促进抗原消除的抗原结合分子的制作方法

促进抗原消除的抗原结合分子的制作方法
【专利摘要】本发明人创作了抗原结合分子，所述抗原结合分子含有：在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fcγ受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fc区的Fcγ受体结合活性相比高的Fcγ受体结合结构域。
【专利说明】促进抗原消除的抗原结合分子
【技术领域】
[0001]本发明提供:使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、使每一分子可结合的抗原数目增加的抗原结合分子、使药代动力学得到改善的抗原结合分子、使在细胞外结合的抗原在细胞内的解离得到促进的抗原结合分子、使在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放得到促进的抗原结合分子、具有使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的功能的抗原结合分子，含有该抗原结合分子的药物组合物，以及它们的制备方法。
【背景技术】
[0002]抗体在血浆中的稳定性高、副作用也少，因而作为医药品受到关注。其中，IgG型的抗体药物有大量上市，现在也正在开发着数量众多的抗体药物(非专利文献I和非专利文献2)。另一方面，作为能适用于第二代抗体药物的技术，开发有各种技术，报道了使效应子功能、抗原结合能力、药代动力学、稳定性提高的技术或者使免疫原性风险降低的技术等(非专利文献3)。通常，抗体药物的给药量非常高，因而作为课题可考虑到难以制作皮下给药制剂，制备成本高等。作为降低抗体药物的给药量的方法，可考虑改善抗体的药代动力学的方法和使抗体与抗原的亲和性提高的方法。
[0003]作为改善抗体的药代动力学的方法，报道有恒定区的人工氨基酸取代(非专利文献4和5)。作为增强抗原结合能力、抗原中和能力的技术，报道有亲和性成熟技术(非专利文献6)，通过对可变区的CDR区等的氨基酸导入突变可以增强对抗原的结合活性。通过增强抗原结合能力，可以使体外的生物活性提高，或者降低给药量，进而也可以使体内(机体内)的药效提高(非专利文献7)。
[0004]另一方面，每一分子抗体能够中和的抗原量依赖于亲和性，可以通过增强亲和性来以少的抗体量中和抗原，可以通过各种方法增强抗体的亲和性(非专利文献6)。进而，只要可共价地与抗原结合，使亲和性无限大，则可以用一分子的抗体来中和一分子的抗原(二价的情形为二抗原)。但是，迄今为止的方法中，限制是一分子抗体对一分子抗原(二价的情形是二抗原)的化学计量的中和反应，不可能用抗原量以下的抗体量来完全中和抗原。即，在增强亲和性的效果方面存在限制(非专利文献9)。中和抗体的情形中，为了使其中和效果持续一定期间，需要给予机体内在该期间产生的抗原量以上的抗体量，仅通过上述的抗体药代动力学改善或者亲和性成熟技术，在降低必要抗体给药量方面存在限制。因此，为了用抗原量以下的抗体量来使抗原的中和效果持续目标期间，需要用一个抗体来中和多个抗原。作为实现其的新方法，最近报道了 PH依赖性地与抗原结合的抗体(专利文献I)。在血浆中的中性条件下与抗原强结合、在内体内的酸性条件下从抗原解离的PH依赖性抗原结合抗体可以在内体内从抗原解离。PH依赖性抗原结合抗体在将抗原解离后，若抗体被FcRn再循环到血浆中，则可以再次与抗原结合，因而可以用一个pH依赖性抗原结合抗体重复与多个抗原结合。
[0005]此外，与结合至FcRn而被再循环的抗体相比，抗原的血浆中滞留性非常短。这种血浆中滞留性长的抗体与其抗原结合时，抗体抗原复合体的血浆中滞留性变得与抗体同样地长。因此，抗原通过与抗体结合，不仅血浆中滞留性变长，而且血浆中抗原浓度上升。
[0006]如此，pH依赖性抗原结合抗体可以用I个抗体与多个抗原结合，与通常的抗体相t匕，能促进抗原从血浆中的消除，因此具有通常的抗体所无法实现的作用。然而，迄今为止尚未报道有该PH依赖性抗原结合抗体的可以重复与抗原结合的效果以及使促进抗原从血浆中消除的效果进一步提高的抗体工程技术。
[0007]IgG抗体通过与FcRn结合而具有长的血衆中滞留性。IgG和FcRn的结合仅在酸性条件下(PH6.0)被观察到，而在中性条件下(pH7.4)基本观察不到其结合。IgG抗体被非特异性地摄入细胞，但通过在内体内的酸性条件下与内体内的FcRn结合而返回到细胞表面上，在血浆中的中性条件下从FcRn解离。向IgG的Fe区导入突变而使其丧失在pH酸性条件下与FcRn的结合时，变得无法从内体内再循环到血浆中，因而抗体的血浆中滞留性显著受损。作为改善IgG抗体的血浆中滞留性的方法，报道有提高pH酸性范围条件下对FcRn的结合的方法。通过向IgG抗体的Fe区导入氨基酸取代，使pH酸性范围条件下对FcRn的结合提高，从内体内再循环到血浆中的效率提高，结果血浆中滞留性改善。
[0008]作为IgG类抗体的效应子功能的抗体依赖性细胞毒活性(以下表示为ADCC)、补体依赖性细胞毒活性(以下表示为CDC)的研究，迄今为止进行了许多，在人IgG类之中，报道了 IgGl亚类的抗体具有最高的ADCC活性、⑶C活性(非专利文献13)。此外，作为由IgG类抗体介导的靶细胞的吞噬作用的抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)也作为抗体的效应子功能之一而被暗示(非专利文献14、非专利文献15)。IgGl亚类的抗体可能对肿瘤发挥这些效应子功能，因此使 用IgGl亚类的抗体作为针对癌抗原的大部分的抗体药物。
[0009]为了使IgG抗体介导ADCC、ADCP活性，有必要使IgG抗体的Fe区与存在于杀伤细胞、自然杀伤细胞、活化的巨噬细胞等效应细胞表面上的抗体受体(以下表示为Fe Y受体或Fe YR)相结合。作为人的Fe Y受体的蛋白家族，报道有Fe YRIa、Fc YRIIa、Fc YRIIb、FcyRIIIa.FcyRIIIb的同种型，也报道有各自的同种异型(非专利文献16)。
[0010]增强ADCC和ADCP等细胞毒性的效应子功能，作为有望用于增强抗癌抗体的抗肿瘤效果的手段而被关注。以抗体的抗肿瘤效果为目的的由Fcy受体介导的效应子功能的重要性有使用小鼠模型的报道(非专利文献17、非专利文献18)。此外，在对人的临床效果与Fe Y RIIIa的高亲和性多态性(V158)和低亲和性多态性(F158)之间观察到了相关性(非专利文献19)。根据这些报道，暗示了:具有优化了与特定Fe Y受体的结合的Fe区的抗体介导更强的效应子功能，由此发挥有效的抗肿瘤效果。抗体对含有Fe YRIa、Fc YRIIa、Fe y RIIIa、Fc Y RIIIb的活化受体、含有Fe y RIIb的抑制受体各自的亲和性的平衡在优化抗体的效应子功能方面是重要的因素。通过增强对活化受体的亲和性，可以对抗体赋予介导更强的效应子功能的性质(非专利文献20)，因此作为使针对抗癌抗原的抗体药物的抗肿瘤活性增强或提高的抗体工程方法，迄今为止有各种的报道。
[0011]已显示:关于Fe区与Fe Y受体的结合，抗体的铰链区以及CH2结构域内的数个氨基酸残基以及与CH2结构域结合的EU编号297位的Asn上所附加的糖链是重要的(非专利文献13、非专利文献21、非专利文献22)。围绕该结合位置,迄今为止研究了各种具有Fe Y受体结合特性的Fe区的突变体，得到了对活化Fe Y受体具有更高亲和性的Fe区突变体(专利文献2、专利文献3)。例如，Lazar等人通过将人IgGl的以EU编号表示的239位的Ser,330位的Ala、332位的Ile分别取代成Asp、Leu、Glu，成功地使人IgGl对人Fe y RIIIa(V158)的结合增加到约370倍(非专利文献23、专利文献3)。该改变体与天然型相比，对Fe YRIIIa和Fe YRIIb的结合之比(A/Ι比)达到约9倍。此外，Shinkawa等人通过使以EU编号表示的297位的Asn所附加的糖链的岩藻糖缺失而成功地使对Fe Y RIIIa的结合增加到约100倍(非专利文献24)。通过这些方法，与天然型人IgGl比较，可以使人IgGl的ADCC活性大幅度提高。
[0012]如此，在以膜型抗原为靶标的抗体中，Fe Y受体结合活性在细胞毒活性中发挥重要的作用，因此，在细胞毒活性必要的情形下，使用Fe Y R结合活性高的人IgGl的同种型，并且通过增强Fe Y受体结合活性而使细胞毒活性增强的技术为广泛使用的技术。另一方面，在以可溶型抗原为靶标的抗体中，Fcy受体结合活性所发挥的作用仍属未知，可以认为:Fc Y受体结合活性高的人IgGl和Fe Y R结合活性低的人IgG2或人IgG4，在效果方面没有差异。因此，迄今为止在以可溶型抗原为靶标的抗体中，就增强Fcy受体结合活性方面没有进行尝试，而且没有关于该效果的报道。
[0013]现有技术文献
[0014]专利文献
[0015]专利文献1:TO2009/125825 ；
[0016]专利文献2:W02000/042072 ；
[0017]专利文献3:W02006/019447 ；
[0018]非专利 文献
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【发明内容】

[0043]发明所要解决的技术问题
[0044]本发明基于上述状况而完成，其目的在于提供:使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子、使每一分子可结合的抗原数目增加的抗原结合分子、使药代动力学得到改善的抗原结合分子、使在细胞外结合的抗原在细胞内的解离得到促进的抗原结合分子、使在不与抗原结合的状态下向细胞外的释放得到促进的抗原结合分子、具有使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的功能的抗原结合分子，含有该抗原结合分子的药物组合物，以及它们的制备方法。
[0045]用于解决技术问题的手段
[0046] 本发明人为了实现上述目的进行了深入的研究，创作了含有以下组分的抗原结合分子:pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合结构域相比高的Fe Y受体结合结构域。此外，本发明人发现了促进结合的抗原向细胞内摄入的方法、使每一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法、改善抗原结合分子的药代动力学的方法、促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法、在不与抗原结合的状态下促进向细胞外释放的方法和使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法，这些方法包括使上述的抗原结合分子与表达Fe Y受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤。此外，本发明人在发现具有上述性质的抗原结合分子的制备方法的同时，还发现含有这样的抗原结合分子或者通过本发明的制备方法制备的抗原结合分子作为有效成分的药物组合物的有用性，从而完成了本发明。
[0047]SP，更具体而言，本发明提供以下的[I]~[46]。
[0048][I]含有抗原结合分子的药物组合物，其中，该抗原结合分子含有:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域。
[0049][2] [I]所述的药物组合物，其中，上述抗原为可溶型抗原。
[0050][3] [I]或[2]所述的药物组合物，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
[0051][4] [3]所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0052][5] [I]或[2]所述的药物组合物，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
[0053][6] [5]所述的药物组合物，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在PH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0054][7] [I]~[6]中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[0055][8] [I]~[7]中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fe Y受体结合结构域含有抗体的Fe区。
[0056][9] [8]所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
[0057][10] [9]所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0058]221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
[0059]222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0060]223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0061]224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0062]225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0063]227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；[0064]228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0065]230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0066]231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0067]232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0068]233 位的氛基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0069]234 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0070]235 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0071]236 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0072]237 位的氨基 酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0073]238 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0074]239 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0075]240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0076]241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
