光敏抗体-荧光团缀合物的制作方法

文档序号:1249301阅读:317来源:国知局
光敏抗体-荧光团缀合物的制作方法
【专利摘要】本公开涉及杀死细胞的组合物和方法。在具体实例中,所述方法包括使具有细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的抗体-IR700分子接触,其中所述抗体特异性结合所述细胞表面蛋白,例如肿瘤细胞表面上的肿瘤特异性抗原。随后照射所述细胞,例如在660-740nm的波长下剂量为至少1Jcm-2。在照射所述细胞之后例如约0-8小时,还使所述细胞与一种或多种治疗剂(例如抗癌剂)接触,从而杀死所述细胞。还提供了使用荧光寿命成像对细胞杀死进行实时成像的方法。还提供了可与本公开的方法一起使用的可穿戴装置,其包括衣服、珠宝或覆盖物;和被纳入到所述物品中的NIR?LED。
【专利说明】光敏抗体-荧光团缀合物
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是2011年7月11日提交的美国申请N0.13/180,111的部分继续申请,其要求2010年7月9日提交的美国临时申请N0.61/363,079的优先权,两者均以引用的方式纳入本文。
【技术领域】
[0003]本申请涉及抗体-1R700缀合物以及用红外(NIR)光照射后使用抗体-1R700缀合物杀死与所述抗体特异性结合的细胞的方法。还提供了也可与本公开的缀合物和方法一起使用的纳入NIR发光二极管(LED)的装置。
【背景技术】
[0004]2007年,约13%的所有人类死亡是由癌症引起的。虽然有一些针对癌症的疗法,但是仍然需要有效杀死肿瘤细胞同时不损伤非癌细胞的疗法。
[0005]为了使常规癌症疗法一包括外科手术、辐射和化学疗法一的副作用最小,已经开发了分子靶向的癌症疗法。在现有的靶向疗法中,单克隆抗体(MAb)疗法历史最悠久,到目前为止,美国食品和药物管理局(FDA)已经批准了超过 25 种治疗性的 MAb (ffaldmann, Nat Med9:269-277,2003) ;Reichert et al., NatBiotechnol23:1073-1078, 2005)。有效的MAb疗法传统上依赖于三种机制:抗体依赖的细胞的细胞毒性(ADCC)、补体依赖的细胞毒性(CDC)和受体封闭,并且需要多个高剂量的所述MAb。还已经将MAb作为载体以较低的剂量使用以递送治疗物例如放射性核素(Goldenberg et al., J Clin 0ncol24,` 823-834,2006)或化学毒素或生物毒素(Pastan etal., Nat Rev Cancer6:559-565,2006)。然而,剂量限制性毒性最终与抗体缀合物的生物分布和分解代谢有关。
[0006]结合光增敏剂与非电离光的物理能来杀死细胞的常规光动力学疗法(PDT),已经不常用作癌症疗法,因为目前的非靶向光敏剂也会被正常组织吸收,从而引起严重的副作用,虽然激发光本身在近红外线(NIR)的范围内是无害的(图9)。

【发明内容】

[0007]本文提供了抗体-1R700分子和用其杀死靶细胞例如肿瘤细胞的方法。在具体的实例中,所述方法的特点在于,不会以显著的数量杀死非靶细胞例如正常细胞(例如,杀死少于1%的正常细胞),而以显著的数量杀死靶细胞。在具体实例中,所述方法包括使具有细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的抗体-1R700分子接触,其中所述抗体(或其他特异性的结合剂)特异性结合所述细胞表面蛋白。抗体-1R700分子的具体非限制性实例包括帕尼单抗(Panitumumab)_IR700、曲妥单抗(Trastuzumab)_IR700 和 HuJ591_IR700。在 660_740nm例如660-710nm (例如680nm)的波光下以至少IJ cm—2 (例如至少50J cm—2)的剂量照射所述细胞。所述方法还包括在照射所述细胞后例如约8小时内,使所述细胞与一种或多种治疗剂(例如抗癌剂)接触,从而杀死所述细胞。这种方法还可包括在照射所述细胞后例如约0-48小时,用荧光寿命成像(FLT)检测所述细胞,从而容许实时检测细胞杀死。
[0008]还提供了实时检测细胞杀死的方法。这种方法可包括使含细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的一种或多种如上所述的抗体-1R700分子接触,在660-740nm的波长下以至少30J cm—2的剂量(例如足以使IR700FLT缩短至少25%的剂量,例如30-50J cm—2)照射所述细胞,并在照射所述细胞后约0-48小时(例如至少6小时),用荧光寿命成像检测所述细胞,从而实时检测所述细胞杀死。
[0009]可以用本公开的抗体-1R700分子和方法杀死任何靶细胞(并且在一些实例中进行实时检测),例如通过使用一种或多种与靶细胞表面上一种或多种蛋白(例如受体)结合的抗体,其中所述靶细胞表面上的一种或多种蛋白不会大量地存在于非靶细胞(例如正常的健康细胞)上,因此所述抗体不会与所述非靶细胞大量结合。在一个实例中,所述细胞表面蛋白是肿瘤特异性蛋白,例如HER1、HER2或PSMA。
