)进行比较。作为对照，测量唾液酸酶活性(产气荚膜梭菌(组分H))持续相同的时间段(插图)。
[0036]图6显示在血小板保存过程中胎球蛋白竞争唾液酸酶表面活性并因此抑制唾液酸从血小板聚糖上水解。左侧竖条对表示在胎球蛋白缺乏(对照)或存在胎球蛋白(胎球蛋白)下在新鲜血小板(O)上的β-半乳糖暴露。右侧竖条对表示血小板冷藏48h之后在胎球蛋白缺乏(对照)或存在下的β_半乳糖。通过RCA I结合来测量唾液酸损失，即β -半乳糖暴露。
[0037]图7显示唾液酸酶抑制剂DANA增加了小鼠血小板的体内寿命。底线表示对照血小板寿命(对照)。顶线表示添加DANA(DANA)后的血小板寿命。
[0038]图8(A)表示原始GPIba结构以及O-连接的聚糖和N-连接的聚糖的图示结构。(B)表示末端GalP l、4GlcNAc (乳糖胺聚糖/LacNAc)以及核心_10_聚糖的生物合成修饰。
[0039]图9显示经总血小板溶解产物的蛋白质印迹分析人血小板含有唾液酸酶Neul和Neu30
[0040]图10显示在长期冷藏后人血小板释放Neul到血浆中，如通过蛋白质印迹所分析的。在第O天和血小板冷藏I天、2天和5天之后分析血小板和它们相应的血浆。
[0041]图1l(A)描绘了血小板糖基转移酶(GT)的特征。使人总血小板溶解产物经受SDS-PAGE并使用以下单克隆抗体进行免疫印迹:抗-GalNAc转移酶(GalNAc_Tl、-T2、-T3)、β 4Gal-转移酶I ( β 4Gal-Tl)以及唾液酸转移酶ST3Gal_l (B)血小板分泌GT。静息的血小板在37°C下维持5分钟或者经由凝血酶受体PAR-1与25 μ M TRAP活化5分钟。I分钟之后观察到最大的释放。在沉淀的血小板部分(P)中或者在其相应沐浴介质(M)中测量每分钟计数(CPM)的酶活性。将该介质在100，OOOxg下澄清90分钟以在活性测量之前消除微颗粒。
[0042]图12描绘了内源性血小板唾液酸转移酶将唾液酸并入血小板表面受体中。(A)活性人血小板表面唾液酸转移酶使FITC-结合的CMP-SA (FITC-SA)并入静息的(虚线)或TRAP-活化的血小板中。将单独的FITC (对照)添加到静息(虚线)或TRAP活化的血小板(实线)中。⑶显示来自静息的(静息)或TRAP-活化的血小板(TRAP)的溶解产物的免疫印迹，所述血小板用FITC(C)或FITC-CMP唾液酸⑶处理或者未用针对FITC、GPIb α、a IIb以及vWf的抗体进行处理(_)。这些显示的印迹表示两个实验。肌动蛋白被显示为加载对照。
[0043]图13显示在室温(A)或冷藏(B)下保存的过程中血小板损失了 GPIb α和GPV受体。在将血小板保存在冷处之前和之后的指定时间点通过流式细胞术测量小鼠vWf受体复合物组分(GPIba、GPIbP、GPIX、GPV)、GPVI和aIIb@3的表达。结果表示为平均值土SD，η = 5。将新鲜分离的血小板上的糖蛋白表达设为100%。
[0044]图14显示仅抑制金属蛋白酶介导的GPIb α脱落并不改善小鼠血小板的恢复和存活。通过流式细胞术评定(A)GPIba和(B)GPV的表面表达。在DMSO(对照)或100 μ M金属蛋白酶抑制剂GM6001(n = 6)存在下，在4°C保存野生型小鼠富含血小板的血浆Oh、24h和48h。通过流式细胞术测定在来自TACE+/+和ΤΑ(:ΕΔΖη/ΔΖη小鼠的新鲜分离的或冷藏24h和48h的富含血小板的血浆上的(C)GPIba和(D)GPV的表面表达。结果是平均值土平均数标准误差(s.e.m.)。η = 5。(C，插图)在来自保存在冷处3h、24h和48h的TACE+/+和TACEAZn/AZn血小板的溶解产物中的GPIba的免疫印迹。(E)将荧光标记(5_氯甲基荧光素二乙酸酯，CMFDA)的新鲜PRP(RT)或者来自在100 μ M GM6001缺乏(48h)或存在(48h+GM6001)下保存的富含血小板的血浆的血小板注入到野生型小鼠中(IO8个血小板/IOgm体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果是平均百分比CMFDA-标记的血小板土平均数标准误差。将输注后5分钟时间的CMFDA阳性新鲜血小板百分比设为100%。η = 5。*Ρ < 0.05。比较冷保存的血小板。(F)将荧光标记(CMFDA)的新鲜血小板(TACE+/+RT和TACE+RT)或者来自保存的富含血小板的血浆的血小板(TACE+/+48h和TACEvISh)静脉注入到野生型小鼠中(IO8个血小板/IOgm体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果是平均百分比CMFDA-标记的血小板土平均数标准误差。将输注后5分钟时的CMFDA阳性新鲜TACE+/+血小板百分比设为 100%。η = 5。
[0045]图15显示唾液酸酶处理的TACEAZn/AZn血小板被迅速地从循环中清除。(A)糖蛋白上的β_半乳糖暴露的流式细胞分析，如使用ECL FITC-标记的凝集素所检测的。结合至用或者未用a 2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)处理的TACE+/+(白色条)或TACEAZn/AZn(黑色条)血小板的凝集素。显示了结合至未处理的TACE+/+血小板的平均荧光强度的比率。直方图报告了三个单独的实验的平均值土平均数标准误差。*P < 0.05、**P < 0.01、***P< 0.001。(B)通过流式细胞术评定GPIb a、GPV和a IIb β 3表面表达。用唾液酸酶(5mU/mL)(黑色条)或者未用唾液酸酶(白色条)处理的TACE+/+(未显示)和TACEAZn/AZn血小板。结果相对于在TACEAZn/AZn血小板上的GPIba量来表示(相对于对照的平均值％ 土平均数标准误差)。η = 3。(C)将用a 2-3,6,8,9-唾液酸酶(5mU/mL)(实心符号)处理或者未处理(空心符号)的 新鲜、室温和荧光标记的(CMFDA) TACE+/+和TACEazivaZn血小板静脉注入到TACE+/+小鼠中(IO8个血小板/IOg体重)。在指定时间点采集血液并且立即通过流式细胞术分析血小板。结果表示为平均百分比CMFDA-标记的血小板土平均数标准误差。将输注后5分钟时的CMFDA阳性未处理的TACE+/+血小板百分比设为100%。每点表示4只小鼠。n.s.不显著，< 0.0001。比较唾液酸酶处理过的TACE+/+和TACEAZn/AZn。