[0077]243 位的氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0078]244位的氨基酸为His ；
[0079]245位的氨基酸为Ala ；
[0080]246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0081]247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0082]249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0083]250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0084]251位的氨基酸为Phe ；
[0085]254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0086]255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0087]256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0088]258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0089]260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0090]262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0091]263位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
[0092]264 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser λ Thr λ Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0093]265 位的氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；[0094]266位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0095]267 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0096]268 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；
[0097]269 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0098]270 位的氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
[0099]271 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0100]272 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0101]273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0102]274 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0103]275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0104]276 位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0105]278 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0106]279位的氨基酸为Ala ；
[0107]280 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0108]281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0109]282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0110]283 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0111]284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；
[0112]285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一个；
[0113]286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0114]288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0115]290 位的氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个； [0116]291 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0117]292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；
[0118]293 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0119]294 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0120]295 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；[0121]296 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0122]297 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0123]298 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0124]299 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； [0125]300 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser λ Thr λ Val 或 Trp 中的任一个；
[0126]301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0127]302位的氨基酸为Ile ；
[0128]303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0129]304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0130]305位的氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0131]311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；
[0132]313位的氨基酸为Phe ；
[0133]315位的氨基酸为Leu ；
[0134]317位的氨基酸为Glu或Gln ；
[0135]318 位的氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0136]320 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0137]322 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0138]323位的氨基酸为Ile ；
[0139]324 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0140]325 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0141]326 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0142]327 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0143]328 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0144]329 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0145]330 位的氨基酸为 CyS、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；[0146]331 位的氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0147]332 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0148]333 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser、Thr> Val或Tyr中的任一个；
[0149]334 位的氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0150]335 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0151]336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0152]337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0153]339 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0154]376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0155]377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0156]378位的氨基酸为Asp ；
[0157]379位的氨基酸为Asn ；
[0158]380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0159]382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0160]385位的氨基酸为Glu ;
[0161]392位的氨基酸为Thr ；
[0162]396位的氨基酸为Leu ；
[0163]421位的氨基酸为Lys ；
[0164]427位的氨基酸为Asn ；
[0165]428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0166]429位的氨基酸为Met ；
[0167]434位的氨基酸为Trp ；
[0168]436位的氨基酸为Ile ;和
[0169]440位的氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0170][11] [I]~[10]中任一项所述的药物组合物，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
[0171][12] [I]~[11]中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fe Y受体为Fe Y RIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0172][13] [I]~[11]中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fe Y受体为Fe Y RIIb0
[0173] [14] [8]~[13]中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0174]238位的氨基酸为Asp，或[0175]328位的氨基酸为Glu。
[0176][15]以下⑴~(Vi)的任一项的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达Fe Y受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤，该抗原结合分子含有:在PH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域，
[0177](i)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；
[0178](ii)使血浆中的抗原消除的方法；
[0179](iii)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；
[0180](iv)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法；
[0181](V)促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法；或
[0182](vi)使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法。
[0183][16] [15]所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
