包含两亲性的在亲水部分总体带正电的分子类型a和两亲性的分子类型b以及多酚c的分 ...的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含两亲性的在亲水部分具有正的总电荷的分子类型A和两亲性的分子类型B和多酚C的分子混合物，还涉及这种分子混合物的制备方法及其应用。其中所述分子类型A和B以l(±0.2):l(=0.2)mol/mol的A:B的摩尔比存在。还公开了制备这种混合物的方法及其应用。
【专利说明】包含两亲性的在亲水部分总体带正电的分子类型A和两亲性的分子类型B以及多酚C的分子混合物其制备方法及应用
[0001]本发明涉及包含两亲性的在亲水部分具有正的总电荷的分子类型A和两亲性的分子类型B和多酚C的分子混合物，还涉及这种分子混合物的制备方法及其应用。
现有技术
[0002]多酚是存在于植物种子、叶和果实中的次级植物化学物。这种物质中的一些对癌细胞起抑制作用(Mentha, R.G., Murillo G., Naithani R.和 Peng X.，Pharm Res(2010) 24:950-961)或保护而免受所不希望的氧化过程(Queen B.L., Tollefsbold T.0.，Curr.AgingSe1.(2010).3:34-42)。因此，它们属于人类营养中的重要成分。另一方面，他们也是化疗中的重要成分，因为它们在极高的浓度下具有毒性作用。由于多酚的高的治疗重要性，其对生物体可控而有效的施用是令人极其感兴趣的。
[0003]在水溶液中的这类疏水性活性物质的施用具有多种缺点。一方面，需要非常高的浓度以达到治疗效果。而绝大部分的有效物质不能够达到细胞，因此大约99%的多酚没有被细胞吸收。另一方面，它们由于在水性环境中不希望的氧化而失去其效果。
[0004]脂质体和聚合物胶囊提高了多酚的生物可用性，因为相比于水性施用，它们更易于表现出物理化学性质和亲水性(Nair H.B.等人，Biochem.Pharmacology
(2010).80:1833-18 43; Kristi J.等人，Eu.J.0f Pharmaceutics andBiopharmaceutics (2009).73:253-259; Narayanan N.K., Nargi D., Randolph C,和Narayanan B.A., (2009).1nt.J.Cancer.125:1-8)。尽管这些胶囊因此具有优点，但不利的是不能保证可控的释放和多酚被靶细胞快速地吸收。脂质体也只能部分地保护多酚免受所不希望的氧化过程。
[0005]本发明的目的和解决方案
本发明的目的因此在于，提供一种分子混合物，在其中使多酚稳定并保护其免受氧化过程。多酚或多酚的混合物应该如下存在，即其可以迅速和高效地甚至以超过平均水平的高量控制，即以所希望的量引入到活的细胞中，并由此获得对细胞的有针对性的预防效果或有针对性的毒性效果。此外，本发明的目的还在于提供制备所述混合物的方法及其应用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的通过本发明的根据独立权利要求的混合物，制备该混合物的方法和该混合物的用途得以实现。有利的实施方案可以从各自的从属权利要求，特别是从要求保护作为脂质体的分子混合物的权利要求6中获得。
[0007]本发明的分子混合物具有至少两种分子类型A和B以及多酚C。
[0008]所述两种分子类型A和B的摩尔比为A:B为大约1:1。可以允许与该优选的1:1mol/mol 的比例有微小的偏差，即 I (±0.2):1 (±0.2) mol/mol 的 A:B。
[0009]有利地，分子类型A、B和多酚C的摩尔比应该为约1( + 0.2):1(±0.2):0.1-25mol/mol，特别有利的是I (±0.2):1 (±0.2):0.1-10 mol/mol，和非常特别有利的是1(±0.2):1(±0.2):0.5-5 mol/mol 0对于最后提及的情况，在体外已经证明多酚C经由脂质体结合到靶细胞中。
[0010]如已提及的，与所述比例的微小偏差是允许的，只要分子类型A的相互排斥的电荷能通过中性的辅助分子B平衡。对于多酚C来说，A:B: C的比例在体外自大约1: 1:5 mol/mo I变化到毒性浓度。
[0011]可以理解，对于每种分子类型A和B的相应中间值是允许的，即例如对于分子类型A和分子类型B来说0.8,0.9、1.0、1.1和1.2和反之其中间值都是允许的。这同样适用于多酚C，即只要仅确保多酚C能够快速地由混合物结合到靶细胞中并且特别是由脂质体结合到细胞中，所有数值0.01,0.02,0.03,0.04...24.98,24.99和25.00可允许与在具有分子类型A和B的所述混合物中的所述数值的自由组合。