[0046]图16显示血小板的神经氨酸酶处理增加了 β -半乳糖暴露(唾液酸的损失)，如通过ECL荧光凝集素结合所测量的。在血小板糖蛋白上的β_半乳糖或β-GlcNAc暴露的流式细胞分析，如用ECL I (空心条)或s-WGA (实心条)FITC-标记的凝集素所检测的。在来自产脲节杆菌(Neu)的指定浓度的a 2-3，6，8，9-唾液酸酶存在和缺乏下的凝集素与新鲜小鼠血小板的结合，η = 5。
[0047]图17显示了随着神经氨酸酶浓度增加,血小板GPIb α和GPV受体的剂量依赖性损失。通过流式细胞术评定了在新鲜分离的小鼠血小板上的GPIb α和GPV表面表达。在指定浓度的a 2-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)存在和缺乏下的表面受体表达。将O时间的受体表达的平均荧光设为100%。η = 4。[0048]图18显示DANA抑制了由神经氨酸酶处理所致的β -半乳糖暴露。对小鼠血小板糖蛋白上的半乳糖或0-61(3嫩(:暴露的流式细胞分析，如上文在51^(12-3，6，8，9-唾液酸酶(Neu)和竞争性唾液酸酶抑制剂DANA(Neu+DANA)存在(Neu)和缺乏(对照)下所检测的。η = 4。
[0049]图19显示DANA抑制了由神经氨酸酶处理所诱导的血小板GPIb a、GPV、GPIX以及Cillb β3受体的损失。在5mUa 2-3，6，8，9-唾液酸酶存在(灰色条)和缺乏(空心条)下通过流式细胞术测量在小鼠血小板上的表面受体表达(GPIb a、GPV、GPIX和a IIb β 3)。还显示了用唾液酸酶和DANA处理的血小板上的受体表达(黑色条)。将未处理的血小板上的受体表达的平均荧光设为100%。η = 4。
[0050]图20描绘了总血小板溶解产物(INPUT)、上清液(SUPERNATANT)和相对应的血小板沉淀(PELLET)的非诱导的免疫印迹法印迹，其显示DANA抑制了由神经氨酸酶(NA)诱导的血小板GPIb α的损失。对照表不未处理的样品。
[0051]图21是显示添加DANA完全救助了用神经氨酸酶处理的小鼠血小板的体内恢复和存活的图。对照描绘了未处理的新鲜室温的血小板的存活。
[0052]图22是显示在室温下保存的过程中血小板GPIb α和GPV受体损失因为添加DANA而受到抑制的图。
[0053]图23是描绘了在100 μ M金属蛋白酶(MP)抑制剂GM6001存在下神经氨酸酶处理对β-半乳糖暴露的作用的条形图。通过荧光标记的RCA-1凝集素结合来测量β-半乳糖暴露。
[0054]图24是描绘了在 100 μ M金属蛋白酶(MP)抑制剂GM6001存在下神经氨酸酶处理对血小板GPIb α和GPV受体表面表达的作用的条形图。将MP抑制剂-神经氨酸酶上的受体表达设为100%。
[0055]图25 是描绘了重组 TACE (ADAM17) (TACE)和重组 TACE 和 DANA (TACE+DANA)对血小板GPIb α和GPV受体表面表达的作用的条形图。唾液酸损失的抑制防止由金属蛋白酶TACE所致的受体裂解这个事实显示唾液酸必须在GPIb α和GPV蛋白水解之前从糖蛋白上水解。用重组TACE进行处理没有影响受体GPIX和a IIb β 3 (未显示)。
[0056]图26是描绘了对在新鲜的血小板样品和在4°C和RT下保存指定的时间点的样品中的游离唾液酸(FSA)进行定量的条形图。在每个条形图的顶部还显示了 FSA浓度。注意，当与在4°C下保存相等时间段的样品比较时，在RT保存的血小板样品中检测的FSA显著更闻。
[0057]图27是显示检测在唾液酸酶抑制剂DANA存在或缺乏下保存在4°C或RT下的血小板样品(颜色检测时间=TOCD)中的细菌所需要的时间的照片。在测试样品中的细菌浓度与显色的起始时间成反比，即更短的颜色检测时间=更高的细菌浓度；更长的颜色检测时间=更低的细菌浓度。显示了所选择的第9天样品分析的图片(A-C)。使用如在实例6所述的测定技术来检测细菌。D是显示对在唾液酸酶抑制剂DANA存在或缺乏下保存在4°C或RT下的血小板样品中的细菌分析进行定量的条形图。针对血小板样品绘制TOCD(min)。注意的是，在DANA存在下RT保存的样品所需要的时间等于4°C保存的样品，这表明DANA与4°C保存一样有效地抑制细菌生长。
[0058]图28是描绘在ImM DANA缺乏(48h)或存在(48h+DANA)下在保存溶液中冷藏保存48h的小鼠血小板的存活的线形图。显示新鲜的、分离的血小板(RT)存活用于比较，对于每个存活图，η = 7。
[0059]图29是新鲜血小板(新鲜血小板)大小和密度(A)的流式细胞分析以及DANA、唾液酸乳糖和葡萄糖对稳定的RT保存的小鼠血小板完整性的组合作用，如通过它们的大小(FSC)和密度(SSC)所判断的。在唾液酸乳糖、葡萄糖和DANA缺乏(_防腐剂)(B)和存在(+防腐剂)(C)下在RT保存48h的小鼠血小板的分析。在点图下方显示了相应的血小板数。还显示了防腐剂浓度。
[0060]图30是在指定浓度的DANA缺乏(OmM DANA)或存在下在RT保存48h的小鼠血小板的流式细胞术点图分析。注意的是，0.1mM DANA有效地保护了血小板的大小和密度，如通过点图分析(上图)所判断的。还显示了血小板计数和微珠(参照)的相应的流式细胞术直方图(下图)。
[0061]图31是描绘了在96孔PVC板(图A)的孔中存在或不存在ImM DANA下在不同介质中生长48h的粘质沙雷菌的细胞密度的条形图。图31在图B中描绘了在96孔PVC板的孔中在存在或不存在ImM DANA下在不同介质中孵育48h的粘质沙雷菌的生物膜形成。在图B中还显示，用结晶紫将在每个孔中的生物膜染色，回收该染料并在595nm下进行测量。在595nm处的吸收(A595nm)与生物膜中的细菌细胞成比例。
[0062]图32是显示在从健康受试者中分离的新鲜血小板上的末端β -半乳糖含量的差异的条形图。通过流式细胞术使用β_半乳糖特异性凝集素ECL来测量血小板表面末端半乳糖暴露，如在凝集素与聚糖结构结合的示意图中所描绘的。
