抗体变体及其用途

抗体变体及其用途
【专利摘要】本发明描述了包含变体Fc域的多肽和相关抗体。当多肽、抗体或多种抗体连接到细胞表面的其靶标、抗原或多种抗原上时，变体Fc域提供稳定化的Fc：Fc相互作用，由此提供改进的效应子作用，如CDC应答。
【专利说明】抗体变体及其用途 发明领域
[0001] 本发明涉及包含变体Fc域的多肽及相关抗体。更具体地，本发明涉及包含Fc域 的抗体或多肽，其具有由Fc域中一个或多个氨基酸修饰带来的修饰的效应子作用。
[0002] 发明背景
[0003] 由抗体Fc域介导的效应子作用允许破坏外来实体，如杀灭病原体以及清除和降 解抗原。抗体依赖性细胞介导细胞毒性（ADCC)和抗体依赖性细胞介导吞噬（ADCP)由Fc区 与具有Fc受体（FcR)的细胞的结合起始，而补体依赖性细胞毒性（CDC)由Fc区与Clq的 结合起始，这起始补体激活的经典途径。
[0004] 每个IgG抗体包含两个Clq结合位点，每个重链恒定（Fe)区中各一个。然而，由于 单体IgG对Clq的亲和力非常弱（K d?I(T4M)，溶液中的单个IgG分子不激活补体（Sledge 等，1973J. Biol. Chem. 248, 2818-13 ;Hughes-Jones 等，1979Mol. Immunol. 16, 697-701)。 抗原驱动的IgG关联可导致多价Clq分子更紧密结合（Kd?I(T8M)和补体激活（Burton 等，1990M〇1. Immunol. 22, 161-206)。相比之下，IgM以共价连接的五或六聚体天然存在，与 细胞表达或固定的抗原结合后，IgM五聚体和六聚体可以有效的引起CDC。抗原结合是诱导 IgM构象变化以暴露Clq结合位点必需条件（Feinstein等，1986, ImmunologyToday, 169-17 4)。
[0005] 已经提出通过Fc区CH2/CH3域的相互作用形成六聚体环结构，IgG也能 完成补体激活（Burton 等，1990Trends in Biochem. Sci. 15, 64-69)。支持此六聚 体 IgG 结构存在的证据已经在二维（Reidler 等，1986IHandbook of Experimental Immunology 第 4 版·（Weir, D. M.编),ρρ17. 1-17. 5. Blackwell, Edinburgh ；Pinteric 等，1971Immunochem. 8, 1041-5)和三维晶体中，以及对溶液中的IgGl、IgG2a和IgG4和 人 Fe 找到（Kuznetsov 等，2000J Struct. Biol. 131，108-115)。六聚体环的形成也在针 对抗HIV-lgpl20的bl2人IgGl κ抗体的晶体结构（PDB中的1HZH)中观察到（Saphire 等，Science2001Augl0;293(5532)，1155-9)。在bl2六聚体环中，六个易接近的Clq结合 位点位于六聚体表面，一个来自于六个抗体中的每个抗体，而其他六个结合位点面向下。
[0006] Clq类似六球头的郁金香束，包含系于六个胶原杆上的抗体结合区[Perkins 等，1985BiochemJ. 228, 13-26 ;Poon 等，1983JMolBiol. 168, 563-77 ;Reid 等，1983Biochem Soc Transl 1，1-12 ;Weiss 等，1986J. Mol. Biol. 189, 573-81]。发现 Clq 与 IHZH 晶体结 构的bl2六聚体组装配合，以使六个球头中每一个与六个Clq结合位点中的一个相接触 (Parren, FASEB Summer Research Conference, Snowmass, Co.，5_10July2010 ;''Crystal Structure of an intact human IgG:implications for HIV-Ineutralization and effector Function"，Erica Ollmann Saphire 著，the Scripps Research Institute, La Jolla, California. November2000)。晶体结构中对称相关的bl2抗体之间观察到的Fe界 面中所选氨基酸的突变被发现降低Clq结合亲和力，表明了这些氨基酸对分子间Fc:Fc相 互作用的贡献。
[0007] US2011/0123440描述了改变的抗体Fc区及其用途。改变的Fc区有一个或多个氨 基酸取代。
[0008] US2008/0089892描述了多肽Fe区变体及包含这些Fe区变体的组合物。
[0009] US2010/0184959描述了提供有改变的Fe配体识别和/或效应子作用的Fe多肽变 体的方法。
[0010] US2010/015133描述了通过调节多肽关联来生产多肽的方法。
[0011] US2010/105873描述了生成多域蛋白疗法的综合方法。
[0012] US6, 737, 056描述了有改变的效应子作用的多肽变体。
[0013] 之前已做出努力以识别具有增强的效应子作用或其他修饰特性的抗体 Fe变体。这样的研究集中于，如，在IgG同种型之间交换片段以产生嵌合IgG分 子（Natsume 等，2008Cancer Res68(10) ,3863-72)，或者在绞链区（Dall'Acqua 等，2006J Immunol 177, 1129-1138)或在CH2域的Clq结合位点处或其附近，围绕残 基 D270、K322、P329 和 P331 (Idusogie 等，2001J Immunoll66, 2571-2575 ;Michaelsen 等，2009Scand J Immunol70, 553-564 和 W099/51642)的氨基酸取代。例如，Moore 等（2010mAbs2(2), 181-189)描述 了检测 S267E、H268F、S324T、S239D、I332E、G236A 和I332E的各种组合的通过⑶C或ADCC的增强的效应子作用。影响与Fe受体结合 (W02006/105062, W000/42072,美国专利6, 737, 056和美国专利7, 083, 784)或抗体物理特 性（W02007/005612A1)的其他Fe突变也已经提出。
[0014] 尽管本领域中有这些和其他进步，然而，仍然有对新的和改进的基于抗体疗法的 需求。
[0015] 发明概述
[0016] 本发明提供了相比其亲本多肽/抗体其具有增强的效应子作用的多肽和抗体变 体。不限于理论，认为变体能在两个多肽/抗体分子Fe区之间有更稳定的连接相互作用， 由此提供更亲和的表面，其能导致增强的效应子作用，如提高的或更特异的CDC应答。特定 变体的特征也在于改进的ADCC应答、ADCP应答、和/或其他增强的效应子作用。如本发明 所述，多肽/抗体工程的这种微妙机制可以被应用于，例如提高基于抗体疗法的效力或特 异性。
[0017] 因此本发明的一个方面涉及包含免疫球蛋白的Fe域和结合区的亲本多肽的变 体，其中变体在选自对应人IgGl重链Fe区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、 Q311、D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基处包含突 变，条件是在S440的突变为S440Y或S440W。
[0018] 本发明也提供至少一个这样的突变的用途，当多肽或抗体结合于例如抗原表达细 胞、细胞膜或病毒粒子表面上的其抗原上时，提高由多肽或抗体介导的效应子作用。
[0019] 在一个本发明中被称为"单突变体"的方面，该变体相比亲本多肽或抗体具有提高 的效应子作用。
[0020] 在一个本发明中被称为"双突变体"的方面，该变体在所述片段中包含至少两个 突变，并相比仅包含两个突变中一个的变体、亲本多肽或抗体，或两者具有改进的效应子作 用。
[0021] 在一个本发明中被称为"混合突变体"的方面，该变体在与相同或不同多肽或抗体 在所述区段的不同氨基酸残基处包含突变的第二变体组合使用时，相比一种或多种变体、 第二变体和单独亲本多肽或抗体提供提高的效应子作用。
[0022] 通常，突变是氨基酸取代，如突变将亲本氨基酸残基交换为具有不同大小和/或 促进新分子间Fc:Fc键形成或提高现存对相互作用强度的物理化学特性的氨基酸。对于根 据本发明的突变的示例性氨基酸残基，连同示例性氨基酸取代示于表1和2A和B中。本发 明不同方面的非限制性展示在图1中提供。
[0023] 本发明的这些和其他方面，具体是抗体变体的多种用途和治疗应用，在下面更详 细地描述。
[0024] 附图简述
[0025] 图I :(A)六聚体形式IgG分子的示意性展示。虚线圈显示了两个相邻IgG分子的 两个接近的Fc:Fc相互作用对。框中的箭头显示了观看B、C和D中图示的方向：两个邻近 的Fc分子旋转90° (在图的平面中）并从CH3域方向的Fab臂观看。（B)观察到的寡聚 增强突变对CDC的效果。示意性展示显示了根据本发明单突变体和双突变体方面具有增强 效力的Fc:Fc相互作用对。（C)观察到的寡聚抑制突变对CDC的效果。示意性展示显示了 根据本发明双突变体和混合突变体方面，相互补偿的至少两个寡聚抑制突变怎样组合入一 个分子（双突变体方面）或者在两个分子上分离（混合突变体方面），以恢复或提高Fe:Fc 相互作用。混合突变体实现依赖于两个抗体结合的特定效应子作用，这可以识别不同的靶 标。（D)Clq结合抑制突变对⑶C的理论效果。Fc:Clq相互作用的示意性展示显示了由于 Clq不能补偿引入抗体的缺陷，如果突变抑制Clq结合，其不能组合或混合以恢复CDC活性。