[0012]此外，在本发明范围内认识到，相较于如现有技术中按照Kristl等人所做般由中性脂质体开始，借助由本发明的混合物制成的带正电的脂质体可以更好地使多酚含于并结合到靶细胞中及其细胞膜中。在那里由于制备方法造成在制成的脂质体的表面上白藜芦醇仅少量尽可能加载在脂质体上，因为在那里在水相中制备脂质体之后才加入多酚。与此相反，在本发明的情况中，在由经干燥的混合物制备脂质体时已经存在多酚。因此，多酚是脂质体膜中的基本成分，并大量结合在其中。由此有利地将多酚C可控地、有针对性地、完全地加载于脂质体上。此外，在本发明范围内认识到，然后在脂质体膜中的多酚发生由细胞的膜引发的自身融合。由此有利导致所述多酚高效并快速地转移到靶细胞中。
[0013]此外已发现，所述多酚在形成脂质体的膜中受到非常好的保护避免初期氧化。
[0014]对所述混合物的制备方法已认识到，多酚通常可良好地溶解在有机溶剂如乙醇或氯仿中，因此这可阻止多酚的初期氧化。因此，为提供本发明的混合物，将溶解的多酚与分子类型A和B的中性和带正电的脂质在至少一种有机溶剂中进行混合。这起到均化分子混合物的作用。
[0015]可以理解，在除去有机溶剂之后，该混合物有利地以粉末状的、均化的形式存在。仅此就已实现了本发明的目的。
[0016]当用于混合时，也应相应于用于制备方法一般，选择分子比例A:B为1(±0.2):1(±0.2) mol/mol O有利地，分子类型A、B的正电和中性的脂质和多酚C的摩尔比应该为或设定为约1(±0.2):1(±0.2):0.1-25 mol/mol,特别有利的是1(±0.2):1(±0.2):1-10 mol/mol，和非常特别有利的是 I (±0.2):1 (±0.2):0.5-5 mol/mol。如如所述，在此些许偏差是允许的。
[0017]本发明的混合物(优选定义为脂质体)和基于本发明的混合物(特别是脂质体)的获得应用的药物因此以给定的比例包含分子类型A和分子类型B以及多酚C。
[0018]在另一特别有利的本发明的实施方案中，通过将有机相经过粉末状相转移到水性的脂质体的环境中，以特别有利的方式提高了多酚用于治疗目的的生物可用性，同时保护其免受氧化作用。
[0019]因此将所述由分子类型A和B与多酚C构成的本发明的分子混合物与一种或多种有机溶剂分离并小心地转移到PH约为7的水性缓冲液中。也就是说，为了制备所述脂质体，基本上将有机组分替换成基于水性的生理缓冲液的体系。[0020]在水性环境中才形成该特别优选的多层封闭的球形结构，即所谓的脂质体。通过另外的步骤，例如超声处理、挤压或溶液的多次冷却和加热(最低到4°C和最高到70°C)，可以进一步均化该脂质体。由于分子类型A，这些结构具有正电荷(ζ电势Uz=30-100 mV)。大多数非极性的多酚位于脂质双层、脂质体膜的内部，由此以有利的方式屏蔽掉反应性的氧自由基并受到保护。可以由所有根据本发明的混合物形成这种脂质体。
[0021]由于带正电的脂质与植物多酚的离域电子的相互作用，加载有多酚C的本发明的脂质体通过简单的表面接触经几分钟(5-20分钟)高效地与动物细胞的质膜融合。
[0022]如果所述混合物以脂质体形式存在，则多酚C绝大多数结合到脂质体膜中存在。只有较少部分在脂质体本身的内部中溶解到水性缓冲液中。这样造成多酚本身引发与靶细胞膜的融合。
[0023]在治疗应用期间，所述酚类本身代替细胞分子被氧化。由此，多酚的存在有利地阻止了细胞的过氧化。因此，本发明的混合物和由其制成的药物在治疗所有氧化性疾病过程时或对某些癌症疾病是有效的治疗剂。
[0024]如果在体外在混合物中或在脂质体中应存在较大量的这种自由基捕获剂，则可以使用或给予分子类型A、B和多酚C的摩尔比例的值为约1:1:5 mol/mol ο这种混合物则更确切地说起毒性作用。因此，在癌症治疗中推荐这种大量或甚至更大的量，以高度过氧化癌细胞并由此将其杀死。在体内，其它浓度是可能的并可以考虑。