[0063]图33 是在添加剂(InterSol)缺乏、ImM DANA (InterSol+DANA)、IOmM 葡萄糖(InterSol+Glucose)以及 ImM DANA 加上 IOmM 葡萄糖(InterSol +DANA+Glucose)存在下在RT保存于按体积计30% 血浆和70% PAS(被称为INTERS0L?溶液)中的小鼠血小板的流式细胞术点图分析和相应的流式细胞术(A)。注意的是，血小板群显得静息，如通过其前向散射和侧向散射特征所判断的。B是显示在具有DANA、葡萄糖或两者的InterSol溶液的门控血小板群中获取的事件的百分比的条形图。
[0064]图34是在0.5mM DANA缺乏((-)DANA)或存在((+) DANA)下保存的血小板的代表性流式细胞术点图分析(上图A)。还显示了血小板计数对侧向散射(SSC)的相应直方图(下图B)。该表表示在DANA缺乏或存在下在侧向散射(SSC-H(MFI))中测量的平均荧光强度(MFI)。
[0065]图35的图A是如图34中所述在DANA缺乏或存在下在血浆中保存人血小板之后的表面P选择素暴露的代表性流式细胞术直方图分析。使用针对P选择素的单克隆FITC结合抗体(⑶62P-FITC)测量P选择素暴露。图35的图B显示了定义为M2的P选择素阳性血小板(如图35图A所示)和相应的MFI的定量。
[0066]图36是在O、0.1和0.5mM DANA存在下在30%血浆和70% PAS溶液(按体积计)(PASa,7.15mM Na2HPO4,2.24mM NaH2P04、IOmM 柠檬酸钠、30mM 乙酸钠、79.2mM NaCl、5.0mMKCl、以及1.5mM MgCl2, pH7.2)中在RT保存7天的人血小板的流式细胞术点图分析。血小板定义为‘G1’，而血小板微颗粒定义为‘G2’。显示每个点图的门统计。
[0067]发明详细说明
[0068]以下是本发明的优选实施例的说明。[0069]血小板添加液(PAS)
[0070]从供体中获得血小板之后，可以将它们悬浮在被称为血小板添加液(PAS)的流体中。基本上,PAS替代了血浆的一部分，其中在血液成分单采(apheresis)过程中放置了分离的血小板。PAS是一种介质，该介质通常是一种生理上相容的水性电解质溶液。除了通常可以如以下所述的不同组合和浓度存在于这些溶液中的某些试剂之外，本发明的PAS溶液包括一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
[0071]迄今为止，使用PAS溶液是因为人们相信它们减少了过敏性和发热性输血反应、促进了 ABO不相容的血小板输注、使得能够使用病原体灭活技术并且使得更多血浆可用于其他目的(例如，用于分级分离)。
[0072]本发明的一个实施例包括具有唾液酸酶抑制剂以及任选地一种聚糖修饰剂的一种PAS溶液。更确切地说，本发明包括具有一种唾液酸酶抑制剂和/或一种聚糖修饰剂的一种PAS组合物以及一种或多种PAS组分(例如，盐类、缓冲液、营养素及其任何组合)。本发明的PAS可以包括多种组分，如一种或多种盐(例如，NaCl、KCl、CaCl2、MgCl2以及MgSO4)、一种或多种缓冲液(例如，乙酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐或磷酸盐)、以及营养素(例如，乙酸钠、葡萄糖酸钠、葡萄糖、麦芽糖或甘露醇)。
[0073]本发明的术语“血小板添加液”或“PAS”是指具有至少一种或多种唾液酸酶抑制剂、一种或多种保存介质组分、以及任选地一种或多种聚糖修饰剂的溶液或介质。“本发明的组合物”包括一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。短语“血小板组合物”或“血小板保存组合物”是指所得的保存组合物(在输注到接受者中之前)，其包含本发明的PAS、血小板以及任选地任何相关血浆和/或抗凝剂。
[0074]本发明的PAS的介质包含生理上相容的水性电解质溶液。这类溶液可含有如钠源、钾源、镁源、钙源、氯化物源以及磷酸盐源的溶液中的离子元素。本发明的PAS还可以含有例如可以按柠檬酸或钠 盐的形式添加的柠檬酸盐源。本发明的溶液进一步包含例如碳源或营养素源，如乙酸盐、葡萄糖或葡萄糖酸盐，并且可以与一种盐组合而存在。在一个实施例中，可以包含磷酸盐源以帮助维持ATP的产生。这些元素可以按从约5mM至约450mM(例如，10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450mM)的范围内的量存在于本发明的溶液中。该溶液维持在从6.4与约7.6 (例如，约7.1至约7.4)的范围内的PH下，并且优选维持在约7.2的pH下。
[0075]在一个实施例中，钠(Na)源可以按在约100与300mM之间(例如，在约150mM与约250mM之间)的量存在于本发明的PAS中。在一个具体实施例中，钠源以约190mM存在。钠可以作为盐或者组合地作为缓冲液或碳源而存在。例如，钠可以按氯化钠(NaCl)、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠或其组合的形式而存在。其他适合的钠源可以用于本发明的PAS中，包括本领域已知或者后来发现的钠源。
[0076]氯(Cl)源也可以按在约40mM与约IlOmM之间(例如，在约60mM与约90mM之间)的量存在于本发明的PAS中。在一个具体方面，氯化物源以约87.2mM存在。氯可以按氯化钠(NaCl)、氯化镁(MgCl2)、氯化钾(KCl)或其组合的形式而存在。本领域已知或后来发现的任何氯化物源都可以用于本发明，只要其适合与本发明的PAS—起使用。主要处于NaCl形式的Na+和Cl—是张度调节剂，它有助于血小板添加液的等渗性。
[0077]在一个实施例中，钾源可存在于本发明的PAS中。它可以按在约0.5mM与约IOmM之间并且例如在约3mM与约8mM之间范围内的量存在。在一个具体实施例中，钾以约5mM的量存在。钾源包括氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾或其组合。本领域已知或后来发现的其他钾源可以用于本发明。在某些方面，在介质中钾离子的存在可以帮助维持细胞内的镁离子浓度。钾离子还可涉及将丙酮酸盐转运通过线粒体膜以用于柠檬酸循环(TCA循环)中的氧化磷酸化。此外，K+通过有助于脂质和蛋白质的电连续性而在膜稳定性中起重要作用。