[0184][17] [15]或 [16]所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
[0185][18] [17]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0186][19] [15]或[16]所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
[0187][20] [19]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在PH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0188][21] [15]~[20]中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[0189][22] [15]~[21]中任一项所述的方法，其中，上述Fe Y受体结合结构域含有抗体的Fe区。
[0190][23] [22]所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、
222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、
236位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、
250位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、
267位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、
280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、
294位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位和440位。
[0191][24] [23]所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0192]221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；[0193]222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0194]223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0195]224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0196]225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0197]227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0198]228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0199]230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0200]231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0201]232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0202]233 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0203]234 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0204]235 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0205]236 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0206]237 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0207]238 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0208]239 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0209]240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0210]241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
[0211]243 位的氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0212]244位的氨基酸为Hi s ；
[0213]245位的氨基酸为Ala;
[0214]246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0215]247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0216]249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0217]250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0218]251位的氨基酸为Phe ；
[0219]254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0220]255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0221]256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0222]258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0223]260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0224]262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；[0225]263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0226]264 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0227]265 位的氛基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0228]266位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0229]267 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0230]268 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；
[0231]269 位的氨基 酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0232]270 位的氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
[0233]271 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0234]272 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0235]273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0236]274 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0237]275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0238]276 位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0239]278 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0240]279位的氨基酸为Ala ；
[0241]280 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0242]281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0243]282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0244]283 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0245]284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；
[0246]285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一个；
[0247]286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0248]288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0249]290 位的氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0250]291 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0251 ] 292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；
[0252]293 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0253]294 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0254]295 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0255]296 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0256]297 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0257]298 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0258]299 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0259]300 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一个；
[0260]301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0261]302位的氨基酸为Ile ；
[0262]303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0263]304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0264]305位的氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0265]311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；
[0266]313位的氨基酸为Phe ；
[0267]315位的氨基酸为Leu ；
[0268]317位的氨基酸为Glu或Gln ；
[0269]318 位的氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0270]320 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0271]322 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0272]323位的氨基酸为Ile ；
[0273]324 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0274]325 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0275]326 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0276]327 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0277]328 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0278]329 位的氨基酸为 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0279]330 位的氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0280]331 位的氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0281]332 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0282]333 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一个；