[0026] 图 2 :对应 IgGl 重链中残基 P247 到 K447 的人 IgGl，IgGlf，IgG2, IgG3 和 IgG4Fc 片段的比对，使用Clustel2. I软件，按Kabat中所列EU索引编号。显示的序列代表人IgGl 重链恒定区域（SEQIDN0:1 ;UniProt获取号P01857)和IgGlm(f)的同种异型变体的残基 130 到 330 ;IgG2 重链恒定区域的残基 126 到 326(SEQIDN0:2 ;UniProt 获取号 P01859); IgG3重链恒定区域的残基177到377 (SEQIDN0:2 ;UniProt获取号P01860);和IgG4重链恒 定区域的残基 127 到 327(SEQIDN0:4 ;UniProt 获取号 P01861)。
[0027] 图 3A 和 B :IgGl(SEQIDN0:3)、IgG4(SEQIDN0:5)和（部分）IgG3(SEQIDN0:6)骨 架中的抗EGFr抗体2F8的序列比对。描述了按照Kabat和按照EU索引的氨基酸编号（两 者都在 Kabat 等，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5 版，Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，MD. (1991)中描述）。
[0028] 图4 :多聚体（如六聚体）排布中邻近分子（分别为Fe和Fc'）Fc之间K439/S440 相互作用详细视图，显示了野生型、未修饰的Fc和Fc'分子之间的相互作用。
[0029] 图5 :多聚体（如六聚体）排布中邻近分子（分别为Fc和Fc'）Fc之间K439/S440 相互作用详细视图，显示了包含K439E和S440K突变的变体Fc和Fc '分子之间的相互作用。
[0030] 图6 :用7D8Fc:Fc突变体的Clq结合ELISA。系列浓度的所示抗体被涂覆到微量 滴定板孔上并与固定浓度的Clq温育。除了 I253D，所有包被的变体与Clq结合的效率可与 野生型7D8相比。显示了至少3个实验的示意。
[0031] 图7 :7D8变体介导的对CD20阳性Raji细胞的CDC15Raji细胞与7D8变体（K439E， S440K，K439E/S440K双突变体，K439E+S440K混合）和系列浓度的Clq温育以通过测量细胞 裂解测试CDC效力。显示了重复实验的示意图。
[0032] 图 8: 7D8 变体（7D8-WT，K439E，S440K，K439E/S440K 双突变体，K439E+S440K 混合） 介导的对⑶20阳性Daudi细胞的⑶C。测试了系列浓度的7D8变体的诱导⑶C的效力。
[0033] 图9 :⑶38抗体HuMAb005突变体介导的对⑶38阳性细胞的⑶C。（A) 005突变体 系列浓度对Daudi细胞的⑶C效力。（B) HuMAb005突变体系列浓度对Raji细胞的⑶C效 力。（C)具有20 %或50 % NHS的HuMAb005的E345R突变体对Wienl33细胞的CDC效力。 (D)具有20%或50%NHS的HuMAb005 和7D8的E345R突变体对Raji细胞的CDC效力。
[0034] 测试从瞬时转染中分离的未纯化抗体样品。使用模拟转染细胞的上清作为阴性对 照。
[0035] 图10 :与Fc结合肽的竞争性实验中，⑶38抗体HuMAb005 (A)和⑶20抗体 HuMAb7D8 (B)的野生型和E345R突变体的CDC。CDC后对与系列浓度Fc结合DCAWHLGELVWCT 肽（SEQIDN0:7)温育的抗体调理的Daudi细胞测量细胞裂解。使用从瞬时转染中分离的未 纯化抗体样品。使用模拟转染细胞的上清作为阴性对照。
[0036] 图 11 :野生型 CD38 抗体 HuMAb005 和突变体 IgGl-005-E345R 的 CD38 表达 Daudi 细胞的ADCC。表示为％裂解，显示了一个供体PBMC的ADCC。
[0037] 图12 :在pH6,如通过ELISA确定的，野生型的IgGl-7D8和变体IgGl-7D8-E345R 与人、猴和小鼠FcRN的结合。
[0038] 图13 :在SCID小鼠中静脉注射后，野生型IgGl-7D8和-E354R，-S440K和K322A 变体的血浆浓度。
[0039] 图 14A、B、C 和 D :对 CD20 和 CD38 阳性 Wienl33 细胞的 CDC。
[0040] 图15A和B :在使用Raji-luc#2Dl细胞的皮下移植肿瘤模型中IgGl-7D8-E345R的 体内效力的评价。
[0041] 图16A和B :在使用Raji-luc#2Dl细胞的皮下移植肿瘤模型中IgGl-005-E345R的 体内效力的评价。
[0042] 图17 :具有E345R突变的CD38/EGFR双特异性抗体对CD38阳性、EGFR阴性 Wienl33 细胞的 CDC。
[0043] 图18A和B :具有或没有E345R突变的CD20/CD38双特异性抗体对CD20阳性、CD38 阴性的Wienl33细胞或Raji细胞的CDC。
[0044] 图19 :具有E345R突变的EGFR抗体2F8对EGFR阳性A431细胞的CDC。
[0045] 图20A和B :E345R突变体抗体介导的CDC。
[0046] 图21 :具有溶酶体标记LAMPl (APC)的TF抗体（FITC)的共定位分析。
[0047] 图22A-D :引入E345R突变导致与在不同B细胞系中测试的野生型利妥昔单抗相 t匕，⑶C介导的杀伤增强。
[0048] 图22E :引入E345R导致与野生型利妥昔单抗相比最大⑶C介导的杀伤提高，其 独立于具有可比较⑶20表达水平的不同B细胞系中补体调节蛋白⑶46(A)、⑶55 (B)或 ⑶59 (C)的表达水平。
[0049] 图23 :⑶C动力学。相比野生型抗体，E345R抗体导致更迅速和更大量的由⑶C所 致的靶细胞裂解。
[0050] 图24 :⑶C动力学。在双特异性⑶38x⑶20抗体中引入E345R突变导致更迅速和 更大量的CDC介导的靶细胞裂解。
[0051] 图25A-B :⑶C动力学。在单价结合EGFR阴性Ra j i细胞的双特异性抗体 CD38xEGFR(A)和CD20xEGFR(B)中引入E345R突变导致更迅速和更大量的CDC介导的靶细 胞裂解。
[0052] 图 26A-F :野生型抗体与含（A-C)E345R 和 Q386K 或（D-F)E345R、E430G 和 Q386K 的突变体抗体的组合对Wienl33细胞的CDC。IgGl-bl2突变体不结合Wienl33细胞并被用 作阴性对照抗体。
[0053] 图27 :含E345R突变的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4同种型抗体的CDC效力。
[0054] 图28 :在野生型⑶38抗体005中引入Fc-Fc稳定E345R突变导致离体⑶C测定 法中原代CLL细胞杀伤增强（平均土均值的标准偏差）。
[0055] 发明详述
[0056] 如本发明中所述，令人惊奇地，不直接参与Fe:Clq结合的氨基酸中的突变仍然能 提高抗体的CDC，并也能改进抗体的其他Fc介导的效应子作用。这支持了抗体分子如IgGl 抗体能形成随后被Clq连接的寡聚结构的假设。此外，尽管发现某些突变降低CDC诱导，相 同或不同抗体分子中这样突变的某些组合导致CDC诱导的恢复，并显示对抗体寡聚的更多 特异性，并由此促进更特异的CDC诱导。如实施例中所示，提高CDC应答的特定突变特征也 在于改进的ADCC应答，提商的未和力，提商的内化和在鼠肿瘤I旲型系统中的体内效力。这 些发现允许有增强CDC诱导能力，更有选择性的CDC诱导，和/或其他改进的效应子作用的 新的基于抗体的疗法。
[0057] 本发明的抗体变体全包含抗原结合区以及全长或部分Fc区，其在对应IgGl中氨 基酸残基P247到K447的区段中包含至少一个突变。不限于理论，基于图1中示意性展示 并在本发明中被称为"单突变体"、"双突变体"和"混合突变体"的三个不同的原理，认为识 别的突变导致更有效和/或更特异的CDC诱导。
[0058] 来自本发明变体的改进的Clq和/或CDC效应主要仅是在允许抗体寡聚体形成的 检测中，如在抗原没有固定但位于流体膜上的基于细胞的检测中能检测到。此外，从更稳定 的抗体寡聚体得到而不是从Clq直接结合位点的修饰得到的这些效应可以根据图IC所示 的原理验证。
[0059] 定义
[0060] 术语"单突变体"应理解为相比亲本多肽或抗体具有提高的效应子作用的本发明 变体。
[0061] 术语"双突变体"应理解为变体，其在所述片段中包含至少两个突变，并相比仅包 含两个突变中一个的变体、亲本多肽或抗体或两者具有改进的效应子作用。