[0025]所述混合物和带正电的脂质体因此必须含有分子类型A和分子类型B。分子类型A的标准是，(a)该分子具有带至少一个或多个正电荷的亲水部分，因此该分子的亲水部分的总电荷是正的。 在分子的目的是，通过静电力将该融合混合物带到带负电的细胞膜附近。(b)分子类型A还具有疏水部分，优选带或不带双键的C10-C30-部分。双键的有利作用是使产生的脂质体的膜变得有弹性，从而使该脂质体与细胞膜的融合变得容易。合适的分子例如是1，2- 二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-(2.3- 二油基氧基丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二甲基-二-十八烷基溴化铵(DDAB)或(1_[2_(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟基乙基)氯化咪唑啉鎗(DOTIM)。作为第一个实例可提及DOTAP(1，2- 二油酰基-3-三甲基铵丙烷(氯化物盐))。
[0026]分子类型B的标准是，(a)该分子必须具有亲水部分以及带或不带双键的疏水部分(特别是C10-C30)。关于双键的功能见类型A。(c)两个部分均应具有中性性质，以中和分子类型A的带正电的分子之间的大的电荷密度和排斥力。该效果导致体系稳定。分子类型B因此是辅助分子。合适的分子例如是磷脂酰乙醇胺类和磷脂酰胆碱类，例如1，2- 二油酰基-sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DOPE)、1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DPPE)、I, 2- 二肉豆蘧酰基(Dimiristoyl) -sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DMPE)、I, 2-反油酸酰基(Dielaidoyl) -sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺(DEPE)、1，2- 二植烷醇sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二亚油酰基sn-甘油基-3 - 二氧磷基乙醇胺或1，2- 二油酰基sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱(DOPC)。
[0027]所用的多酚是含有至少两个直接连在芳环上的羟基并属于次级植物化学物的分子。对于本发明的混合物和脂质体，优选以给定的比例选择多列如白藜芦醇、姜黄素、羟基黄酮和金雀异黄酮。
[0028]下面，借助实施例和两张附图进一步描述本发明，并不应该因此认为限制本发明。[0029]其中:
图1:优选的多酚的结构:1.白藜芦醇.11.姜黄素.1I1.羟基黄酮.1V.金雀异黄酮.图2:白藜芦醇结合到带正电的脂质体中以及其在细胞中的体外证明。
[0030]在图1中显示的结构式仅示例性地显示了几种特别重要的和易于获得的多酚。但是，其它没有显示的多酚也应该明确包含在有效的权利要求保护中。当然也可以考虑将不同于所示的其它多酚用于本发明的混合物和脂质体的制备和用途中。
[0031]1.实施例-对细胞的体外研究:将作为分子类型A的带正电的脂质的1，2_二油酰基-3-三甲基铵-丙烷、氯化物盐(DOTAP)以及作为分子类型B的中性的脂质1，2-二油酸基-sn-甘油基 _3_ 二氧憐基乙醇胺(DOPE) (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster,AL, USA)和作为荧光标记物脂质的N-(4，4- 二氟-5，7- 二甲基-4-硼杂(bora)_3a，4a- 二氮杂-对称引达省(s-1ndacene)-3-丙酰基)_1，2_ 二-十六烧酰基_sn_甘油基_3_ 二氧磷基乙醇胺(三乙铵盐)(相当于 BODIPY? FL-DHPE) (Invitrogen, Eugene, OR, USA)以摩尔比例 DOTAP/DOPE/BODIPY? FL-DHPE = 1/1/0.005 mol/mol 以约为 I mg/ml 的总的脂质浓度溶解在氯仿/乙醇(10/1体积/体积)的溶剂混合物中，并将其混合。
[0032]其中，B0DIPY? FL-DHPE仅仅是用于证明脂质体和质膜之间成功的膜融合。这种染料料明确不是本发明混合物或本发明脂质体的主题。
[0033]首先将白藜芦醇(Sigma-Aldrich,St.Louis, MO, USA)以 I mg/ml 的浓度溶于作为有机溶剂的乙醇中并且均化。
[0034]然后将由分子类型A和B和B0DIPY? FL-DHPE形成的脂质组分以下列摩尔比例由于有机溶剂混合物的缘故与白藜芦醇相互混合(表1)。
[0035]表1:组分A、B和多酚C以及溶剂的量和体积的数据(MW=分子量；stock=原液)。
【权利要求】