[0283]334 位的氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0284]335 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0285]336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0286]337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0287]339 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0288]376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0289]377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0290]378位的氨基酸为Asp ；
[0291]379位的氨基酸为Asn ；
[0292]380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0293]382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0294]385位的氨基酸为Glu ；
[0295]392位的氨基酸为Thr ；
[0296]396位的氨基酸为Leu ；
[0297]421位的氨基酸为Lys ；
[0298]427位的氨基酸为Asn ；
[0299]428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0300]429位的氨基酸为Met ；
[0301 ] 434位的氨基酸为Trp ； [0302]436位的氨基酸为Ile ;和
[0303]440位的氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0304][25] [15]~[24]中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
[0305][26] [15]~[25]中任一项所述的方法，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。[0306][27] [15]~[25]中任一项所述的方法，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIIb。
[0307][28] [22]~[27]中任一项所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0308]238位的氨基酸为Asp，或
[0309]328位的氨基酸为Glu。
[0310][29]以下⑴~(vii)的任一项所述的方法，该方法包括:使抗原结合分子中的Fe Y受体结合结构域在pH中性范围条件下的Fe Y受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区在pH中性范围条件下的Fe Y受体结合活性增强的步骤，所述抗原结合分子含有在PH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域以及Fe Y受体结合结构域，
[0311](i)使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法；
[0312](ii)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法；
[0313](iii)使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增大的方法；
[0314](iv)改善抗原结合分子的药代动力学的方法；
[0315](V)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法;
[0316](vi)促进在与抗原结合的状态下摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外释放的方法；或
[0317](vii)可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法。
[0318][30] [29]所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
[0319][31] [29]或[30]所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
[0320][32] [31]所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0321][33] [29]或[30]所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
[0322][34] [33]所述的方法，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在PH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
[0323][35] [29]~[34]中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
[0324][36] [29]~[35]中任一项所述的方法，其中，上述Fe Y受体结合结构域含有抗体的Fe区。
[0325][37] [36]所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中以下的任一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222位、
223位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、
237位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、
251位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、
268位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、
281位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、
295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436位和440位。
[0326][38] [33]所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0327]221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个；
[0328]222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0329]223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0330]224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0331]225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0332]227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0333]228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0334]230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0335]231位的氨基酸为 Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0336]232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0337]233 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0338]234 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0339]235 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0340]236 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0341]237 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0342]238 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0343]239 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0344]240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0345]241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
[0346]243 位的氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0347]244位的氨基酸为His ；
[0348]245位的氨基酸为Ala;
[0349]246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0350]247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0351]249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0352]250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0353]251位的氨基酸为Phe ；[0354]254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0355]255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0356]256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0357]258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0358]260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中 的任一个；
[0359]262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0360]263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0361]264 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0362]265 位的氛基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0363]266位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0364]267 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0365]268 位的氛基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；
[0366]269 位的氛基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0367]270 位的氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
[0368]271 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0369]272 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0370]273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0371]274 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0372]275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0373]276 位的氨基酸为、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0374]278 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0375]279位的氨基酸为Ala ；
[0376]280 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0377]281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0378]282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0379]283 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0380]284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；
[0381]285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一个；[0382]286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0383]288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0384]290 位的氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0385]291 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0386]292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；