[0062] 术语"混合突变体"应理解为变体，其在与相同或不同多肽或抗体的包含所述区段 的不同氨基酸残基处的突变的第二突变体组合使用时，相比一种或多种变体、第二变体和 单独亲本多肽或抗体提供提高的效应子作用。
[0063] 术语"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的多肽"在本发明上下文中是指包含免疫球 蛋白Fc域和结合区的多肽，其能与例如位于细胞，细菌，或病毒粒子上任何分子，如多肽结 合。免疫球蛋白的Fc域定义为通常在用木瓜蛋白酶消化抗体后生成的抗体片段（这对本 领域技术人员已知），其包括免疫球蛋白的两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区。抗体重 链恒定区定义抗体同种型，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgE。Fc域介导抗体 与被称为Fe受体的细胞表面受体和补体系统蛋白的效应子作用。结合区可以是能连接到 细胞、细菌、病毒粒子的多肽序列，如蛋白、蛋白配体、受体、抗原结合区或配体结合区。如果 结合区是例如受体，"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的多肽"可以作为免疫球蛋白Fc域和 所述结合区的融合蛋白来被制备。如果结合区是抗原结合区，"包含免疫球蛋白Fc域和结 合区的多肽"可以是抗体，像人抗体或仅有重链的抗体或ScFv-Fc-融合体。包含免疫球蛋 白Fc域和结合区的多肽通常包括连接区，例如铰链区，和免疫球蛋白重链的两个CH2-CH3 区，因此"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的多肽"可以是"包含至少免疫球蛋白Fc域和结 合区的多肽"。术语"免疫球蛋白Fc域"在本发明上下文中意指取决于抗体亚型的连接区， 例如铰链，以及免疫球蛋白CH2和CH3区存在，例如人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgAU IgGA2 或 IgE。
[0064] 本发明中使用的术语"CH2区"或"CH2域"意指免疫球蛋白的CH2区。因此例如 人IgGl抗体的CH2区对应于根据EU编号系统的氨基酸228-340。然而，CH2区也可以是本 发明所述的任何其他亚型。
[0065] 本发明中使用的术语"CH3区"或"CH3域"意指免疫球蛋白的CH3区。因此例如 人IgGl抗体的CH3区对应于根据EU编号系统的氨基酸341-447。然而，CH3区也可以是本 发明所述的任何其他亚型。
[0066] 术语"免疫球蛋白"是指一类结构上相关的糖蛋白，其由两对多肽链，一对轻 (L)低分子量链和一对重（H)链组成，所有四条之间通过二硫键内在相连。免疫球蛋 白的结构已经被充分表征。见例如Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W·，编第二 版.RavenPresS，N.Y. (1989))。简而言之，每条重链通常由重链可变区（本发明中缩写为 VH)和重链恒定区组成。重链恒定区通常由三个域，CH1，CH2,和CH3组成。重链之间通过 所谓"铰链区"中的二硫键相连。每条轻链通常由轻链可变区（本发明中缩写为VL)和轻 链恒定区组成。轻链恒定区通常由一个域，CL组成。VH和VL区可以被进一步再划分为高 可变性区（或在序列和/或结构限定环形式中高度可变的高可变区），也被称为互补决定区 (CDRs)，其散布有更保守的区域，被称为框架区（FRs)。每条VH和VL通常由三个CDRs和四 个FRs组成，其从氨基末端到羧基末端以以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2, CDR2, FR3, CDR3， FR4(也见Chothia和LeskJ. Mol. Biol. 196, 901917(1987))。除非另有说明或上下文相矛 盾，本发明中恒定区序列的氨基酸根据EU-索引编号（在Kabat, E.A.等，Sequences of proteins of immunological interest.第五版-US Department of Health and Human S ervices, NIHpublicationNo. 91-3242, pp662, 680, 689 (1991)中描述）。
[0067] 本发明上下文中术语"抗体"（Ab)是指免疫球蛋白分子，免疫球蛋白分子片段， 或两者的衍生物，其具有在典型生理条件下特异性结合抗原的能力，有显著时间段的半衰 期，如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少 约8小时，至少约12小时，约24小时，约48小时，约3,4, 5,6, 7或更多天等，后任何其他 相关功能限定时段（如足以诱导、促进、增强和/或调节与抗体结合抗原相关的生理应答 的时间，和/或足以使抗体募集效应活性的时间）。本发明的抗体包含免疫球蛋白Fc域和 结合区。抗体通常含有两个CH2-CH3区和连接区，例如铰链区，例如至少Fc域。因此本发 明的抗体可以包含Fc区和抗原结合区。免疫球蛋白分子的重链和轻链可变区包含与抗原 相互作用的结合域。抗体的恒定或"Fc"域可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合， 包括免疫系统各种细胞（如效应细胞）和补体系统的组分如Clq，补体激活经典途径的第 一组分。抗体也可以是多特异性抗体，如双特异性抗体或类似分子。术语"双特异性抗体" 是指具有对至少两种不同，通常是不重叠表位的特异性的抗体。这样的表位可以在相同或 不同的靶标上。如果表位在不同的靶标位上，这样的靶标可以在相同细胞或不同细胞或细 胞类型上。如上所述，除非另有说明或者明显与上下文相矛盾，在本发明中术语抗体包括 抗体片段，其包含至少部分Fc区并保持特异性结合抗原的能力。这样的片段可以通过任 何已知技术提供，如酶切、肽合成和重组表达技术。已经显示了抗体的抗原结合功能可以 由全长抗体的片段来进行。涵盖在术语"Ab"或"抗体"中的结合片段实例包括，不限于， 单价抗体（在W02007059782中由Genmab描述）；重链抗体，其仅由两条重链组成并在例 如胳马它中天然存在（例如，Hamers_Casterman(1993)Nature363:446) ;ThioMabs(Roche， W02011069104)，链交换工程域（SEED或Seed体），其是不对称的和双特异性的抗体样分 子（Merck， W02007110205) ;Triomab(Fresenius，Lindhofer 等（1995JImmunoll55:219)); FeΔAdp (Regeneron, W02010151792), Azymetric Scaffold(Zymeworks/Merck, W02012/058768)，mAb-FV (Xencor，W02011/028952)，双可变域免疫球蛋白（Abbott, DVD-Ig， 美国专利7,612，181);双域双头抗体出11丨16￥61';5311(^4￥611衍8，恥20100226923)，二 双抗体（ImClone/Eli Lilly)，钮-入-孔（knob-into-holes)抗体形式（Genentech， W09850431) ;DuoBody(Genmab，TO2011/131746);静电驾驭抗体形式（Amgen，EP1870459 和 TO2009089004;Chugai，US201000155133;0ncomed，W02010129304A2) ;双特异性 IgGl 和 IgG2(Rinat neurosciences Corporation, WOlI143545), CrossMAbs(Roche, W02011117329)，LUZ-Y(Genentech)，Biclonic (Merus)，双祀向域抗体（GSK/Domantis), 识别两个祀标的二合一抗体（Genentech，Novlmmune)，交联 Mbs (Karmanos Cancer Center), CovX 体（CovX/Pfizer), IgG 样双特异性（ImClone/EliLilly，Shen，J·，等 JI mmunol Methods, 2007. 318(1-2):ρ· 65-74)，和 DIG 体和 PIG 体（Pharmabcine)， 以及双亲和性再靶向分子（Macrogenics 的 Fc-DART 或 Ig-DART，W0/2008/157379， TO/2〇10/〇8〇538)，Zybodies (Zyngenia)，普通轻链（Crucell/Merus，US7262O28)或普 通重链（Novlmmune的κ λ体）的方法，以及融合蛋白，其包含多肽序列，所述多肽序 列融合于含Fc域的抗体片段，像scFv融合体，像ZymoGenetics/BMS的BsAb, Biogen Idec 的 HERCULES(US007951918)， Emergent BioSolutions/Trubion 的 S⑶RPI0NS， Ts2Ab(Medlmmune/AZDimasi，N·，等 J Mol Biol，2009.393(3):p. 672-92)，Novartis 的 scFv 融合体，Changzhou Adam Biotech Inc 的 scFv 融合体（CN102250246), Roche 的 TvAb(W02012025525，TO2012025530)， f-Star 的 mAb2(W02008/003116)和双 scFv-融合 体。还应当理解，术语抗体，除另有指明外，也包括多克隆抗体、单克隆抗体（如人单克隆抗 体）、抗体混合物（重组多克隆）例如，通过Symphogen和Merus (Oligoclonics)开发的技 术生成的，和抗体样多肽，如嵌合抗体和人源化抗体。生成的抗体可潜在地具有任何同种 型。