[0010]在一些实例中,待杀死的所述细胞存在于受试者中。在这类实例中,所述方法可包括给予所述受试者治疗有效量的所述抗体-1R700分子并照射所述受试者,例如照射所述受试者的肿瘤。在一些实例中,所述方法还可包括选择具有表达可特异性结合所述抗体-1R700分子的细胞表面蛋白的肿瘤的受试者。
[0011]还提供了装置,例如可被患者穿戴的那些。这类装置可包括衣服、珠宝或覆盖物和被纳入到所述衣服、珠宝或覆盖物中的近红外(NIR)发光二极管(LED)。这类装置还可包括动力源和/或冷却源。这使得所述患者长时间穿戴所述装置(或被所述装置覆盖),从而容许治疗存在于血液或循环系统中的肿瘤细胞。还提供了使用所述装置的方法。
[0012]从以下参照附图进行的对若干实施方案的详细描述中,本公开的上述和其他特征会变得更加清楚。
【专利附图】

【附图说明】
[0013]图1a的数字图像示出了用曲妥单抗-1R700缀合物(Tra_IR700)标记细胞,在4°C持续I小时或在37°C持续6小时。还示出了光图像。比例尺,30 μ m。
[0014]图1b的数字图像示出了孵育后6小时Tra-1R700的溶酶体定位。比例尺,50 μ m。
[0015]图1c的数字图像示出了用Tra_IR700在37°C孵育6小时然后进行光免疫疗法(PIT),在这之前和之后的数字图像。比例尺,50 μ m。
[0016]图1d的柱状图示出了响应Tra-1R700介导的PIT的照射剂量依赖性和靶特异性的细胞死亡。数据是均值 土平均数标准差(η=至少4,* * *相对于无处理对照Ρ〈0.001,Student’ s t 检验)。
[0017]图1e的柱状图示出了响应Tra-1R700介导的PIT的长期生长抑制。数据是均值土平均数标准差(n=3,* *相对于无处理对照P〈0.01,Student’ s t检验)。
[0018]图1f的数字图像示出了响应TraIR700介导的PIT的生长抑制的显微镜观察结果。比例尺,100 μ m。
[0019]图1g的柱状图示出了光毒性细胞死亡不需要Tra-1R700的内化。数据是均值土平均数标准差(n=3)。
[0020]图1h的柱状图示出了 Tra-1R700的靶特异性膜结合仅诱导光毒性细胞死亡。数据是均值土平均数标准差(n=3)。
[0021]图1i示出了用Tra-1R700介导的PIT时阴性表达HER2的A431细胞未显示出光毒性效应(n=3)。
[0022]图1j的柱状图示出了叠氮化钠(NaN3)浓度依赖性抑制Tra-1R700介导的PIT诱导的光毒性细胞死亡。数据是均值土平均数标准差(n=3,相对于无NaN3的2.0J cm_2PIT处理的对照,* * * P<0.001, * * Ρ〈0.01, Student’s t 检验)。DIC:微分干涉相差。PanIR:Pan_lR700o
[0023]图2a的曲线图示出了在用Tra-lR700(Tra_IR)处理并暴露于光的Balb/3T3(HER2阴性)细胞中没有观察到长期生长抑制。数据是均值土平均数标准差(n=3)。
[0024]图2b的数字图像示出了游离的IR700染料不会纳入到3T3/HER2细胞中。在不洗涤所述细胞的情况下拍摄荧光图像。细胞比含游离IR700染料的培养基更暗。比例尺,50 μ m0
[0025]图2c的曲线图示出了过量的未缀合的曲妥单抗(Tra)剂量依赖性地阻断TraIR700介导的光毒性。数据是均值土平均数标准差(n=3)。
[0026]图2d的曲线图示出了未缀合的曲妥单抗以剂量依赖的方式阻断Tra-1R700结合3T3/HER2细胞(n=3)。DIC:微分干涉相差。
[0027]图3a的数字图像示出了诱导靶特异性光免疫疗法(PIT)导致HER2表达细胞特异性的坏死性细胞死亡。比例尺,50 μ m。
[0028]图3b的数字图像示出了用LIVE/DEAD绿染色进行的荧光显微术证实了 HER2特异性细胞死亡。比例尺,100 μ m。
[0029]图3c的图表示出了用于检测由Tra-1R700(TraIR)介导的PIT诱导的HER2特异性细胞死亡的流式细胞检测分析。左上象限:TraIR700阳性、活细胞;右上象限:Tra_lR700阳性、死细胞;左下象限:Tra-lR700阴性、活细胞;右下象限:Tra_lR700阴性、死细胞(n=3)。DIC:微分干涉相差。
[0030]图4a的数字图像示出了 Tra-1R700的生物分布。早在注射Tra_IR700 (300 μ g)一天后,用IR700荧光使3T3/HER2肿瘤(背部两侧)可见。在第I天用近红外(NIR)光照射所述肿瘤的右侧,同时,用黑带覆盖肿瘤的左侧。在第7天确认肿瘤缩小。虚线:被照射的肿瘤;实线:未被照射的肿瘤。除了由于未结合的染料的排泄而在第一天膀胱累积IR700外,1R700没有其他特异性的定位。