[0387]293 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Thr> Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0388]294 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Th;r、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0389]295 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Th;r、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0390]296 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0391]297 位的氨基酸为 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0392]298 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Met、Asn、Gln、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0393]299 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0394]300 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val 或 Trp 中的任一个；
[0395]301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0396]302位的氨基酸为Ile ；
[0397]303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0398]304位的氨基酸为Asp、HiS、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0399]305位的氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0400]311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；
[0401]313位的氨基酸为Phe ；
[0402]315位的氨基酸为Leu ；
[0403]317位的氨基酸为Glu或Gln ;
[0404]318 位的氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0405]320 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser> Thr> Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0406]322 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0407]323位的氨基酸为Ile ;
[0408]324 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr> Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0409]325 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0410]326 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0411]327 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0412]328 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0413]329 位的氨基酸为 Asp>Glu>Phe>Gly>His> Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0414]330 位的氨基 酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0415]331 位的氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0416]332 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0417]333 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一个；
[0418]334 位的氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0419]335 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0420]336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0421]337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0422]339 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0423]376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0424]377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0425]378位的氨基酸为Asp ；
[0426]379位的氨基酸为Asn ；
[0427]380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0428]382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0429]385位的氨基酸为Glu ；
[0430]392位的氨基酸为Thr ；
[0431 ] 396位的氨基酸为Leu ；
[0432]421位的氨基酸为Lys ；
[0433]427位的氨基酸为Asn ；
[0434]428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0435]429位的氨基酸为Met ；
[0436]434位的氨基酸为Trp ；
[0437]436位的氨基酸为Ile ;和[0438]440位的氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0439][39] [29]~[38]中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
[0440][40] [29]~[39]中任一项所述的方法，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0441][41] [29]~[39]中任一项所述的方法，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIIb。
[0442][42] [36]~[41]中任一项所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0443]238位的氨基酸为Asp，或
[0444]328位的氨基酸为Glu。
[0445][43]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤:
[0446](a)获得在高钙离子浓度条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；
[0447](b)获得在低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；
[0448](c)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤；
[0449](d)使编码在(C)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fe Y受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域；
[0450](e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及
[0451](f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
[0452][44]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤:
[0453](a)获得在高钙离子浓度条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；
[0454](b)获得在低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤；
[0455](C)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤；
[0456](d)使编码在(C)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fe Y受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域；
[0457](e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及
[0458](f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
[0459][45]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤:
[0460] (a)获得在pH中性范围条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤；
[0461](b)获得在pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤；
[0462](c)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤；
[0463](d)使编码在(C)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fe Y受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域；
[0464](e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及
[0465](f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
[0466][46]抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a)~(f)的步骤:
[0467](a)获得在pH中性范围条件下抗体对抗原的结合活性的步骤；
[0468](b)获得在pH酸性范围条件下抗体对抗原的抗原结合活性的步骤；
[0469](c)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤；
[0470](d)使编码在(C)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码Fe Y受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域；
[0471](e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及
[0472](f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
[0473][47] [43]~[46]中任一项所述的制备方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
[0474][48] [43]~[47]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fe Y受体结合结构域含有抗体的Fe区。
[0475][49] [48]所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
[0476][50] [49]所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0477]221位的氨基酸 为Lys或Tyr中的任一个；
[0478]222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；[0479]223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；
[0480]224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；
[0481]225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个；
[0482]227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0483]228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0484]230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个；
[0485]231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0486]232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