[0068] 术语"全长抗体"，当在本发明中使用时是指抗体（如亲本或变体抗体），其包含对 应通常在该同种型野生型抗体中发现的那些域的所有重和轻链恒定和可变域。
[0069] 本发明中所用的术语"人抗体"是包括抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的 可变区和恒定区。本发明的人抗体可以包括不由人种系免疫球蛋白序列编码氨基酸残基 (例如，通过体外随机或点特异突变或者通过体内体细胞突变引入的突变、插入或缺失）， 然而，本发明中所用的术语"人抗体"不意欲包括其中源自另一哺乳动物种类种系，如小鼠 的CDR序列已经被移植到人骨架序列的抗体。
[0070] 本发明中所用术语"单克隆抗体"、"单克隆Ab"、"单克隆抗体组成"，"mAb"或类似 是指单分子组成的抗体分子制剂。单克隆抗体组成显示对特定表位的单结合特异性和亲和 力。因此，术语"单克隆抗体"是指显示单结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋 白序列的可变和恒定区。人mAbs可以由杂交瘤细胞生成，杂交瘤细胞包括从转基因或转染 色体非人动物，如转基因小鼠中获得的B细胞，B细胞包含重排以产生功能性人抗体的人重 链转基因部分和轻链转基因部分并与永生细胞融合。
[0071] 本发明中所用的"同种型"是指按重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgAl、IgGA2、IgE 或 IgM 或者其任何同种异型类型如 IgGlm(za) 和IgGlm(f))。此外，每种重链同种异型可与κ或λ轻链组合。
[0072] 术语"单价抗体"在本发明上下文中意为抗体分子，其仅能够仅以一个抗体结合域 与抗原结合，例如具有单抗原-抗体相互作用，并因此不能抗原交联。
[0073] 本发明中所用的术语"靶标"在本发明上下文中应理解为包含Fc域和结合区的 多肽的结合区结合到的分子，当用于抗体结合的上下文中时包括所提出抗体导向的任何抗 原。术语"抗原"和"靶标"关于抗体时可以互换使用，并对本发明任何方面或实施方案构 成相同的含义或目的。
[0074] 本发明中所用的术语"结合"在抗体结合到预定抗原的上下文中通常是结合，当使 用抗原作为配体和抗体作为分析物，通过例如表面等离子共振（SPR)技术在BIAcore3000 仪器中测定时，结合有对应约KT 6M或更小，例如KT7M或更小，如KT8M或更小，如KT9M或 更小，约KT kiM或更小，或约KT11M或甚至更小的Kd的亲和力，并且以对应于与结合到非 预定抗原或密切相关抗原的非特异性抗原（例如BSA，酪蛋白）时其亲和力相比为至多 1/10 (at least ten-fold lower)，如至多 1/100,例如至多 1/1000,如至多 1/10000,例如至 多1/100000的Kd的亲和力与预定抗原结合。亲和力较低时的量取决于抗体的K D，这样当 抗体的Kd非常低（即抗体高度特异）时，则对抗原亲和力相比对非特异性抗原亲和力较低 的量可以是至少10000倍。本发明中所用的术语"K D"(M)是指特定抗体-抗原相互作用的 解离平衡常数。
[0075] 本发明的"变体"或"抗体变体"或"亲本抗体变体"是相比"亲本抗体"包含一个 或多个突变的抗体分子。类似的，本发明"变体"或"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的多肽 的变体"或"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的亲本多肽的变体"是相比"包含免疫球蛋白 Fc域和结合区的亲本多肽"，包含一个或多个突变的"包含免疫球蛋白Fc域和结合区的多 肽"。不同的术语可以互换使用，并对本发明任何方面或实施方案构成相同的含义或目的。 示例性的亲本抗体形式包括，不限于，野生型抗体，全长抗体或含Fc的抗体片段，双特异性 抗体，人抗体，或其任意组合。示例性的突变包括亲本氨基酸序列中的氨基酸缺失、插入或 氨基酸取代。氨基酸取代可将天然氨基酸替换为另一种天然存在的氨基酸，或者非天然存 在的氨基酸衍生物。氨基酸取代可以是保守或非保守的。在本发明上下文中，保守取代由 下面三个表的一个或多个中反映的氨基酸类型之间的取代所定义：
[0076] 保守取代的氨基酸残基类型
[0077]
【权利要求】
1. 一种提高包含免疫球蛋白Fe域和结合区的亲本多肽的效应子作用的方法，该方法 包括在亲本多肽中选自对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、 3254、〇311、0/^356、了3593382、￥436和1(447的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中 引入突变，条件是S440中的突变是S440Y或S440W。
2. 根据权利要求1的提高亲本抗体的效应子作用的方法，包括在亲本抗体中选自对应 于人 IgGl 重链 Fe 区中的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中引入突变，条件是S440中 的突变是S440Y或S440W。
3. -种降低包含免疫球蛋白Fe域和结合区的亲本多肽的效应子作用的方法，该方法 包括在亲本多肽中选自对应于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的那些氨基酸残基的 一个氨基酸残基中引入突变，条件是S440中的突变不是S440Y或S440W，如其中对应于人 IgGl重链Fe区中的K439的位置的突变是K439D/E，和/或对应于人IgGl重链Fe区中的 S440位置的突变是S440K/H/R。
4. 根据权利要求3的降低亲本抗体的效应子作用的方法，包括在亲本抗体中选自对应 于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的那些氨基酸残基的一个氨基酸残基中引入突变， 条件是S440的突变不是S440Y或S440W，如其中对应于人IgGl重链Fe区中的K439位置的 突变是K439D/E，和/或对应于人IgGl重链Fe区的S440位置的突变是S440K/H/R。
5. 根据权利要求2或4中任一项的方法，其中亲本抗体是单特异性、双特异性或多特异 性抗体。
6. 根据权利要求5的方法，其中亲本抗体为包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗 体，所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3区和第一抗原结合区，所述第二多肽包 含免疫球蛋白的第二CH2-CH3区和第二抗体结合区，其中所述第一和第二抗原结合区结合 相同抗原或不同抗原上的不同表位，而且其中所述第一 CH2-CH3区在选自对应于人IgGl重 链Fe区中的1(409、了366、1^368、1(370、0399、？405和￥407的那些的位置包含另外的氨基酸取 代；其中所述第二CH2-CH3区在选自对应于人IgGl重链Fe区中的F405、T366、L368、K370、 D399、Y407和K409的那些的位置包含另外的氨基酸取代，而且其中第一 CH2-CH3区中的所 述另外的氨基酸取代不同于第二CH2-CH3区中的所述另外的氨基酸取代。
7. 根据权利要求5或6的方法，其中亲本抗体为双特异性抗体并包含第一多肽和第 二多肽，其中所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3区和第一抗原结合区，所述第 二多肽包含免疫球蛋白的第二CH2-CH3区和第二抗原结合区，其中第一和第二抗原结合区 结合相同抗原或不同抗原上的不同表位，所述方法包括在每个第一和第二CH2-CH3区中在 选自对应于人 IgGl 重链 Fe 区的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、 T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基中引入突变，条件是 S440的突变是S440Y或S440W。