[0078]镁是可包含在本发明的PAS中的另一种盐。镁源可以按在约0.5mM与约2.5mM之间范围内的量并且具体地说按在约ImM与2mM之间的范围内的量而存在。在一个实施例中，镁以约1.5mM存在于本发明的PAS中。镁源包括氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁以及它们的组合。可以使用本领域已知或后来发现的镁源。在一个实施例中，镁离子可以按接近血浆水平、将为约3mEq/L(1.5mM)的浓度存在于本发明的PAS中。Mg2+可能是维持膜ATP酶活性所必须的。在一方面，介质中的镁离子会维持血小板中的最佳细胞间镁水平并且可以促进血小板中的氧化磷酸化，并且这样做帮助维持介质的pH。而且，Mg2+通过有助于脂质和蛋白质的电连续性而在膜稳定性中起重要作用。
[0079]钙也是可包含在本发明的PAS中的另一种盐。钙源可以按在约0.5mM与约2.5mM之间(例如，在约ImM与2mM之间)范围的量而存在。在某个实施例中，钙以约1.5mM存在于本发明的PAS中。钙源包括氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙或其组合。可以使用本领域已知或后来发现的钙源。
[0080]柠檬酸盐可用于缓冲该溶液。柠檬酸盐源以在约2mM与约20mM之间范围内的量并且例如以5mM和约15mM的量存在于本发明的PAS中。在一方面，本发明的PAS包含约IOmM的柠檬酸盐。可在本发明中使用的柠檬酸盐源的实例包括柠檬酸钠(例如，柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠)、柠檬酸、柠檬酸钾、柠檬酸镁以及它们的组合。可以使用其他柠檬酸盐源，包括本领 域已知或后来发现的柠檬酸盐源，只要它们适合于与本发明的PAS一起使用。柠檬酸盐在本发明的PAS起到多种作用:作为抗凝剂、用于TCA循环的碳源以及缓冲液。
[0081]乙酸盐也是本发明的PAS的另一种组分。乙酸盐是用作分离的血小板的营养素的一种碳源。乙酸盐源可以按在约IOmM与约50mM之间范围内的量并且例如按在约25mM与约45mM之间范围内的量而存在。本发明的PAS包含约30mM的乙酸盐。乙酸盐源包括乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁或其组合。可以使用其他乙酸盐源，包括本领域已知或后来发现的乙酸盐源，只要它们适合于与本发明的PAS —起使用。乙酸用作碳和缓冲液。
[0082]在本发明的PAS中，可以提供一种营养素源。可以单独或者以各种组合来使用乙酸盐和其他碳水化合物如葡萄糖或蔗糖以及柠檬酸盐，以通过作为在柠檬酸循环中产生能量的中间代谢物源而为保存中的血小板提供能源。可以使用碳源的组合。在使用葡萄糖和/或蔗糖的情况下，该浓度可以按从约0.5mM至约25mM(例如，约2mM至约22mM)范围内的量而存在。
[0083]其他营养素可以取代本发明的PAS的乙酸盐或与其一起被包含在内。例如，草酰乙酸盐可以存在于本发明的PAS中，或者在已经将本发明的PAS添加到富含血小板的部分中之后，可以将其添加到血小板悬浮液中。草酰乙酸盐是线粒体中发现的四碳分子，它与乙酰CoA缩合而形成TCA循环(柠檬酸循环)的第一个反应。草酰乙酸盐可以直接或者以前体氨基酸如天冬氨酸的形式供应给保存的血小板。在一些实施例中，草酰乙酸盐可以按从约IOmM至约45mM存在于本发明的PAS中。更具体地说，草酰乙酸盐可以按从约20mM至约40mM、或者从约24mM至约36mM、或者从约28mM至约33mM存在于本发明的PAS中。
[0084]磷酸盐(PO4)是本发明的PAS中可使用的另一种组分。磷酸盐源可以按在约5mM与约50mM之间(例如，在约20mM与40mM之间)范围内的量存在于本发明的PAS中。在一个具体实施例中，磷酸盐源以约28mM存在。磷酸盐的形式包括单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠或其组合。可以使用本领域已知的或在未来发现的其他磷酸盐源。
[0085]组分如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐可以与一种或多种盐(如钙盐、镁盐、钾盐或钠盐或者这些盐的任意子组合)组合地添加以平衡缓冲溶液的摩尔渗透压浓度。
[0086]在一个实施例中，本发明的PAS包含一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂、以及下表1中描述的组分:
[0087]表1:
[0088]
【权利要求】
1.一种血小板添加液(PAS)，包含:a)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；以及 b)一种或多种PAS组分，所述PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
2.如权利要求1所述的PAS，其中该PAS被维持在范围在约6.4与约7.6之间的pH下。
3.如权利要求1所述的PAS，进一步包含一种磷酸盐源。
4.如权利要求3所述的PAS，其中该磷酸盐源选自下组，该组由以下各项组成:单磷酸钠、二磷酸钠、三磷酸钠、以及它们的组合。
5.如权利要求1所述的PAS，其中该柠檬酸盐源选自下组，该组由以下各项组成:柠檬酸一钠、柠檬酸二钠、柠檬酸三钠、柠檬酸、以及它们的组合。
6.如权利要求1所述的PAS，其中该碳源选自下组，该组由以下各项组成:乙酸盐、葡萄糖以及蔗糖。
7.如权利要求6所述的PAS，其中该乙酸盐选自下组，该组由以下各项组成:乙酸钠、乙酸钾、乙酸镁、以及它们的组合。
8.如权利要求1所述的PAS，其中该盐选自下组，该组由以下各项组成:一种钠源、氯化物源、钾源、镁源、钙 源、以及它们的组合。
9.如权利要求8所述的PAS，其中该钠源选自下组，该组由以下各项组成:氯化钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钠、以及它们的组合。
10.如权利要求8所述的PAS，其中该氯化物源选自下组，该组由以下各项组成:氯化钠、氯化镁、氯化钾、以及它们的组合。
11.如权利要求8所述的PAS，其中该钾源选自下组，该组由以下各项组成:氯化钾、柠檬酸钾、乙酸钾、磷酸钾、硫酸钾、以及它们的组合。
12.如权利要求8所述的PAS，其中该镁源选自下组，该组由以下各项组成:氯化镁、柠檬酸镁、硫酸镁、以及它们的组合。
13.如权利要求8所述的PAS，其中该钙源选自下组，该组由以下各项组成:氯化钙、乙酸钙、柠檬酸钙、以及它们的组合。