[0031]图4b的曲线图示出了体内给予Tra_IR700或仅给予载体然后进行PIT(50J cm_2)之后的平均肿瘤体积。数据是均值土平均数标准差(每组至少n=12只小鼠,相对于无处理对照,* * * P〈0.001, 〃P〈0.01,具有事后检验的Kruskal一Wallis检验)。Tra:曲妥单抗。
[0032]图5a的数字图像示出了进行Pan-1R700介导的PIT之前和之后的显微镜观察结果。比例尺,50um。
[0033]图5b示出了响应Pan-1R700 (PanIR)介导的PIT的照射剂量依赖性和靶特异性的细胞死亡。数据是均值土平均数标准差(η=至少4,相对于无处理对照,~k ~k ~k P〈0.001,Student’ s t 检验)。
[0034]图5d的数字图像示出了 Pan-1R700介导的PIT诱导了表达EGFR的细胞特异性的坏死性细胞死亡。比例尺,50 μ m。DIC:微分干涉相差。[0035]图6a的数字图像示出了在之前给予了 A431细胞的小鼠中帕尼单抗-1R700缀合物(Pan-1R700)的特异性定位。早在Pan_lR700 (50 μ g)注射后I天,HERl阳性A431肿瘤(左背部)选择性地可见。HERl阴性3T3/HER2肿瘤(右背部)没有显示出可检测到的荧光(n=5只小鼠)。
[0036]图6b的曲线图示出了在注射两种不同剂量(50μ g和300μ g)的Pan_IR700后,随着时间的推移A431肿瘤中的IR700信号强度。数据是均值土平均数标准差(η=每组4只小鼠)。
[0037]图6c的曲线图示出了在注射两种不同剂量的(50 μ g和300 μ g)的Pan_IR700后,随着时间的推移A431肿瘤中IR700荧光强度的肿瘤/背景比率。数据是均值土平均数标准差(η=每组4只小鼠)。
[0038]图6d的数字图像示出了 Pan-1R700的生物分布。早在Pan_lR700 (300 μ g)注射后I天,用IR700荧光使A431肿瘤(两侧背部)选择性地可见。在第I天用近红外(NIR)光照射所述肿瘤的右侧,同时用黑带覆盖所述肿瘤的左侧。在第7天证实了肿瘤缩小。虚线:经照射的肿瘤,实线:未经照射的肿瘤。
[0039]图6e的曲线图示出了体内给予Pan_IR700或仅给予载体然后进行PIT(30J cm_2)之后的平均肿瘤体积。Pan-1R700注射后第I天(在肿瘤接种后第5天)进行PIT。数据是均值土平均数标准差(每组至少n=12只小鼠,相对其他对照组,* * * P〈0.001,具有事后检验的 Kruskal—Wallis 检验)。
[0040]图6f的曲线图示出了体内给予Pan_IR700或仅给予载体然后进行PIT(30J cm—2)之后的存活率(每组至少n=12只小鼠,相对其他对照组,-k -k -k P<0.001,具有Bonferroni多重校正的时序检验)。
[0041]图6g的数字图像示出了用PIT处理(右侧)和未处理(左侧)肿瘤后4天,苏木精和伊红染色的组织学图像(X40和X200)。n=5只小鼠;比例尺,lOOum。Pan:帕尼单抗。
[0042]图6h示出了高剂量给予Pan-1R700在体内导致Pan-1R700介导的PIT对A431肿瘤的抗肿瘤效能更高。观察到,由Pan-1R700介导的PIT引起的肿瘤生长抑制是Pan_lR700剂量依赖性的。数据是均值土平均数标准差(每组至少n=12只小鼠)。
[0043]图1的数字图像示出了 J591-1R700的生物分布。在J591-1R700 (ΙΟΟμ g)注射后,用IR700荧光使PC3-PIP肿瘤选择地可见。在第4、12和13天用近红外(NIR)光照射所述肿瘤的右侧,同时用黑带覆盖所述肿瘤的左侧。在第5天证实了肿瘤缩小。
[0044]图8的数字图像示出了在Tra-1R700 (用于HER2+细胞),Pan_lR700 (用于HERl+细胞)和huJ591-lR700 (用于PSMA+细胞)的存在下,各种细胞PIT之前和之后的显微镜观察结果。比例尺,50 μ m。DIC:微分干涉相差。
[0045]图9a的示意图示出的图解用于解释在用其他采用电磁波照射的物理癌症疗法的情况下使用PIT的选择性癌症疗法。虽然其他物理癌症疗法在正常组织中诱导不同类型的损伤,但是PIT专门损伤癌细胞而不损伤正常细胞或组织。
[0046]图9b的示意图示出了 用于解释PIT的光物理学、化学和生物学基础的图解。采用人源化抗体作为递送载体,因为人源化抗体在临床可用的靶向试剂中结合特异性最高、体内靶向递送能力最强、免疫原性低。采用了亲水性的酞菁作为可激活的细胞毒性“纳米-炸药”试剂,因为对700nm的近红外光的吸收强且仅在与细胞膜结合时诱导强的细胞毒性。采用700nm的近红外光作为引发剂用于激活细胞毒性,因为在无害的非电离光子中其能量高并且体内组织透过力强。