8. 根据权利要求1至2和5至7中任一项所述的方法，所述方法包括在除S440和K447 之外的一个或更多个位置上引入突变，以及进一步在如下位置引入突变： (i) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的氨基酸残基的每一个中，条件是 S440的突变不是S440Y或S440W， (ii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447和448的氨基酸残基的每一个中，如人IgGl 重链Fe区中的K447K/R/H和448E/D，优选人IgGl重链Fe区中的K447K和448E，或者 (iii)在对应于人IgGl重链Fe区中的K447、448和449的氨基酸残基的每一个中，例 如人IgGl重链Fe区中的K447D/E和448K/R/H和449Ρ，优选人IgGl重链Fe区中的Κ447Ε、 448K 和 449P。
9. 根据权利要求8的方法，所述方法包括在除S440之外的一个或更多个位置中引入突 变，以及进一步在对应于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的氨基酸残基的每一个中引 入突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W。
10. 根据权利要求9的方法，其中对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中的突变 为K439D/E，和/或对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中的突变为S440K/H/R。
11. 一种提高至少第一和第二亲本多肽的组合的效应子作用的方法，其中至少第一和 第二亲本多肽中的每个都包含免疫球蛋白的Fe域和结合区，其中所述方法包括 (i)向至少第一和/或第二亲本多肽的选自下组的一个或更多个氨基酸残基中引入突 变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区中的S440突 变的情况下，突变是S440Y或S440W，和 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基。
12. 根据权利要求11的提高至少第一和第二亲本抗体的组合的效应子作用的方法，其 中至少第一和第二亲本多肽中的每个都包含免疫球蛋白的Fe域和结合区，其中所述方法 包括 (i)向至少第一和/或第二亲本多肽的选自下组的一个或更多个氨基酸残基中引入突 变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区中的S440突 变的情况下，突变是S440Y或S440W，和 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基。
13. 根据权利要求12的方法，其中至少第一和/或第二亲本抗体中的突变在选自对应 于人 IgGl 重链 Fe 区中的 E345、E430、S440、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中，条件是S440的突变是 S440Y 或 S440W。
14. 根据权利要求12至13的方法，其中所述方法包括在第一和第二亲本抗体两者中都 引入突变。
15. 根据权利要求12的方法，其中所述方法包括 ⑴在第一亲本抗体的选自对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E430、S440、Q386、 P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸残基中的至少一个 氨基酸残基中引入突变，条件是S440的突变是S440Y或S440W， (ii)提供第二亲本抗体，其在选自对应于人IgGl重链Fc区中的E345、E430、S440、 Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸残基中的氨 基酸残基中不包含突变。
16. 根据权利要求12至15中任一项的方法，其中所述方法包括在除S440之外的一个 或更多个位置中引入突变，其中所述方法进一步包括如下步骤： (i) 在第一亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的K439位置的氨基酸残基中引入第 二突变，以及 (ii) 在第二亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的S440位置的氨基酸残基中引入 第二突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W，其中步骤（ii)和步骤（iii)可替换地 可以是： (i) 在第一亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的S440位置的氨基酸残基中引入第 二突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W ;以及 (ii) 在第二亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的K439位置的氨基酸残基中引入 第二突变。
17. 根据权利要求16的方法，其中在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中的突 变是K439D/E，并且在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中的突变是S440K/H/R。
18. 根据权利要求12至17中任一项的方法，其中所述至少第一和第二亲本抗体中的每 个都可以选自下组：单特异性、双特异性和多特异性抗体。
19. 根据权利要求18的方法，其中所述至少第一和第二亲本抗体是结合相同抗原或不 同抗原上的不同表位的双特异性或多特异性抗体。
20. 根据权利要求18或19的方法，其中所述至少第一和第二亲本抗体每个都是包含第 一多肽和第二多肽的双特异性抗体，所述第一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3区和第 一抗原结合区，第二多肽包含免疫球蛋白的第二CH2-CH3区和第二抗原结合区，其中第一 和第二抗原结合区结合相同抗原或不同抗原上的不同表位，而且其中所述第一 CH2-CH3区 在选自对应于人IgGl重链Fe区中的1(4093366、1^368、1(370、03994405和￥407的那些位 置的位置处包含另外的氨基酸取代，其中所述第二CH2-CH3区在选自对应于人IgGl重链Fe 区中的F405、T366、L368、K370、D399、Y407和K409的那些位置的位置处包含另外的氨基酸 取代，而且其中第一 CH2-CH3区中的所述另外的氨基酸取代不同于第二CH2-CH3区中的所 述另外的氨基酸取代。
21. 根据权利要求1至2、5至7、11至15以及18至20中任一项的方法，其中所述突变 是在选自对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E430、S440至Y或W、及Q386的那些氨基酸 残基的至少一个氨基酸残基中，优选其中所述突变是至少一个如下的氨基酸取代：E345至 R、Q、N 或 K，E430 至 T、S 或 G，S440 至 Y 或 W，或者 Q386 至 K。
22. 根据权利要求1至2、5至7、11至15以及18至20中任一项的方法，包括在亲本 抗体的选自对应于人 IgGl 重链 Fe 区中的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、 D/E356、T359、E382、Y436和K447的那些氨基酸残基的至少两个氨基酸残基中引入突变，条 件是S440的突变是S440Y或S440W。
23. 根据权利要求22的方法，包括在亲本抗体的选自对应于人IgGl重链Fe区中的 E345、E430、Q386和S440的那些氨基酸残基的至少两个氨基酸残基中引入突变，条件是 S440的突变是S440Y或S440W，例如其中在至少两个氨基酸中的突变选自如下：E345至R、 Q、N 或 K，E430 至 T、S 或 G，S440 至 Y 或 W，或者 Q386 至 K。
24. 根据权利要求1至23中任一项的方法，其中所述效应子作用为Fc-介导的效应子 作用，其选自选自如下的Fc-介导的效应子作用：Clq结合、补体激活、补体依赖性细胞毒性 (⑶C)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)、FcRn-结合、Fc-受体结合包括Fe-γ受体 结合、蛋白A-结合、蛋白G-结合、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP)、补体依赖性细胞的细胞毒 性（CDCC)、补体增强型细胞毒性、调理作用、包含Fc的多肽内化作用、靶标下调、ADC摄取、 细胞凋亡诱导、细胞死亡、细胞周期停滞及其任何组合。
25. 根据权利要求1至2以及5至24中任一项的方法，其中当抗体与其抗原结合时，效 应子作用提高。
26. 根据权利要求25的方法，其中抗原位于抗原表达细胞、细胞膜或病毒粒子上。