[0487]233 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； [0488]234 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0489]235 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0490]236 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0491]237 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0492]238 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0493]239 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0494]240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
[0495]241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个；
[0496]243 位的氨基酸为 Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0497]244位的氨基酸为His ；
[0498]245位的氨基酸为Ala;
[0499]246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0500]247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0501]249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个；
[0502]250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个；
[0503]251位的氨基酸为Phe ；
[0504]254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个；
[0505]255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个；
[0506]256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个；
[0507]258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个；
[0508]260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0509]262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个；
[0510]263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；[0511]264 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0512]265 位的氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0513]266位的氨基酸为Ala、Ile、Met或Thr中的任一个；
[0514]267 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0515]268 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val或Trp中的任一个；
[0516]269 位的氛基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0517]270 位的氨基酸为 Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Trp或Tyr中的任一个；
[0518]271 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0519]272 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0520]273位的氨基酸为Phe或Ile中的任一个；
[0521]274 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0522]275位的氨基酸为Leu或Trp中的任一个；
[0523]276 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0524]278 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val或Trp中的任一个；
[0525]279位的氨基酸为Ala ；
[0526]280 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、Lys、Leu、Pro、Gin、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0527]281位的氨基酸为Asp、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0528]282位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个；
[0529]283 位的氨基酸为 Ala、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Arg 或 Tyr 中的任一个；
[0530]284位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Asn、Thr或Tyr中的任一个；
[0531]285位的氨基酸为Asp、Glu、Lys、Gin、Trp或Tyr中的任一个；
[0532]286位的氨基酸为Glu、Gly、Pro或Tyr中的任一个；
[0533]288位的氨基酸为Asn、Asp、Glu或Tyr中的任一个；
[0534]290 位的氨基酸为 Asp、Gly、His、Leu、Asn、Ser、Thr、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0535]291 位的氨基酸为 Asp、Glu、Gly、His、lie、Gln 或 Thr 中的任一个；
[0536]292位的氨基酸为Ala、Asp、Glu、Pro、Thr或Tyr中的任一个；
[0537]293 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；[0538]294 位的氨基酸为 Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0539]295 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0540]296 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr或Val中的任一个；
[0541]297 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0542]298 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0543]299 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0544]300 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Serλ Thr、Val 或 Trp 中的任一个；
[0545]301位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个；
[0546]302位的氨基酸为Ile ；
[0547]303位的氨基酸为Asp、Gly或Tyr中的任一个；
[0548]304位的氨基酸为Asp、His、Leu、Asn或Thr中的任一个；
[0549]305位的氨基酸为Glu、lie、Thr或Tyr中的任一个；
[0550]311位的氨基酸为Ala、Asp、Asn、Thr、Val或Tyr中的任一个；
[0551]313位的氨基酸为Phe ；
[0552]315位的氨基酸为Leu ；
[0553]317位的氨基酸为Glu或Gln ；
[0554]318 位的氨基酸为 His、Leu、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个；
[0555]320 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Asn、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0556]322 位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Pro、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0557]323位的氨基酸为Ile ；
[0558]324 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Arg、Thr、Val、Trp 或Tyr中的任一个；
[0559]325 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Serλ Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0560]326 位的氛基酸为 Ala、Asp、Glu、Gly、lie、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0561]327 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0562]328 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Serλ Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；[0563]329 位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0564]330 位的氨基酸为 Cys、Glu、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Arg、Ser、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0565]331 位的氨基酸为 Asp、Phe、His、lie、Leu、Met、Gin、Arg、Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0566]332 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser> Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；
[0567]333 位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Pro、Ser> Thr> Val或Tyr中的任一个；
[0568]334 位的氨基酸为 Ala、Glu、Phe、lie、Leu、Pro 或 Thr 中的任一个；
[0569]335 位的氛基酸为 Asp、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Asn、Pro> Arg> Ser> Val、Trp或Tyr中的任一个；
[0570]336位的氨基酸为Glu、Lys或Tyr中的任一个；
[0571]337位的氨基酸为Glu、His或Asn中的任一个；
[0572]339 位的氨基酸为 Asp、Phe、Gly、lie、Lys、Met、Asn、Gin、Arg、Ser 或 Thr 中的任一个；
[0573]376位的氨基酸为Ala或Val中的任一个；
[0574]377位的氨基酸为Gly或Lys中的任一个；
[0575]378位的氨基酸为Asp ；
[0576]379位的氨基酸为Asn ；
[0577]380位的氨基酸为Ala、Asn或Ser中的任一个；
[0578]382位的氨基酸为Ala或Ile中的任一个；
[0579]385位的氨基酸为Glu ；
[0580]392位的氨基酸为Thr ；
[0581 ] 396位的氨基酸为Leu ；
[0582]421位的氨基酸为Lys ；
[0583]427位的氨基酸为Asn ；
[0584]428位的氨基酸为Phe或Leu中的任一个；
[0585]429位的氨基酸为Met ；
[0586]434位的氨基酸为Trp ；
[0587]436位的氨基酸为Ile ；以及
[0588]440位的氨基酸为Gly、His、lie、Leu或Tyr中的任一个。
[0589][51] [43]~[50]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fe Y受体结合结构域是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
[0590][52] [43]~[51]中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fe Y受体为Fe Y RIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
[0591][53] [43]~[51]中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIIb。[0592][54] [48]~[53]中任一项所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区:
[0593]238位的氨基酸为Asp，或
[0594]328位的氨基酸为Glu。
【专利附图】

【附图说明】
[0595][图1]是表示与现有的中和抗体相比，通过给予增强了中性pH下的Fcy受体结合的的离子浓度依赖性地与抗原结合的抗体，可溶型抗原从血浆中消除的非限定的作用机制的图。