[0047]图10A-D。浓度为 2.5、5、20 和 40jag/mL 的 1R700 缀合的帕尼单抗(Pan_lR700)的样品用PBS稀释制备。(A)Pan-1R700溶液的荧光强度图像:荧光强度随着Pan_lR700浓度的减小而降低。(B)Pan-1R700的荧光寿命(FLT)图像:不同浓度的Pan_lR700溶液的FLT的值几乎相同,3.56+/-0.081ns ;3.62 (2.5pg/mL),3.58 (5pg/mL),3.44 (20pg/mL), 3.60ns(40pg/mL)。(C)对A431细胞片状沉淀物进行LED光照射改变了 FLT。用剂量为0、8、15和30J/cm2的PIT处理与Pan-1R700孵育24小时的A431细胞系。与光暴露前的3.28ns相比,FLT缩短至3.09、2.94和2.85ns。这些表示分别缩短了 9.1,10.1和13.1%。(D)A431片状沉淀物的FLT依赖于与Pan-1R700孵育的时间。随着与Pan_IR700孵育的时间的推移,FLT值放大。FLT从2.98ns (I小时)变为3.42ns (24小时)。
[0048]图11的数字图像示出了用Pan-1R700 (10jig/m0)在37°C预孵育24小时的A431细胞在开始暴露于NIR光后5、15、60和90秒的连续荧光(下图)和微分干涉相差(DIC)显微镜图像(上图)。Pan-1R700在与细胞膜结合后逐渐内化到A431细胞的细胞质中,直至注射后24小时。DIC上的形态改变因暴露于更大剂量的NIR光而变得更严重。比例尺,50pm。
[0049]图12A-D.经照射的肿瘤(暗灰色柱)和未经照射的肿瘤(亮灰色柱)的FLT的比较。(A)在小鼠背部两侧接种A431细胞的同一小鼠中,进行剂量为10、30、50J/cm2的PIT之前或之后的FLT图像。右侧肿瘤用PIT处理而左侧肿瘤被覆盖。将用50J/cm2 (B)、30J/cm2 (C)和10J/cm2(D)的PIT处理的A431肿瘤的FLT绘图。与未经照射的肿瘤相比,证明了 NIR光剂量为30和50J/cm2的PIT使FLT立即显著(P〈0.05)缩短。然而,在10J/cm2的低剂量下,FLT不会显著缩短。在PIT后6小时观察到FLT的短暂延长,这可能是由于被活性巨噬细胞摄取。使用Mann-Whitney U检验进行统计分析。
[0050]图13A-C.(A)与无处理对照(OJ/cm2)(对照)相比,用50和30J/cm2的PIT处理的肿瘤中的FLT显著缩短(P < 0.01)。50和30J/cm2的PIT使FLT分别立即缩短至69.1+/-10.9%和61.5+15.1%。没有立即观察到仅用10J/cm2照射的A431肿瘤显示出显著的FLT缩短。与无处理对照相比,PIT后48小时,FLT仅缩短了 7.7%。(B)随着时间的推移,在PIT处理的小鼠中未经照射的肿瘤的FLT比未处理的小鼠中的FLT缩短得稍多,但是这些改变是不显著的。使用Student’ s t检验进行统计分析。(C)示出了用0、10、30和50J/cm2的PIT处理的A431肿瘤的组织学样本。所有样本用苏木精和伊红染色。对处理的肿瘤进行的显微镜评估表明,PIT后健康的或受损的肿瘤细胞簇有不同程度的坏死和微出血。当给予30和50J/cm2的NIR光时,坏死性损伤是弥散且强烈的并且可见到的存活的肿瘤细胞更少。相反,当仅给予10J/cm2的NIR光时,仅在所述肿瘤内的有限区域中存在坏死性细胞损伤,而仍然存在大量的健康的癌病灶。比例尺指示50 μ m。
[0051]图14A-C。k.在 PIT 后 PEG 化的 Qdot800 的动态图像。用 Pan_IR700 注射 A431小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予QdotSOO。在10分钟内仅右侧肿瘤清晰地显示出来。B.PIT处理的肿瘤(绿色;上)、对照肿瘤(蓝色;中间)和背景(黑色;下)的时间-信号强度曲线。C.荧光显微术。IR700信号显示出存活的A431细胞。Qdot800在PIT处理的肿瘤组织中广泛分布,并部分地观察到IR700和Qdot800共定位,然而,在对照肿瘤中,Qdot800的信号位于主血管的附近。[0052]图15A-15B.A.PIT后SPIO的动态图像。用Pan_IR700注射A431小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予SP10。在5分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。B.普鲁士蓝染色和HE染色。
[0053]图16A-16D.A.PIT 后 Pan-1R800 的动态图像。用 Pan_IR700 注射 A431 小鼠,24 小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予Pan_IR800。在10分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。B.Pan-1RSOO在PIT处理的肿瘤中可以以依赖于照射的光剂量的方式快速累积。在对照肿瘤中没有观察到信号。C和D。PIT后24小时,Pan-1R800不能被所述肿瘤吸收,可能是因为修复了血管的基底(间质压恢复)或血流停止。