14.如权利要求1所述的PAS，其中一种或多种PAS组分包含: a)在约IOOmM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源； b)在约40mM与约IlOmM之间的范围内的量的一种氯化物源； c)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源； d)在约IOmM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源； e)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源； f)在约0.5mM与约IOmM之间的范围内的量的一种钾源； g)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源；以及 h)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源。
15.一种血小板组合物，包含: a)分离的血小板； b)一种PAS，该PAS包含: i)一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和ii) 一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合；以及c)血浆； 其中该血小板组合物被维持在范围在约6.4与约7.6之间的pH下。
16.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该血浆以按体积计在约1%与约50%之间范围内的量存在。
17.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该血小板添加液以按体积计在约50%与约99 %之间范围内的量存在。
18.如权利要求15所述的血小板组合物，其中该一种或多种PAS组分包含: i)在约IOOmM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源； ii)在约40mM与约IlOmM之间的范围内的量的一种氯化物源； iii)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源； iv)在约IOmM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源； V)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源； vi)在约0.5mM与约IOmM之间的范围内的量的一种钾源； vii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源； viii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源； 其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
19.一种袋或容器，包括: a)适合用于血小板保存的一个袋或容器；以及 b)一种PAS，该PAS包含: i)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和 ii)一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
20.如权利要求19所述的袋或容器，进一步包含分离的血小板。
21.如权利要求19所述的袋或容器，其中该PAS被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
22.如权利要求19所述的袋或容器，其中一种或多种PAS组分 i)在约IOOmM与约300mM之间的范围内的量的一种钠源； ii)在约40mM与约IlOmM之间的范围内的量的一种氯化物源； iii)在约2mM与约20mM之间的范围内的量的一种柠檬酸盐源； iv)在约IOmM与约50mM之间的范围内的量的一种乙酸盐源； V)在约5mM与约50mM之间的范围内的量的一种磷酸盐源； vi)在约0.5mM与约IOmM之间的范围内的量的一种钾源； vii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种镁源； viii)在约0.5mM与约2.5mM之间的范围内的量的一种钙源； 其中该血小板组合物被维持在约6.4与约7.6之间范围内的pH下。
23.如权利要求19所述的袋或容器，进一步包含分离的血小板。
24.一种保存血小板的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体获得的，该方法包括: a)使分离的血小板与一种PAS接触，这种PAS包含: i)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂；和 ii)一种或多种PAS组分，该PAS组分包括一种盐、一种柠檬酸盐源、一种碳源、以及它们的任何组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)~2~ ((IR, 2R) -1，2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
26.如权利要求25所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
27.如权利要求24所述的方法，其中分离的血小板被保存约I天至约21天的一段时间。
28.如权利要求24所述的方法，其中分离的血小板在约2°C与约25°C之间的温度下保存。
29.如权利要求24所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
30.如权利要求24所述的方法，进一步包括在一段时间内用该唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间段是在约I分钟至约8小时之间的范围内。
31.一种制备血小板以供保存的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体获得的，该方法包括: 使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触。