1.分子混合物，其包含两亲性的在亲水部分具有正的总电荷的分子类型A和两亲性的在亲水部分呈中性的分子类型B和多酚C，其中所述分子类型A和B和所述多酚C以..1(±0.2):1(±0.2):0.5-5 mol/mol 的 A:B:C 的摩尔比存在。
2.根据前述权利要求的混合物， 其特征在于， I,2- 二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N-(2.3- 二油基氧基丙基)-N，N, N-三甲基氯化铵(DOTMA)、二甲基-二 -十八烷基溴化铵(DDAB)或(1_[2_(油酰基氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟基乙基)氯化咪唑啉鎗(DOTIM)或其混合物作为分子类型A。
3.根据前述权利要求之一的混合物， 其特征在于， 磷脂酰乙醇胺类和磷脂酰胆碱类，例如1，2- 二油酰基-sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二棕榈酰基-sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二肉豆蘧酰基_sn-甘油基_3_ 二氧憐基乙醇胺、1，2-反油酸酸基-sn_甘油基-3- 二氧憐基乙醇胺、1，2- 二植烧醇sn-甘油基-3- 二氧磷基乙醇胺、1，2- 二亚油酰基sn-甘油基_3 - 二氧磷基乙醇胺或.1，2- 二油酰基sn-甘油基-3-磷脂酰胆碱或其混合物作为分子类型B。
4.根据前述权利要求之一的混合物， 其特征在于， 白藜芦醇、姜黄素、羟基黄酮和/或金雀异黄酮或其混合物作为多酚。
5.根据前述权利要求之一的混合物， 其特征在于， 所述分子类型A和B和所述多酚C以1(±0.2):1(±0.2):0.5-2.5 mol/mol的A:B:C的摩尔比，特别是以1(±0.2):1(±0.2):0.62-2.5 mol/mol的A:B:C的摩尔比和特别是以.1(±0.2):1(±0.2):1.25-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩尔比存在。
6.根据前述权利要求之一的混合物， 其特征在于， 其作为脂质体在水性环境中存在。
7.制备根据前述权利要求1-5之一的混合物的方法， 其特征在于下列步骤: a)将所述分子类型A和B溶于有机溶剂中， b)将所述多酚C与分子类型A和B分开地溶于有机溶剂中并混合，或与分子类型A和B一起溶于同一有机溶剂中并混合， c)如果在步骤b)中所述多酚C在所述有机溶液中的溶解与分子类型A和B的溶解分开进行，则将含有分子类型A和B的溶剂和含有多酚C的溶剂相互混合并均化，其中在每种情况中在步骤b)和c)中选择I (±0.2):1 (±0.2):0.5-5 mol/mol的A:B:C的摩尔比， d)除去所述一种或多种溶剂。
8.根据前述权利要求的方法， 其特征在于， 选择甲醇或乙醇作为所述多酚C的溶剂，并通过选择氯仿、乙醇和/或甲醇作为所述分子类型A和B的溶剂。
9.根据前述两项权利要求之一的方法， 其特征在于， 在步骤 b)和 c)中选择 1( + 0.2):1(±0.2):0.62-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩尔比和特别是 1(±0.2):1(±0.2):1.25-2.5 mol/mol 的 A:B:C 的摩尔比。
10.根据用于制备根据权利要求6的脂质体的前述三项权利要求之一的方法， 其特征在于， 将所述分子混合物转移到生理水溶液中。
11.药剂，其包含根据前述权利要求1-6之一的混合物。
12.根据前述权利要求1-6之一的混合物 在制备用于治疗由氧化应激引起的细胞疾病的药剂中的用途。
13.根据前述权利要求1-6之一的混合物或根据权利要求10的药剂用于治疗由氧化应激引起的细胞疾病的用途。
14.用根据前述权利要求1-6之一的混合物或根据权利要求10的药剂治疗由氧化应激引起的细胞疾病的方法。
15.融合方法，在所述方法中根据权利要求6的加载有多酚C的脂质体由于带正电的脂质和植物多酚的离域电子之间的相互作用通过简单的表面接触经几分钟高效地与动物细胞的质膜融合。
【文档编号】A61K9/127GK103957889SQ201280049046
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2012年10月1日 优先权日:2011年10月6日
【发明者】A.克西斯扎尔, C.克洛伊施, B.霍夫曼, R.默克尔 申请人:于利奇研究中心有限公司