27. -种诱导针对细胞、细胞膜或病毒粒子的效应应答的方法，所述细胞、细胞膜或病 毒粒子表达包含免疫球蛋白Fc域和结合区的亲本多肽所结合的靶标，所述方法包括 (i) 提供已根据权利要求1至24中任一项进行了突变的亲本多肽或至少第一亲本多肽 和第二亲本多肽的组合；和 (ii) 将步骤（i)中的突变亲本多肽或者步骤（i)中的至少第一亲本多肽和第二亲本多 肽的突变组合的制剂在存在人补体或效应细胞的情况下与表达抗原的细胞、细胞膜或病毒 粒子相接触。
28. 根据权利要求27的诱导针对表达亲本抗体所结合的抗原的细胞、细胞膜或病毒粒 子的效应应答的方法，所述方法包括 (i) 提供已根据权利要求1至24中任一项进行了突变的亲本抗体或至少第一亲本抗体 和第二亲本抗体的组合；和 (ii) 将步骤（i)中突变的亲本抗体或者步骤（i)中的至少第一亲本抗体和第二亲本抗 体突变组合的制剂在存在人补体或效应子细胞的情况下，与表达抗原的细胞、细胞膜或病 毒粒子相接触。
29. 根据权利要求27或28的方法，其中效应应答是补体依赖性细胞毒性（CDC)，Fc介 导的效应应答，其选自选自如下的Fc介导的效应应答：Clq-结合、补体激活、补体依赖性 细胞毒性（CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)、FcRn-结合、Fc-受体结合包括 Fe- γ受体结合、蛋白A-结合、蛋白G-结合、抗体依赖性细胞吞噬（ADCP)、补体依赖性细胞 的细胞毒性（CDCC)、补体增强型细胞毒性、调理作用、包含Fc的多肽内化作用、靶标下调、 ADC摄取、细胞凋亡诱导、细胞死亡、细胞周期停滞及其任何组合。
30. -种提高至少第一和第二亲本多肽组合的特异性的方法，其中所述第一和第二亲 本多肽包含免疫球蛋白的Fc域和结合区，所述方法包括 A) (i) 在第一亲本多肽的对应于人IgGl重链Fc区中的K439位置的氨基酸残基中引入突 变，以及 (ii) 在第二亲本多肽的对应于人IgGl重链Fc区中的S440位置的氨基酸残基中引入 突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W， B) (i) 在第一亲本多肽的对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E位置的氨基酸残基中引 入突变，以及 (ii) 在第二亲本多肽的对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H和448P位置的氨基 酸残基中引入突变；或者 C) (i) 在第一亲本多肽的对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E位置的氨基酸残基中引 入突变，以及 (ii) 在第二亲本多肽的对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H、448K/R/H和449P位 置的氨基酸残基中引入突变。
31. 根据权利要求30的提高至少第一和第二亲本抗体的组合的特异性的方法，其包括 (i) 在第一亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的K439位置的氨基酸残基中引入突 变，以及 (ii) 在第二亲本抗体的对应于人IgGl重链Fe区中的S440位置的氨基酸残基中引入 突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W。
32. 根据权利要求31的方法，其中在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中的突 变是K439D/E，并且在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中的突变是S440K/H/R。
33. 根据权利要求1至32中任一项的方法，其中亲本抗体或第一亲本抗体和第二亲本 抗体的组合是人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE,任选的人全长抗体，例如 人全长IgGl抗体。
34. -种包含免疫球蛋白Fe域和结合区的亲本多肽的变体，其中该变体在对应于人 IgGl 重链 Fe 区中的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、 Y436和K447的那些氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基中包含突变，条件是S440的突变 是 S440Y 或 S440W。
35. 根据权利要求34的包含抗原结合区和Fe域的亲本抗体的变体，其中该变体在对应 于人IgGl重链Fc区中的E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、 E382、Y436和K447的那些氨基酸残基中的至少一个氨基酸残基中包含突变，条件是S440的 突变是S440Y或S440W。
36. 根据权利要求35的变体，其中在至少一个氨基酸残基中的突变选自对应于人IgGl 重链 Fe 区中的 E345X、E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、 E382V和Y436I的那些突变，其中X是任意氨基酸，如天然存在的氨基酸。
37. 根据权利要求36的变体，其中在至少一个氨基酸残基中的突变选自对应于人IgGl 重链Fe区中的E345X、E430X、S440W/Y、Q386K的那些突变，其中X是任意氨基酸，如天然存 在的氨基酸。
38. 根据权利要求37的变体，其中在至少一个氨基酸残基中的突变选自对应于人IgGl 重链Fe区中的 E345R/Q/N/K/A/C/D/F/G/H/1/L/M/P/S/T/V/W/Y、 E430T/S/G/A/C/D/F/H/1/L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、 S440W/Y和Q386K的那些突变。
39. 根据权利要求38的变体，其中在至少一个氨基酸残基中的突变选自对应于人IgGl 重链 Fc 区中的 E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W 和 Q386K 的那些突变。
40. -种包含免疫球蛋白Fc域和结合区的亲本多肽的变体，其中该变体在选自下组的 至少两个氨基酸残基中包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fc区中的S440突 变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fc区中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸残基， 其中该至少两个氨基酸突变是不同的。
41. 根据权利要求40的包含抗原结合区和Fc域的亲本抗体的变体，其中该变体在选自 下组的至少两个氨基酸残基中包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fc区中的S440突 变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fc区中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸残基， 其中该至少两个氨基酸突变是不同的。
42. 根据权利要求41的变体，其中该变体在选自对应于人IgGl重链Fc区中的E345、 E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸 残基中的至少两个氨基酸残基中包含突变，条件是S440的突变是S440Y或S440W。
43. 根据权利要求42的变体，其中该变体在选自对应于人IgGl重链Fc区中的E345X、 E430X、S440W/Y、Q386K、P247G、I253V、S254L、Q311L/W、D/E356R、E382V 和 Y436I 的那些氨 基酸残基中的至少两个氨基酸残基中包含突变，其中X是任意氨基酸，如天然存在的氨基 酸。
44. 根据权利要求43的变体，其中该变体在选自对应于人IgGl重链Fc区中的E345X、 E430X、S440W/Y和Q386K的组的至少两个氨基酸残基中包含突变，其中X是任意氨基酸，如 天然存在的氨基酸。
45. 根据权利要求44的变体，其中变体在选自对应于人IgGl重链Fc区中的E345R/Q/ N/K/A/C/D/F/G/H/1/L/M/P/S/T/V/W/Y、E430T/S/G/A/C/D/F/H/1 /L/K/M/N/P/Q/R/V/W/Y、 S440W/Y和Q386K的那些氨基酸残基的至少两个氨基酸残基中包含突变。
46. 根据权利要求45的变体，其中在至少两个氨基酸残基中的突变选自对应于人IgGl 重链 Fc 区中的 E345R/Q/N/K、E430T/S/G、S440Y/W 和 Q386K 的那些突变。