[0054]图17A-F.A-C PIT后含有柔红霉素的脂质体的动态图像。用Pan_IR700注射A431小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予含有柔红霉素的脂质体。在30分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。D.荧光显微镜研究。IR700信号显示存活的A431细胞。含柔红霉素的脂质体在PIT处理的肿瘤组织中广泛分布并部分地观察到IR700与Qdot800的共定位,然而,对照肿瘤中Qdot800的信号位于主血管的附近。E.PIT与含柔红霉素的脂质体结合的联合疗法显著地抑制了肿瘤生长和(F)延长了荷A431小鼠的存活时间。
[0055]图18提供的示意图示出了使用PIT和化学疗法治疗肿瘤的示例性方法,所述方法可包括对肿瘤进行成像。
[0056]图19A-19B.A.PIT 后 Tra_IR800 的动态图像。用 Tra_IR700 注射 3T3/HER2 小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予Tra_IR800。在10分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。白色箭头示出光不充足地照射3T3HER2肿瘤的位置。Tra-1R800仅在所述肿瘤暴露于NIR光的区域累积。B.PIT后Pan_IR800的动态图像。用Pan-1R700注射荷MDA-MB-468的小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予Pan-1R800。在10分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。
[0057]图20A-20C.A.PIT后USPIO的动态图像。用Pan_IR700注射A431小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予USP10。在5分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。B.普鲁士蓝染色和HE染色。C.PIT后G6-Gd的动态图像。用Pan-1R700注射A431小鼠,24小时后,NIR光(50J/cm2)照射右侧肿瘤。在PIT处理后I小时给予G6-Gd。在5分钟内仅右侧肿瘤清楚地显示出来。
[0058]图21A-21B.A.肿瘤边缘区域和核心区域的荧光显微镜研究。IR700信号显示存活的A431细胞。含有柔红霉素的脂质体在PIT处理的肿瘤组织中广泛分布,并且部分地观察到IR700和含有柔红霉素的脂质体的共定位。尤其是在核心区域中,DX可在局部坏死的区域中被吸收。B.治疗后的体重变化。在组之间没有明显的差异。
【具体实施方式】
[0059]除非另有说明,否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本公开发明所属【技术领域】的普通技术人员通常所理解的相同。除非上下文另有明确说明,否则单数术语“一”、“一个”和“所述”包括复数指代物。类似地,除非上下文另有明确说明,否则词语“或”意欲包括“和”。“包含”意指“包括”。因此“包含A或B”意指“包括A”或“包括B”或“包括A和B”。[0060]下文描述了适合用于实践和/或测试本公开实施方案的方法和材料。这些方法和材料仅仅是例证性的并不意欲是限制性的。可以使用其他与本文描述的那些相类似或等价的方法和材料。例如,本公开的发明所属【技术领域】中熟知的常规方法记载于多种一般性和更具体的参考文献中,包括例如Sambrook et al., Molecular Cloning:ALaboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ;Sambrooket al., Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring HarborPress,2001 ;Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing Associates, 1992 (和 2000 年增刊);Ausubel et al., Short Protocols inMolecular Biology:A Compendium of Methods from Current Protocols in MolecularBiology, 4th ed.,ffiley&Sons, 1999 ;Harlow and Lane, Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1990 ;和 Harlow and Lane, UsingAntibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999。
[0061]对于在2010年7月9日犾得的序列,与本文参考的所有GenBank登录号相关的序列以引用的方式纳入本文。