32.如权利要求31所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀 ~2~ 基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基_4_氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S, 4R) _3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
33.如权利要求32所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
34.如权利要求31所述的方法，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
35.如权利要求34所述的方法，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
36.如权利要求31所述的方法，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
37.如权利要求31所述的方法，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
38.一种制备血小板以供保存的方法，该方法包括: a)从一位或多位个体分离出血小板； b)使分离的血小板与一种唾液酸酶抑制剂接触，该抑制剂处于足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解的量。
39.如权利要求38所述的方法，其中血小板受体损失发生降低。
40.如权利要求39所述的方法，其中该血小板受体损失的降低包括GPIbα损失、GPV损失或这两者的降低。
41.一种增加分离的血小板的体内循环时间的方法，该方法包括: a)从一位或多位个体获得分离的血小板； b)用一定量的一种或 多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂处理血小板，以便由此获得处理过的血小板； c)将处理的血小板输注到有此需要的个体的体内，以便由此获得输注的血小板； 其中与未经受步骤a)的血小板相比，所输注的血小板的循环时间更长。
42.如权利要求41所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
43.如权利要求41所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
44.一种血小板制剂,包含一种唾液酸酶抑制剂和一个血小板群；其中该稳定的血小板制剂是通过以下方法制备的: a)从一个供体获得一个血小板群；并且 b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板；并且 其中该血小板制剂适合用于在保存之后给予人体而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加。
45.一种血小板制剂,包含: i)从一个供体中分离的血小板；和 ii)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
46.一种试剂盒，包括:能够接收和容纳一个血小板群的一个无菌容器，该容器是基本上与环境隔离的；以及一定无菌量的一种唾液酸酶抑制剂。
47.如权利要求46所述的试剂盒，其中该容器适合用于血小板的冷保存。
48.如权利要求46所述的试剂盒，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)~2~ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
49.如权利要求48所述的试剂盒，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
50.如权利要求46所述的试剂盒,进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。
51.如权利要求50所述的试剂盒，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
52.如权利要求16所述的试剂盒，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
53.如权利要求50所述的试剂盒，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
54.如权利要求50所述的试剂盒，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
55.—种无菌袋或容器,包括: a)适合用于血液保存的一个无菌袋或容器；以及 b)一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂。
56.一种用于在来自一个或多个供体的血小板产品制剂中降低唾液酸酶活性并且抑制一种或多种细菌的增殖的方法，该方法包括以下步骤: a)使该血小板产品制剂与一定量的一种唾液酸酶抑制剂接触，以便由此获得一种唾液酸酶处理过的血小板产品制剂； 其中与未经受步骤a)的血小板产品制剂相比，该唾液酸酶活性被降低并且一种或多种细菌的增殖被抑制。
57.如权利要求56所述的方法，其中该被抑制的细菌包括在血小板产品制剂中发现的细菌。