[0596][图2]是显示将H54/L28_IgGl或pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4_IgGl给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0597][图3]是显示将pH依赖性地与人IL-6受体结合的Fv4_IgGl、没有小鼠FeY R结合的Fv4-1gGl的改变体即Fv4-1gGl-F760、增强了小鼠Fe Y R结合的Fv4_IgGl的改变体即Fv4-1gGl-F1022或Fv4_IgGl的低岩藻糖型抗体即Fv4-1gGl_Fuc给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0598][图4] 是显示将含有 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1022 和 Fv4-1gGl_F1022 的改变体即提高了 PH酸性范围的FcRn结合的Fv4-1gGl-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0599][图5]是显示将含有 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1022 和 Fv4-1gGl_F1022 的改变体即提高了 PH酸性范围的FcRn结合的Fv4-1gGl-F1093作为重链的抗原结合分子给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0600][图6]是显示将Fv4_IgGl、增强了小鼠FeY R结合的(特别是对小鼠Fe Y RIIb,小鼠Fe Y RIII的结合得到增强)Fv4-1gGl的改变体即Fv4-1gGl_F1087和增强了小鼠FcyR结合的(特别是对小鼠Fe Y R1、小鼠Fe y RIV的结合得到增强)Fv4_IgGl的改变体即Fv4-1gGl-F1182给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0601][图7]是显示将Fv4-1gGl、Fv4-1gGl_F1087和提高了pH酸性范围的FcRn结合的 Fv4-1gGl-F1087 的改变体即 Fv4_IgGl_Fl 180、Fv4-1gGl_F1412 给予人 FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0602][图8]是显示将Fv4_IgGl、Fv4-1gGl_F1182和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-1gGl-F1182的改变体即Fv4_IgGl_F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中给予的抗原结合分子的浓度变化的图。
[0603][图9]是显示将Fv4_IgGl、Fv4-1gGl_F1087和提高了pH酸性范围的FcRn结合的 Fv4-1gGl-F1087 的改变体即 Fv4_IgGl_Fl 180、Fv4-1gGl_F1412 给予人 FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0604][图10]是显示将Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1182和提高了pH酸性范围的FcRn结合的Fv4-1gGl-F1182的改变体即Fv4_IgGl_F1181给予人FcRn转基因小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0605][图 11]是显示将 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782 或 Fv4-1gGl_F1087 给予人 FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中的Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782或Fv4-1gGl_F1087的浓度变化结果的图。
[0606][图 12]是显示将 Fv4-1gGl、Fv4-1gGl-F1782 或 Fv4-1gGl_F1087 给予人 FcRn 转基因小鼠时的该小鼠血浆中的可溶型人IL-6受体浓度变化结果的图。
[0607][图13]是显示将Fv4_mIgGl、对小鼠FeY RllbjjHllFcYRIII的结合增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF44和对小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的结合进一步增强了的Fv4-ml gG I的改变体即Fv4-ml gG 1-mF46给予正常小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0608][图14]是显示将Fv4_mIgGl、对小鼠FeY RllbjjHllFcYRIII的结合增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF44和对小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF46给予Fe y RIII缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0609][图15]是显示将 Fv4_mIgGl JtjHllFcYRllbdHllFcYRIII 的结合增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF44和对小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF46给予Fe受体\链缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0610][图16]是显示将？￥41^61、对小鼠？(^1?1113、小鼠？(^1?111的结合增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF44和对小鼠Fe y Rllb、小鼠Fe y RIII的结合进一步增强了的Fv4-mIgGl的改变体即Fv4-mIgGl_mF46给予Fe y RIIb缺失小鼠时的该小鼠血浆中的人IL-6受体浓度变化的图。
[0611][图17]是显示使用具有FeY RIIa多态性(R/Η)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。
[0612][图18]是显示使用具有FeY RIIa多态性(H/H)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。
[0613][图19]是表示评价洗涤血小板的膜表面的⑶62p表达的结果的图。用黑色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者显示与免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。
[0614][图20]是表示评价洗涤血小板的膜表面的活性型整联蛋白表达的结果的图。用黑色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，图形的中央未涂覆者显示与免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果的图。
[0615][图21]是显示使用具有FeY RIIa多态性(R/Η)的来自供体的血小板的血小板聚集测定中奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体和奥马珠单抗_BP230/IgE免疫复合体的血小板聚集能力的评价结果的图。
[0616][图22]是表示评价洗涤血小板的膜表面的CD62p表达的结果的图。用灰色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，实线显示与奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体、虚线显示与奥马珠单抗_BP230/IgE免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果。
[0617][图23]是表示评价洗涤血小板的膜表面的活性型整联蛋白表达的结果的图。用灰色涂覆的图形显示与PBS反应后加入ADP进行刺激时的结果的图，实线显示与奥马珠单抗-Gld-v3/IgE免疫复合体、虚线显示与奥马珠单抗_BP230/IgE免疫复合体反应后用ADP进行刺激时的结果。
[0618][图24]横轴表示各H)变体对FeY RIIb的相对结合活性的值，纵轴表示各H)变体对Fe Y RIIa R型的相对结合活性的值。将各H)变体对各Fe Y R的结合量的值除以作为对照的导入改变前的抗体IL6R-F652/IL6R-L(IL6R-F652是SEQ ID NO: 142规定的含有以EU编号表示的238位的Pro取代成Asp的改变Fe的抗体重链)对各Fe Y R的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各H)变体对各Fe Y R的相对结合活性的值。图中的F652点图显示IL6R-F652/IL6R-L的值。
[0619][图25]纵轴显示将各改变导入不具有P238D改变的GpH7_B3(SEQ ID NO: 159)/GpL16-kO (SEQ ID NO: 160)中而得的改变体对Fe Y RIIb的相对结合活性的值，横轴显示将各改变导入具有P238D改变的IL6R-F652 (SEQ ID NO: 142)/IL6R-L中而得的改变体对FcyRIIb的相对结合活性的值。应予说明，将各改变体对Fe Y RIIb的结合量的值除以导入改变前的抗体对Fe Y RIIb的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为相对结合活性的值。这里，导入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形、导入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形均发挥对Fe y RIIb的结合增强效果的改变含有在区A中；在导入到不具有P238D的GpH7-B3/GpL16-kO中的情形发挥对Fe y RIIb的结合增强效果，但在导入到具有P238D的IL6R-F652/IL6R-L中的情形不发挥对Fe y RIIb的结合增强效果的改变含有在区B中。
[0620][图26]表示Fc(P238D)/FcYRIIb胞外区复合体的晶体结构。
[0621][图27]表示相对于FeY RIIb胞外区以及Fe CH2结构域A，通过基于C α原子间距的最小二乘法，使Fe (P238D) /Fe y RIIb胞外区复合体的晶体结构与Fe (WT) /Fe Y RIIb胞外区复合体的模型结构叠合的图。
[0622][图28]表示对于Fe(P238D) /Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构与Fe (WT) /Fe Y RIIb胞外区复合体的模型结构，以Fe CH2结构域A以及Fe CH2结构域B各自单独通过基于Ca原子间距的最小二乘法进行叠合，并对P238D附近的详细结构进行比较的图。
[0623][图29]是示出在Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中，在Fe CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Gly的主链和Fe y RIIb的160位的Tyr之间观察到氢键的图。
[0624][图30]是示出在Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中，在Fe CH2结构域B的以EU编号表示的270位的Asp和Fe y RIIb的131位的Arg之间观察到静电相互作用的图。
[0625][图31]横轴表示各2Β变体对FeY RIIb的相对结合活性的值、纵轴表示各2Β变体对Fe Y RIIa R型的相对结合活性的值。将各2Β变体对各Fe Y R的结合量的值除以作为对照的导入改变前的抗体(以EU编号表示的238位的Ρι.ο取代成Asp的改变Fe)对各FcyR的结合量的值，进而乘以100倍，将所得的值作为各2Β变体对各Fe Y R的相对结合活性的值。
[0626][图32]是表示Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中Fe链A的以EU编号表示的233位的Glu与Fe Y RIIb胞外区的其周边残基的图。
[0627] [图33]是表示Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的晶体结构中Fe链A的以EU编号表示的330位的Ala与Fe Y RIIb胞外区的其周边残基的图。
[0628][图34]是示出相对于Fe链B，通过基于Ca原子间距的最小二乘法，使Fe (P238D) /Fe y RI Ib胞外区复合体和Fe (WT) /FcyRIIIa胞外区复合体的晶体结构叠合，Fe链B的以EU编号表示的271位的Pro的结构的图。
[0629][图35]是通过X射线晶体结构分析确定的Fe(P208) /Fe Y RIIb胞外区复合体的图。就Fe部分的CH2结构域、CH3结构域各自而言，位于左侧者为结构域A，位于右侧者为结构域B。
[0630][图36]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FeY RIIb胞外区复合体的结构与Fc(WT)/Fe YRIIa胞外区复合体的结构(PDB码:3RY6)，在Fe部分CH2结构域A中，通过基于Ca原子间距的最小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。图中，用粗线描画的部分为Fe (P208)/FcyRIIb胞外区复合体的结构，用细线描画的部分为Fe (WT)/FcyRIIa胞外区复合体的结构。应予说明，在Fe (WT) /FcyRIIa胞外区复合体的结构中，仅描画了 Fe部分的CH2结构域A。
[0631][图37]是显示在Fc(P208)/FeYRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与Fe Y RIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp附近的详细结构的图。