47. 根据权利要求34至46中任一项的变体，其中突变位于除S440和K447之外的位置 上，并且其中所述变体进一步在如下氨基酸残基中包含突变： (i)在对应于人IgGl重链Fe区中的K439或S440的至少一个氨基酸残基中，条件是 S440的突变不是S440W或S440Y ; (ii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448P的至少一 个氨基酸残基中；或 (iii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一个氨基酸残基中。
48. 根据权利要求47的变体，其中突变位于除S440之外的位置上，并且其中所述变体 进一步在对应于人IgGl重链Fe区中的K439或S440的至少一个氨基酸残基中包含突变， 条件是S440的突变不是S440W或S440Y。
49. 一种包含免疫球蛋白Fe域和结合区的亲本多肽的变体，其中该变体在选自下组的 至少一个氨基酸残基中包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3i3-链内的氨基酸残基，条件是其不包含对应于人IgGl重链Fe区中的 S440的突变，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基，且 其中变体在如下氨基酸残基中包含另外的突变： (i) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K439或S440的至少一个氨基酸残基中，条件是 S440的突变不是S440W或S440Y ; (ii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448P的至少一 个氨基酸残基中；或 (iii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一个氨基酸残基中。
50. 根据权利要求49的包含抗原结合区和免疫球蛋白的Fe域的亲本抗体的变体，其中 该变体在选自下组的至少一个氨基酸残基中包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是其不包含对应于人IgGl重链的Fe区中的 S440的突变，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基，且 其中所述变体在如下氨基酸残基上包含另外的突变： (i) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K439或S440的至少一个氨基酸残基中，条件是 S440的突变不是S440W或S440Y ; (ii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448P的至少一 个氨基酸残基中；或 (iii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一个氨基酸残基中。
51. 根据权利要求49或50的变体，其中该变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K439 和S440的两个位置上都包含氨基酸突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W。
52. 根据权利要求47至51中任一项的变体，其中在对应于人IgGl重链Fe区中的K439 的位置中的突变是K439D/E，和/或在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中的突变 是 S440K/H/R。
53. -种包含免疫球蛋白Fe域和结合区的亲本多肽的变体，其中变体在如下氨基酸残 基中包含突变： (i) 在选自对应于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的那些氨基酸残基的至少一个 氨基酸残基中，条件是S440的突变不是S440Y或S440W，如其中在对应于人IgGl重链Fe区 中的K439的位置中的突变是K439D/E，和/或在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置 中的突变是S440K/H/R; (ii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448P的至少一 个氨基酸残基中；或 (iii) 在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E或对应于K447K/R/H和448K/R/H和 449P的至少一个氨基酸残基中。
54. 根据权利要求53的包含抗原结合区和免疫球蛋白Fe域的变体，其中该变体在选 自对应于人IgGl重链Fe区中的K439和S440的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中 包含突变，条件是S440的突变不是S440Y或S440W，如其中在对应于人IgGl重链Fe区中的 K439的位置中的突变是K439D/E，和/或在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中的 突变是 S440K/H/R。
55. 根据权利要求34至54中任一项的变体，其中所述变体选自单特异性抗体、双特异 性抗体或多特异性抗体。
56. 根据权利要求55的变体，其为包含第一多肽和第二多肽的双特异性抗体，所述第 一多肽包含免疫球蛋白的第一 CH2-CH3区和第一抗原结合区，第二多肽包含免疫球蛋白的 第二CH2-CH3区和第二抗原结合区，其中第一和第二抗原结合区结合相同抗原或不同抗原 上的不同表位，并且其中 第一和第二CH2-CH3区每个在选自对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E430、S440、 Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那些氨基酸残基的至少 一个氨基酸残基中包括第一突变，条件是S440的突变是S440Y或S440W。
57. 根据权利要求56的作为双特异性抗体的变体，其中第一多肽在选自对应于人IgGl 重链Fe区中的K409、T366、L368、K370、D399、F405和Y407的那些氨基酸残基的氨基酸残 基中包含另外的突变；以及 第二多肽在选自对应于人IgGl重链Fe区的？405、了366、1^368、1(370、0399、￥407和1(409 的那些氨基酸残基的氨基酸残基中包含另外的突变，并且其中第一多肽中的所述另外的突 变与第二多肽中的所述另外的突变不同。
58. 根据权利要求34至57中任一项的变体，其中所述变体与药物、毒素或放射性标记 缀合，如其中所述变体通过连接子与毒素相缀合。
59. 根据权利要求34至57中任一项的变体，其中所述变体是融合蛋白的一部分。
60. 根据权利要求34至59中任一项的变体，其中该变体是人IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、 IgAl、IgA2、IgD或IgE抗体，任选人全长抗体，如人全长IgGl抗体。
61. -种包含亲本多肽第一变体和亲本多肽第二变体的组合物，其中第一变体包含免 疫球蛋白的第一 Fe域和结合区，其中第二变体包含免疫球蛋白的第二Fe域和结合区，并且 其中 (i) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中包含突变，其中所述 第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中包含突变，条件是S440的突变不 是 S440Y 或 S440W， (ii) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E的位置中包含突变；其中 所述第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H和448P的位置中包含突变，或 (iii) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E的位置中包含突变；其 中所述第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H、448K/R/H和449P的位置中包 含突变。