58.如权利要求56所述的方法，其中该被抑制的细菌选自下组，该组由以下各项组成:曲霉菌属(Aspergillus)、芽抱杆菌属(Bacillus sp)、艾氏拟杆菌(Bacteroideseggerthii)、白色念珠菌(Candida albicans)、朽1 樣酸杆菌属(Citrobacter sp)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp)、类白喉菌(Diphtheroid)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogene)、河生肠杆菌(Enterobacteramnigenus)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、幾肠球菌(Enterococcus faecalis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、梭形杆菌属(Fusobacterium spp.)、Htt 邻颗粒链菌(Granulicatella adiacens)、幽门螺杆菌(Heliobacter pylori)、克雷伯菌属(Klebsiella sp)、(肺炎克雷伯菌(K.pneumonia)、产酸克雷伯菌(K.0xytoca))、乳酸杆菌属(Lactobacillus sp)、李斯特菌属(Listeriasp)、微球菌属(Micrococcus sp)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、假单胞菌属(Pseudomonas sp)、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属(Propionibacterium sp)、沙门菌属(Salmonella sp)、沙雷菌属(Serratia sp)、粘质沙雷菌(Serratia marcescens)、葡萄球菌属(Staplhylococcus sp)(凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative Staphylococcus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus))、链球菌属(Streptococcus sp)、(解没食子酸链球菌(S.gallolyticus)、牛链球菌(S.bovis)、酿脓链球菌(S.pyogenes)、草绿色链球菌(S.viridans))、以及小肠结肠炎耶尔森菌(Yersinia enterocolitica)。
59.如权利要求56所述的方法，进一步包括以下步骤:评定该唾液酸酶抑制剂处理过的血小板产品制剂的细菌增殖，并且将该评定与一个对照进行比较。
60.如权利要求56所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯_1_羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
61.如权利要求60所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
62.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与一种或多种聚糖修饰剂接触，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
63.如权利要求62所述的方法，进一步包括将该血小板产品制剂与一种酶接触，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
64.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与一种或多种聚糖修饰剂接触，其中该聚糖修饰剂是Μ)Ρ半乳糖。
65.如权利要求56所述的方法，进一步包括使该血小板产品制剂与两种聚糖修饰剂接触，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
66.一种降低在来自个体的血小板制剂或血小板样品中的唾液酸酶活性并且抑制细菌增殖的方法，其中该细菌选自下组，该组由以下各项组成:曲霉菌属、芽孢杆菌属、艾氏拟杆菌、白色念珠菌、柠檬酸杆菌属、产气荚膜梭菌、棒状杆菌属、类白喉菌、产气肠杆菌、河生肠杆菌、阴沟肠杆菌、鸟肠球菌、粪肠球菌、大肠杆菌、梭形杆菌属、Btt邻颗粒链菌、幽门螺杆菌、克雷伯菌属、(肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌)、乳酸杆菌属、李斯特菌属、微球菌属、消化链球菌、普通变形杆菌、假单胞菌属、Pseudomys oralis、丙酸杆菌属、沙门菌属、沙雷菌属、粘质沙雷菌、葡萄球菌属(凝固酶阴性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌)、链球菌属、(解没食子酸链球菌、牛链球菌、酿脓链球菌、草绿色链球菌)、以及小肠结肠炎耶尔森菌；该方法包括以下步骤: a)使至少一种唾液酸酶抑制剂与该制剂接触； 其中与未经受步骤a)的制剂相比，该唾液酸酶活性被降低并且一种或多种细菌的增殖是被抑制。
67.一种抑制在保存期间血小板中的细菌增殖的方法，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的，该方法包括: a)使分离的血小板与一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且 b)在一个或多个时点评定分离的血小板中的细菌增殖； 其中在分离的血小板中的细菌增殖被抑制。
68.如权利要求67所述的方法，其中使该血小板制剂与该唾液酸酶抑制剂接触，该抑制剂处于足以减少唾液酸残基从血小板表面聚糖上的水解的量。
69.如权利要求67所述的方法，其中分离的血小板被保存约I天至约21天的一段时间。
70.如权利要求67所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3_脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S) -5-氨基-4-乙酰胺基-3-(戊-3-基氧基)-环己-1-烯_1_羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基 _3_ (丙-1-稀-2-基氛基)_2_ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基-4-氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
71.如权利要求70所述的方法，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
72.如权利要求67所述的方法，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