[0062]为方便阅读本公开的各种实施方案,提供了以下对具体术语的解释:
[0063]给药:通过任何有效的途径提供或给予受试者试剂,例如抗体-1R700分子。示例性的给药途径包括但不限于局部、注射(例如皮下、肌肉内、真皮内、腹膜内、肿瘤内和静脉内)、口腔、眼睛、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。
[0064]抗体:包含至少轻链或重链免疫球蛋白可变区的多肽配体,其特异性识别并结合抗原(例如肿瘤特异性蛋白)的表位。抗体由重链和轻链组成,所述重链和轻链各自具有可变区,称为重链可变区(Vh)和轻链可变区(')。所述Vh区和\区一起负责结合被抗体识别的抗原。
[0065]抗体包括完整的免疫球蛋白以及本领域熟知的抗体的变体和部分,例如Fab片段、Fab’片段、F(ab) ’ 2片段、单链Fv蛋白(“scFv”)和二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)。scFv蛋白是融合蛋白,其中免疫球蛋白的轻链可变区和免疫球蛋白的重链可变区通过接头结合,而在dsFv中,所述链已被突变以引入二硫键来稳定所述链的连接。所述术语还包括遗传工程形式例如嵌合抗体(例如人源化鼠抗体)、异缀合抗体(heteroconjugate antibody)(例如双特异性抗体)。还见于Pierce Catalog and Handbook, 1994_1995(Pierce ChemicalC0., Rockford, IL) ;Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., ff.H.Freeman&C0., New York, 1997。
[0066]通常,天然的免疫球蛋白具有通过二硫键互相连接的重链(H)和轻链(L)。有两种类型的轻链:λ和κ。有5种决定抗体分子功能活性的主要重链类型(或同种型):IgM、IgD、IgG、IgA 和 IgE。
[0067]每条重链 和轻链均含有恒定区和可变区(所述区域还称为“结构域”)。重链可变区与轻链可变区结合,特异性地结合抗原。轻链和重链可变区含有被三个高变区(也称为“互补决定区”或“⑶R”)隔开的“框架”区。已经确定了框架区和⑶R的范围(见Kabat etal., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S.Department of Healthand Human Services, 1991,其以引用的方式纳入本文)。Kabat数据库目前在线维持。不同的轻链或重链的框架区的序列在同一物种例如人内是相对保守的。抗体的框架区,也就是组成性轻链和重链的结合框架区,用于在三维空间中安置和排列CDR。[0068]⑶R主要负责与抗原的表位结合。每条链的⑶R —般称为⑶R1、⑶R2和⑶R3,从N端开始顺序编号,一般还通过所述具体⑶R所在的链来鉴定。因此,Vh⑶R3位于其所在抗体的重链的可变结构域,而' CDRl是来自其所在抗体的轻链的可变结构域的CDR1。具有不同特异性的抗体(即,对不同的抗原有不同的结合位点)具有不同的CDR。虽然抗体与抗体之间的CDR不同,但是CDR内仅有限数量的氨基酸位置直接参与抗原结合。CDR内的这些位置被称为特异性决定残基(SDR)。
[0069]提及“VH ”或“VH”时,是指免疫球蛋白重链的可变区,包括Fv、scFv、dsFv或Fab的重链可变区。提及或“VL”时,是指免疫球蛋白轻链的可变区,包括Fv、scFv、dsFv或Fab的轻链可变区。
[0070]“单克隆抗体”是由B-淋巴细胞的单个克隆或由其中已经转染了单个抗体的轻链和重链基因的细胞产生的抗体。单克隆抗体通过本领域技术人员所知晓的方法产生,例如通过将骨髓瘤细胞和免疫脾细胞融合制备杂合的抗体形成细胞。单克隆抗体包括人源化单克隆抗体。
[0071]“嵌合抗体”具有来自一个物种例如人的框架残基和来自另一物种的CDR (其一般赋予抗原结合能力)例如特异性结合间皮素的鼠抗体。
[0072]“人源化”免疫球蛋白是包括人框架区和一个或多个来自非人(例如小鼠、大鼠或合成的)免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白被称为“供体”,提供所述框架的人免疫球蛋白被称为“受体”。在一个实施方案中,人源化免疫球蛋白中的所有CDR均来自供体免疫球蛋白。恒定区不一定存在,但是如果存在则必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同,即,具有至少约85-90%,例如约95%或更高的同一性。因此,可能除了⑶R外,人源化免疫球蛋白的所有部分均与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。“人源化抗体”是包含人源化轻链和人源化重链免疫球蛋白的抗体。人源化抗体与提供CDR的供体抗体结合相同的抗原。人源化免疫球蛋白或抗体的受体框架可有有限数量的氨基酸被取自供体框架的氨基酸置换。人源化或其他单克隆抗体可以具有额外的保守性氨基酸置换,所述置换对抗原结合或其他免疫球蛋白功能基本没有影响。人源化免疫球蛋白可以通过遗传工程方法构建(参见例如,美国专利N0.5,585,089)。