62. 根据权利要求61的包含亲本抗体的第一变体和亲本抗体的第二变体的组合物，其 中第一变体包含免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原结合区，其中第二变体包含免疫球蛋白的 第二Fe域和抗原结合区，并且其中 (i) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中包含突变，其中所述 第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的位置中包含突变，条件是S440的突变不 是 S440Y 或 S440W， (ii) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E的位置中包含突变；其中 所述第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H和448P的位置中包含突变，或 (iii) 所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447D/E的位置中包含突变；其 中所述第二变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K447K/R/H、448K/R/H和449P的位置中包 含突变。
63. 根据权利要求62的包含亲本抗体的第一变体和亲本抗体的第二变体的组合物，其 中第一变体包含免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原结合区，其中第二变体包含免疫球蛋白的 第二Fe域和抗原结合区，并且其中所述第一变体在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的 位置中包含突变，其中第二变体在对应于S440的位置中包含突变，条件是S440的突变不是 S440Y 或 S440W。
64. 根据权利要求63的组合物，其中第一变体包括免疫球蛋白的第一 Fe域和抗原结合 区，其中所述第一变体包含（i)在除K439中的突变之外的选自下组的至少一个氨基酸残基 中的第一突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区的S440的突 变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基，以及 (ii)在对应于人IgGl重链Fe区中的K439的位置中的第二突变；并且 其中第二变体包含免疫球蛋白的第二Fe域和抗原结合区，其中所述第二变体包括（i) 在除S440的突变之外选自下组的至少一个氨基酸残基中的第一突变： (a)CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fc区中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸残基，以及 (ii)在对应于IgGl重链Fc区中的S440的位置中的第二突变，条件是S440的突变不 是 S440Y 或 S440W。
65. 根据权利要求63的组合物，其中第一变体包含⑴在除K439中的突变之外的选自 下组的至少一个氨基酸残基中的第一突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fc区中的S440的 突变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fc区中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸残基，以及 (ii)在对应于人IgGl重链Fc区中的Κ439的位置中的第二突变，并且 其中第二变体在对应于人IgGl重链Fc区中的S440的位置中包含突变，其不是不是 S440Y 或 S440W。
66. 根据权利要求63的组合物，其中第一变体在对应于人IgGl重链Fc区中的K439的 位置中包含突变；并且 其中第二变体包含免疫球蛋白第二Fc域和抗原结合区，其中所述第二变体包含（i)在 除S440的突变之外的选自下组的至少一个氨基酸残基中的第一突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fc区中的Ε345、Ε382或Q386的氨基酸残基，以及 (ii)在对应于IgGl重链Fc区中的S440的位置中的第二突变，条件是S440的突变不 是 S440Y 或 S440W。
67. 根据权利要求61至66中任一项的组合物，其中在对应于人IgGl重链Fc区中的 K439的位置中的突变是K439D/E，和/或在对应于人IgGl重链Fc区中的S440的位置中的 突变是 S440K/H/R。
68. -种包含免疫球蛋白Fc域和结合区的亲本多肽的第一变体和包含免疫球蛋白Fc 域和结合区的亲本多肽的第二变体的组合物，其中第一变体包含免疫球蛋白第一 Fc域和 第一抗原结合区，其中第一变体在选自下组的至少一个氨基酸残基中包含第一突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fc区中的S440的 突变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e)对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基，且其中 第二变体在选自下组的氨基酸残基中不包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区的S440的突 变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基。
69. 根据权利要求68的包括抗体的第一变体和亲本抗体的第二变体的组合物，其中第 一变体包含免疫球蛋白的第一 Fe域和第一抗原结合区，其中第一变体在选自下组的至少 一个氨基酸残基中包含第一突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的 突变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基，以及 其中第二变体包含免疫球蛋白第二Fe域和第二抗原结合区，其中所述第二变体在选 自下组的氨基酸残基中不包含突变： (a) CH2-CH3区内提供变构突变的氨基酸残基， (b) CH2-CH3区的疏水钮内的氨基酸残基， (c) N末端CH3螺旋内的氨基酸残基， (d) C末端CH3 β -链内的氨基酸残基，条件是在对应于人IgGl重链Fe区中的S440的 突变的情况下，所述突变是S440Y或S440W，以及 (e) 对应于人IgGl重链Fe区中的E345、E382或Q386的氨基酸残基。
70. 根据权利要求61至67中任一项的组合物，其中第一和第二变体在选自对应于人 IgGl 重链 Fe 区中的 E345、E430、Q386、P247、1253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和K447的那些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中包含突变。
71. 根据权利要求70的组合物，其中在第一和第二变体中的突变是不同的。
72. 根据权利要求68或69的组合物，其中第一变体在选自对应于人IgGl重链Fe区中 的 E345、E430、S440、Q386、P247、I253、S254、Q311、D/E356、T359、E382、Y436 和 K447 的那 些氨基酸残基的至少一个氨基酸残基中包含突变，条件是S440的突变是S440Y或S440W。
73. 根据权利要求61至72中任一项的组合物，其中第一变体和第二变体各为人IgGU IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD或IgE抗体，任选各为人全长抗体，如各为人全长IgGl抗 体。
74. 根据权利要求61至73中任一项的组合物，其中第一变体和第二变体选自单特异性 抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。
75. 根据权利要求61至74中任一项的组合物，其中第一和第二变体结合相同抗原或不 同抗原上的不同表位。
76. 根据权利要求61至75中任一项的组合物，其中第一变体和第二变体中的一个或两 者都与药物、毒素或放射性标记相缀合，如其中第一变体和第二变体中的一个或两者通过 连接子与毒素相缀合。
77. 根据权利要求61至75中任一项的组合物，其中第一变体和第二变体中的一个或两 者是融合蛋白的一部分。
78. -种组合物，包括根据权利要求34至60中任一项的变体或者根据权利要求61至 77中任一项的组合物以及药学上可接受的载体。
79. -种在治疗中同时、单独或顺序使用的套组，包括如权利要求34至60中任一项所 定义的第一变体和第二变体。
80. 根据权利要求34至79中任一项的变体、组合物或套组，其用于治疗疾病，如癌症。
81. -种治疗人的方法，其包括施用根据权利要求34至79中任一项的变体、组合物或 套组。
82. -种在人中治疗癌症的方法，其包括施用根据权利要求34至79中任一项的变体、 组合物或套组。
【文档编号】A61P35/00GK104220093SQ201280043485
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2012年7月6日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】P·帕伦, F·比尔斯肯斯, R·N·德琼, A·F·拉布里恩, J·舒尔曼 申请人:根马布私人有限公司