73.如权利要求67所述的方法，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
74.如权利要求67所述的方法，其中该聚糖修饰剂是Μ)Ρ半乳糖。
75.如权利要求67所述的方法，其中分离的血小板在约1°C与约24°C之间的温度下保存。
76.如权利要求75所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
77.如权利要求75所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
78.一种制备血小板以供保存的方法，在保存期间唾液酸酶活性被降低并且细菌增殖被抑制，其中分离的血小板是从一个或多个供体中获得的，该方法包括: a)使分离的血小板与一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂接触；并且 b)评定分离的血小板中的细菌增殖，其中与一个对照相比，在分离的血小板中的细菌增殖被抑制。
79.—种增加血小板群的保存时间的方法，该方法包括: a)从一位或多位个体中获得一个血小板群；并且 b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理过的血小板。
80.如权利要求79所述的方法，进一步包括在一段时间范围内用该唾液酸酶抑制剂处理该血小板群，其中该时间范围是在约I分钟至约8小时之间的范围内。
81.如权利要求79所述的方法，进一步包括在室温下保存该血小板组合物一段时间。
82.如权利要求81所述的方法，进一步包括将该血小板组合物冷却至低于室温的温度；保存该血小板组合物一段时间；并且然后将该血小板组合物复温回至室温。
83.—种通过降低唾液酸酶活性和抑制细菌增殖来增加血小板群的保存时间的方法，该方法包括:a)从一位或多位个体中获得一个血小板群；并且 b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板，从而获得处理过的血小板， 其中与未经受唾液酸酶抑制剂的血小板相比，该细菌增殖被抑制。
84.—种用于输注分离的血小板的方法,该方法包括: a)从一位或多位个体中获得分离的血小板； b)用一定量的一种或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂处理血小板，从而获得展现出抑制的细菌增殖的处理过的血小板；并且 c)将处理过的血小板输注到有此需要的个体中； 其中与未经受步骤b)的血小板相比，该细菌增殖被抑制。
85.一种用于维持在保存之后输注到一个接受者中的血小板的止血活性的方法，其中血小板是从一个供体中获得和分离的，从而获得分离的血小板，该方法包括: a)使分离的血小板与一定量的一种唾液酸酶抑制剂接触,从而获得处理过的血小板； b)将处理过的血小板保存约I天与14天之间的一段时间； c)将这些保存的、处理过的血小板输注到有此需要的接受者中，从而获得输注的血小板； 其中与未经受步骤a)的血小板相比，输注的血小板可以活化并形成凝块。
86.—种血小板制剂,包含一种唾液酸酶抑制剂和一个血小板群；其中该稳定的血小板制剂是通过以下方法制备的: a)从一个供体中获得一个血小板群；并且 b)用有效量的一种唾液酸酶抑制剂处理血小板；并且 其中该血小板制剂适合用于在保存之后给予人体而与未处理的血小板相比在人体中没有止血功能的显著损失或没有血小板清除的显著增加；并且 其中该血小板制剂展现出抑制的细菌增殖，如与未用唾液酸酶抑制剂处理的一种血小板制剂相比。
87.如权利要求86所述的血小板制剂，其中，在处理血小板之后，该制备进一步包括以下另外的步骤: a)在室温下保存该血小板制剂一段时间。
88.如权利要求86所述的血小板制剂，其中，在处理血小板之后，该制备进一步包括以下另外的步骤: a)将该稳定的血小板制剂冷却至低于室温的温度； b)保存该血小板制剂一段时间； c)将该血小板制剂复温回至室温；并且 d)评定该血小板制剂的细菌增殖。
89.如权利要求86所述的血小板制剂，其中该唾液酸酶抑制剂选自下组，该组由以下各项组成:胎球蛋白，2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸(DANA)或其药学上可接受的盐；(3R，4R，5S)-5-氨基-4-乙酰胺基_3_(戊-3-基氧基)-环己-1-烯-1-羧酸)乙酷；(2R, 3R, 4S) -4-狐基-3-(丙-1-烯-2-基氨基)~2~ ((IR, 2R) -1, 2, 3- 二羟基丙基)-3，4- 二氢-2H-吡喃-6-羧酸；(4S，5R，6R) -5-乙酰胺基_4_氨基甲酸亚胺酰胺基(carbamimi dami do) _6_[ (IR, 2R) -3-羟基-2-甲氧基丙基]-5,6_ 二氧-4H-批喃-2-竣酸；以及(IS, 2S, 3S,4R)_3_[ (IS)-1-乙酰胺基-2-乙基-丁基]-4_( 二氨基亚甲基氨基)-2-羟基-环戊烷-1-羧酸，或其药学上可接受的盐。
90.如权利要求89所述的血小板制剂，其中该唾液酸酶抑制剂是2，3-脱氢-2-脱氧-N-乙酰神经氨酸的钠盐。
91.如权利要求89所述的血小板制剂，进一步包含有效量的至少一种聚糖修饰剂。
92.如权利要求91所述的血小板制剂，其中该聚糖修饰剂是CMP唾液酸或一种CMP唾液酸前体。
93.如权利要求89所述的血小板制剂，进一步包含一种酶，该酶将该CMP唾液酸前体转化为CMP唾液酸。
94.如权利要求91所述的血小板制剂，其中该聚糖修饰剂是UDP半乳糖。
95.如权利要求91所述的血小板制剂，其中这些聚糖修饰剂是CMP唾液酸和UDP半乳糖。
96.—种血小板制剂,包含: i)从一个供体分离的血小板；以及 ii)一定量的一种 或多种唾液酸酶抑制剂以及任选地一种或多种聚糖修饰剂； 其中该血小板制剂展现出抑制的细菌增殖，如与未用唾液酸酶抑制剂处理的一种血小板制剂相比。
【文档编号】A61K35/14GK103702556SQ201280023800
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2012年5月17日 优先权日:2011年5月17日
【发明者】启勇彼得·刘, K·霍夫麦斯特, R·萨克斯坦 申请人:维利科医疗公司, 布赖汉姆妇女医院