[0073]“人”抗体(也称为“全人”抗体)是包括人框架区和全部来自人免疫球蛋白的⑶R的抗体。在一个实例中,框架和CDR来自相同来源的人重链和/或轻链氨基酸序列。然而,可以将来自一种人抗体的框架设计成包括来自不同人抗体的CDR。人免疫球蛋白的所有部分均与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相同。
[0074]“特异性结合”是指相对于与无关蛋白例如非肿瘤蛋白例如β肌动蛋白结合,单个抗体特异性地与抗原例如肿瘤特异性抗原发生免疫反应的能力。例如,HER2特异性结合剂在体外或体内基本上只结合HER-2蛋白。本文使用的术语“肿瘤特异性结合剂”包括肿瘤特异性抗体和在该制剂中基本上只结合肿瘤特异性蛋白的其他试剂。
[0075]所述结合是抗体分子和T细胞表面分子的抗原决定簇之间的非随机结合反应。所需的结合特异性一般是由抗体对T细胞表面分子和无关抗原的不同结合能力的参考点来决定的,并因此区别两种不同的抗原,尤其是当两种抗原具有独特的表位时。特异性结合特定表位的抗体被称为“特异性抗体”。
[0076]在一些实例中, 抗体(例如抗体-1R700分子)特异性结合靶(例如细胞表面蛋白)的结合常数比对于样品或受试者中的其他分子的结合常数高至少IO3Jr1UO4Ir1或ιο5μ'在一些实例中,抗体(例如单克隆抗体)或其片段的平衡常数(Kd)为InM或更低。例如,抗体结合靶例如肿瘤特异性蛋白的亲和力为至少约0.1Χ10_8Μ、至少约0.3Χ10_8Μ、至少约0.5Χ10-8Μ、至少约 0.75Χ10-8Μ、至少约 1.0X 10-8Μ、至少约 1.3Χ10-8Μ、至少约 1.5 X KT8M或至少约2.0Χ10_8Μ。例如,Kd值可通过竞争ELISA (酶联免疫吸附测定)或使用表面等离子共振设备例如可购自Biacore, Inc., Piscataway, NJ的Biacore TlOO确定。
[0077]抗体-1R700分子或抗体-1R700缀合物:包括与IR700缀合的抗体例如肿瘤特异性抗体的分子。在一些实例中,所述抗体是特异性结合癌细胞上的表面蛋白的人源化抗体(例如人源化单克隆抗体)。
[0078]抗原(Ag):可在动物体内刺激抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质,包括被注射或吸收进入动物体内的组合物(例如包括肿瘤特异性蛋白的组合物)。抗原与特异性体液免疫或细胞免疫的产物反应,所述产物包括由异源抗原例如本公开的抗原诱导的那些。“表位”或“抗原决定簇”是指B和/或T细胞对其作出应答的抗原区域。在一个实施方案中,当表位与MHC分子一同呈递时,T细胞对表位作出应答。表位可以由相邻氨基酸或由因蛋白质的三级折叠并列的非相邻氨基酸形成。由相邻氨基酸形成的表位暴露通常在变性溶剂后仍然存在,而三级折叠形成的表位通常在用变性溶剂处理后丢失。表位在独特的空间构象中一般包括至少3个并且更常见地至少5个、约9个或约8-10个氨基酸。确定表位空间构象的方法包括,例如X-射线晶体法和核磁共振。
[0079]抗原的实例包括但不限于含有抗原决定簇的肽、脂质、多糖和核酸,例如被免疫细胞识别的那些。在一些实例中,抗原包括肿瘤特异性肽(例如出现在癌细胞表面上的肽)或其免疫原性片段。
[0080]癌症:特征为 异常或不受控的细胞生长的恶性肿瘤。常常与癌症相关的其他特征包括转移,干扰邻近细胞的正常功能,以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物以及抑制或加重炎症应答或免疫应答,侵入周围或远处的组织或器官,例如淋巴结等。“转移性疾病”是指已经离开最初的肿瘤部位并例如经血流或淋巴系统移行至身体其他部位的癌细胞。在一个实例中,通过本公开的方法杀死的细胞是癌细胞。
[0081]接触:以直接物理联系的方式包括固体和液体形式放置。接触可在体外(例如与分离的细胞例如肿瘤细胞)或在体内(通过给予受试者(例如有肿瘤的受试者))发生。
[0082]减少:使某物的质量、数量或强度减少。在一个实例中,例如与没有抗体-1R700分子时的应答相比,包括一种或多种抗体-1R700分子的治疗性组合物,在用NIR(例如波长为约680nm)以至少IJ cm2_的剂量照射后,可使得所述抗体-1R700分子特异性结合的细胞的活力减少。在一些实例中,这种减少通过杀死所述细胞来证明。在一些实例中,相对于用不包含抗体-1R700分子的组合物所观察到的活力,所述细胞的活力减少至少20%、至少50%、至少75%或甚至至少90%。在其他实例中,减少以倍数变化来表示,例如,相对于用不包含抗体-1R700分子的组合物所观察到的活力,所述细胞活力减少了至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少8倍、至少10倍或甚至至少15或20倍。这种减少可使用本文公开的方法测量。
[0083]IR700 (IRDye? 700DX):具有下式的染料:
[0084]
【权利要求】
1.一种杀死细胞的方法,包括: 使含细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-1R700分子接触,其中所述抗体特异性结合所述细胞表面蛋白; 在660-740nm的波长下以至少IJ cm—2的剂量照射所述细胞;和 在照射所述细胞之后约0-8小时,使所述细胞与一种或多种治疗剂接触,从而杀死所述细胞。
2.一种实时检测细胞杀死的方法,包括: 使含细胞表面蛋白的细胞与治疗有效量的一种或多种抗体-1R700分子接触,其中所述抗体特异性结合所述细胞表面蛋白; 在660-740nm的波长下以至少30J cm—2的剂量照射所述细胞; 在照射所述细胞后约0-48小时,用荧光寿命成像检测所述细胞,从而实时检测所述细胞杀死。
3.权利要求1的方法,还包括: 在照射所述细胞后约0-48小时, 用荧光寿命成像检测所述细胞。
4.权利要求1-3任一项的方法,其中所述细胞是肿瘤细胞。
5.权利要求3的方法,其中所述肿瘤细胞是癌细胞。
6.权利要求5的方法,其中所述癌细胞是乳房、肝、结肠、卵巢、前列腺、胰、脑、子宫颈、骨、皮肤或肺的癌细胞。
7.权利要求5的方法,其中所述癌细胞是血液的癌细胞。
8.权利要求1-7任一项的方法,其中所述细胞表面蛋白是肿瘤特异性蛋白。
9.权利要求8的方法,其中所述肿瘤特异性蛋白包括HER1、HER2、⑶20、⑶25、⑶33、⑶52、⑶44、⑶133、Louis Y、间皮素、CEA或前列腺特异性膜抗原(PSMA)。
10.权利要求1-9任一项的方法,其中所述抗体-1R700分子包括帕尼单抗-1R700分子、曲妥单抗-1R700 分子、Basilitumab-1R700 分子、赛尼哌-1R700 分子、Simitect_IR700分子或J591-1R700分子。
11.权利要求1-10任一项的方法,其中在680nm的波长下照射所述细胞。
12.权利要求1-11任一项的方法,其中所述一种或多种抗体-1R700分子包括至少两种不同的抗体-1R700分子,其中第一抗体-1R700分子对第一抗原特异,第二抗体-1R700分子对所述第一抗原的不同表位特异或者对第二抗原特异。
13.权利要求1-12任一项的方法,其中所述细胞在受试者中,并且使所述细胞与所述一种或多种抗体-1R700分子和所述一种或多种治疗剂接触,包括给予所述受试者治疗有效量的所述一种或多种抗体-1R700分子和所述一种或多种治疗剂。
14.权利要求1-13任一项的方法,其中所述细胞在受试者中,并且照射所述细胞包括: 照射所述受试者;和/或 照射所述受试者中的肿瘤。
15.权利要求1-14任一项的方法,其中所述细胞在受试者的血液中,并且其中照射所述细胞包括通过使用所述受试者穿戴的装置来照射所述血液,其中所述装置包含近红外(NIR)发光二极管(LED)。
16.权利要求1-15任一项的方法,其中所述细胞在受试者中,并且所述方法还包括:选择具有表达可特异性结合抗体-1R700分子的细胞表面蛋白的肿瘤的受试者。
17.权利要求1-16任一项的方法,其中所述方法使所述肿瘤的体积或尺寸相对于没有治疗减少达至少25%。
18.权利要求13-17任一项的方法,其中相对于没有给予所述抗体-1R700分子和照射,所述方法使所述受试者的存活时间增加。
19.权利要求1或3-18任一项的方法,还包括: 使所述细胞与低于治疗有效量的量的一种或多种抗体-1R700分子接触;和在660-740nm的波长下以至少0.0OlJ cm—2的剂量照射所述细胞,从而容许对所述细胞进行检测。
20.一种组合物,包含帕尼单抗-1R700分子、曲妥单抗-1R700分子或J591-1R700分子。
21.一种可穿戴装置,包含: 衣服、珠宝或覆盖物;和 被纳入到所述衣服、珠宝或覆盖物中的NIR LED。
22.权利要求21的可穿戴装置,还包含被纳入到所述衣服、珠宝或覆盖物中的电源和/或冷源。
23.—种杀死受试者血`液中的肿瘤细胞的方法,包括: 给予所述受试者治疗有效量的一种或多种抗体-1R700分子,其中所述抗体特异性结合所述肿瘤细胞上的细胞表面蛋白;和 用NIR LED以660-740nm的波长和以至少20Jcm_2的剂量照射所述肿瘤细胞,从而杀死所述细胞,其中所述NIR LED存在于所述受试者穿戴的权利要求21-22任一项的可穿戴装置中。
【文档编号】A61K41/00GK103781495SQ201280043973
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年6月27日 优先权日:2011年7月11日
【发明者】小林久隆, P·库伊克, M·博纳多 申请人:美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表)
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