[0632][图38]是显示在Fc(P208)/FeYRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，与Fe Y RIIb的160位的Tyr在主链部分形成氢键的Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp侧链周围的氨基酸残基的结构的图。
[0633][图39]是实施例10中显示的、将Fe(P238D)/Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构和Fe (P208) /Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构在Fe部分CH2结构域B中通过基于Ca原子间距的最小二乘法进行叠合，对于以EU编号表示的266位~271位的环周边进行比较的图。本环中，Fc(P208)与Fc(P238D)比较，以EU编号表示的268位具有H268D改变，以EU编号表示的271位具有P271G改变。
[0634][图40]是在Fc(P208)/FcYRIIb胞外区复合体的X射线晶体结构中，将Fe部分CH2结构域B的Ser239周边的结构与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo_Fc系数的电子密度一起显示的图。
[0635][图41]是将通过X射线晶体结构分析确定的Fc(P208)/FeYRIIaR胞外区复合体的立体结构与Fc(P208)/Fc YRIIb胞外区复合体的立体结构，通过基于C α原子间距的最小二乘法进行叠合，并进行了比较的图。
[0636][图42]是将Fe(Ρ208)/Fe Y RIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fe (Ρ208)/Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fe部分CH2结构域A的以EU编号表示的237位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo-Fc系数的电子密度一起进行比较的图。
[0637][图43]是将Fe(Ρ208)/Fe Y RIIaR胞外区复合体的X射线晶体结构和Fe (Ρ208)/Fe Y RIIb胞外区复合体的X射线晶体结构，在Fe部分CH2结构域B的以EU编号表示的237位的Asp附近，与通过X射线晶体结构分析而得到的作为2Fo-Fc系数的电子密度一起进行比较的图。
[0638][图44]是将Gld和G4d的恒定区序列进行比较的图。图中，用粗框围起来的氨基酸显示在Gld和G4d中为不同的氨基酸残基的位点。
[0639][图45]是显示在正常小鼠中的GA2_IgGl和GA2-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。
[0640][图46]是显示给予了GA2-1gGl和GA2-F1087的正常小鼠中的血浆中hlgA浓度变化的图。
[0641][图47]是显示在C57BL/6J小鼠中的278-1gGl和278-F1087的血浆中抗体浓度变化的图。
[0642][图48]是显示给予了278-1gGl和278-F1087的C57BL/6J小鼠中的血浆中hIgE(Asp6)浓度变化的图。
[0643][图49]是表示通过X射线晶体结构分析而确定的6RL#9抗体的Fab片段的重链CDR3的结构的图。(i)显示在钙离子存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3。(ii)显示在钙离子不存在的结晶条件下得到的晶体结构的重链CDR3。
[0644][图50]是显示给予了H54/L28-1gGl抗体、FH4_IgGl抗体和6RL#9_IgGl抗体的正常小鼠的血浆中的 各抗体浓度变化的图。
[0645][图51]是显示给予了H54/L28-1gGl抗体、FH4_IgGl抗体和6RL#9_IgGl抗体的正常小鼠的血浆中的可溶型人IL-6受体(hsIL-6R)的浓度变化的图。
[0646][图52]是显示含有人Vk5_2序列的抗体和含有人Vk5_2序列中的糖链附加序列被改变的hVk5-2_L65序列的抗体的离子交换层析图的图。实线表示含有人Vk5-2序列的抗体(重链:CM_H、SEQ ID N0:67，和轻链:hVk5-2、SEQ ID NO:4)的层析图，虚线表示具有hVk5-2_L65 序列的抗体(重链:CM_H(SEQ ID NO: 67)、轻链:hVk5_2_L65 (SEQ ID NO:70))的层析图。
[0647][图53A]是含有LfVkl_Ca序列的抗体(重链:GC_H、SEQID NO: 51，和轻链:LfVkl_Ca、SEQ ID NO:83)和含有LfVkl_Ca序列中的Asp⑶残基改变为Ala(A)残基的序列的抗体在5°C保存后(实线)或50°C保存后(虚线)的离子交换层析图。是将分别在5°C保存后的离子交换层析图的最高峰作为主峰并用主峰进行y轴标准化的图。是显示含有LfVkl_Ca(SEQ ID NO:83)作为轻链的抗体的层析图的图。
[0648][图53B]是显示含有LfVkl_Cal(SEQ ID NO:85)作为轻链的抗体的层析图的图。
[0649][图53C]是显示含有LfVkl_Ca2(SEQ ID NO:86)作为轻链的抗体的层析图的图。
[0650][图53D]是显示含有LfVkl_Ca3(SEQ ID NO:87)作为轻链的抗体的层析图的图。[0651 ][图54A]是含有LfVkl_Ca序列的抗体(重链:GC_H、SEQ ID NO: 51，和轻链:LfVkl_Ca、SEQ ID NO: 83)和含有 LfVkl_Ca 序列中的 30 位(Kabat 编号)的 Asp (D)残基改变为 Ser(S)残基的 LfVkl_Ca6 序列(重链:GC_H、SEQ ID NO:51，和轻链:LfVkl_Ca6、SEQID NO:88)的抗体在5°C保存后(实线)或50°C保存后(虚线)的离子交换层析图。是将分别在5°C保存后的离子交换层析图的最高峰作为主峰并用主峰进行y轴标准化的图。是显示含有LfVkl_Ca(SEQ ID NO:83)作为轻链的抗体的层析图的图。
[0652][图54B]是显示含有LfVkl_Ca6(SEQ ID NO:88)作为轻链的抗体的层析图的图。
[0653][图55]是显示从导入了Ca依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌中分离的290克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表不以Kabat编号表不的氨基酸的位点。纵轴表不氨基酸分布比例。
[0654] [图56]是表示在高钙离子浓度条件(1.2mM)下的抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RClIgG_010抗体、6RClIgG_012抗体和6RClIgG_019抗体的传感图的图。横轴显示时间，
纵轴显示RU值。
[0655][图57]是表示在低钙离子浓度条件(3μΜ)下的抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RClIgG_010抗体、6RClIgG_012抗体和6RClIgG_019抗体的传感图的图。横轴显示时间，
纵轴显示RU值。
[0656][图58]是显示从导入了pH依赖性地与抗原结合的抗体基因文库的大肠杆菌中分离的132克隆的序列信息的氨基酸分布(表示为Library)与设计的氨基酸分布(表示为Design)的关系的图。横轴表不以Kabat编号表不的氨基酸的位点。纵轴表不氨基酸分布比例。
[0657][图59]是表示抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03
抗体在pH7.4的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。
[0658][图60]是表示抗IL-6R抗体(托珠单抗)、6RpH#01抗体、6RpH#02抗体和6RpH#03抗体在pH6.0的传感图的图。横轴显示时间，纵轴显示RU值。
[0659][图61A]是表示对于天然型Fe和改变Fe、从15或30个独立的风湿病患者中分离的血清的ECL反应的图表的图。图表分别表示对天然型Fc(图61A)Fv4-YTE(图61B)、Fv4-F1166( = YTE+Q438R/S440E)(图 61C)、Fv4_F1167( = YTE+S424N)(图 61D)、Fv4-LS(图 61E)、Fv4-F1170( = LS+Q438R/S440E)(图 61F)、Fv4_F1171( = LS+S424N)(图61G)、Fv4-N434H(图 61H)、Fv4_F1172( = N434H+Q438R/S440E)(图 611)、Fv4_F1173(=N434H+S424N)(图61J)的ECL反应的图表。
[0660][图61B]是图61A的续图。
[0661][图61C]是图61B的续图。
[0662][图61D]是图61C的续图。
[0663][图61E]是图61D的续图。
[0664][图61F]是图61E的续图。
[0665][图61G]是图61F的续图。
[0666][图61H]是图61G的续图。
[0667][图611]是图61H的续图。
[0668][图61J]是图611的续图。
[0669][图62A]是表示对于改变Fe、从30个独立的风湿病患者中分离的血清的ECL反应的图表的图。图表分别表示对Fv4-LS(图62A)、Fv4_F1380(图62B)、Fv4_F1384(图62C)、Fv4-F1385(图 62D)、Fv4_F1386(图 62E)、Fv4_F1388(图 62F)和 Fv4_F1389(图 62G)的ECL反应的图表。
[0670][图62B]是图62A的续图。
[0671][图62C]是图62B的续图。
[0672][图62D]是图62C的续图。
[0673][图62E]是图62D的续图。
[0674][图62F]是图62E的续图。[0675][图62G]是图62F的续图。
【具体实施方式】
[0676]提供以下的定义和详细说明来使本说明书中说明的本发明容易理解。
[0677]氨基酸
[0678]本说明书中，例如，如Ala/A、Leu/L、Arg/R、Lys/K、Asn/N、Met/M、Asp/D、Phe/F、Cys/C、Pro/P、Gln/Q、Ser/S、Glu/E、Thr/T、Gly/G、Trp/ff, His/H、Tyr/Y、Ile/1、Val/V 所表示，将氨基酸以单字母密码或三字母密码或者这两者标记。 [0679]氨基酸的改变
[0680]为了改变抗原结合分子的氨基酸序列中的氨基酸，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel 等人(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重叠延伸 PCR 等公知的方法。通过这些公知的方法可适宜进行氨基酸的添加、缺失和/或取代。取代氨基酸残基是指以通过取代成其它氨基酸残基例如就以下(a)~(C)的方面进行改变为目的:
[0681](a)折叠结构或螺旋结构的区域中的多肽的主链结构；
[0682](b)靶位点中的电荷或疏水性；或
[0683](C)侧链的大小。
[0684]氨基酸残基根据其结构所含的侧链的特性被分类为以下的组:
[0685](I)疏水性:正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie ；
[0686](2)中性亲水性:Cys、Ser、Thr、Asn、Gln ;
[0687](3)酸性:Asp、Glu ;
[0688](4)碱性:His> Lys> Arg ；
[0689](5)影响链取向的残基:Gly、Pro ;以及
[0690](6)芳族性:Trp、Tyr、Phe。
[0691]这些的在各组内的氨基酸残基的取代称为保守取代，而在不同组之间的氨基酸残基的取代称为非保守取代。本发明中的取代可以是保守取代，也可以是非保守取代，还可以是保守保守取代与非保守取代的组合。此外，作为取代成天然氨基酸以外的氨基酸的氨基酸改变方法，也可采用多种公知的方法(Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.(2006) 35，225-249、Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.(2003) 100 (11)，6353-6357)。还可适宜使用例如:含有作为终止密码子之一的UAG密码子(琥珀密码子)的互补琥珀抑制基因tRNA上连接有非天然氨基酸而成的tRNA的无细胞翻译系统(Clover Direct (ProteinExpress))等。
[0692]此外，作为表示氨基酸改变的表述，可适宜采用:在表示特定位置的数字的前后使用改变前和改变后的氨基酸的单字母密码的表述。例如，在抗体恒定区所含的Fe区中加入氨基酸取代时，所使用的P238D的改变表示以EU编号表示的238位的Pio取代成Asp。即，数字表示以EU编号表示的氨基酸的位置，其之前记载的氨基酸的单字母密码表示取代前的氨基酸，其之后记载的氨基酸的单字母密码表示取代后的氨基酸。
[0693]和/ 或
[0694]本说明书中，“和/或”用语的含义是指熟语“和/或”的前后用语的组合，含有“和”与“或”适宜组合的所有组合。具体而言，例如，“326位、328位和/或428位的氨基酸被取代”包括以下的氨基酸的改变的变异:
[0695](a) 326 位，(b) 328 位，(c) 428 位，(d) 326 位和 328 位，(e) 326 位和 428 位，(f) 328位和428位，(g) 326位、328位和428位。
[0696]
[0697]本说明书中，“抗原”只要含有抗原结合结构域所结合的表位，则其结构并不限于特定的结构。换而言之，抗原可以是无机物也可以是有机物，优选以本发明的抗原结合分子可结合的状态存在于机体的体液中的可溶型抗原。作为抗原，可例示如下所述的分子:17-1A、4-lBB、4Dc、6-酮 _PGFla、8_ 异 _PGF2a、8_ 氧代 _dG、Al 腺苷受体、A33、ACE、ACE-2、激活素、激活素A、激活素AB、激活素B、激活素C、激活素RIA、激活素RIA ALK-2、激活素RIBALK-4、激活素 RIIA、激活素 RIIB、ADAM、ADAMlO, ADAMl2, ADAMl5, ADAM17/TACE、ADAM8、ADAM9、ADAMTS、ADAMTS4、ADAMTS5、地址素(Addressins)、aFGF、ALCAM、ALK、ALK-1、ALK-7、α -1-抗胰蛋白酶、a -V/ β -1 拮抗剂、ANG、Ang、APAF-l、APE、APJ、APP、APRIL、AR、ARC、ART、Artemin、抗 IcUASPARTIC、心房钠尿因子、av/b3 整联蛋白、Axl、b2M、B7-l、B7-2、B7_H、B-淋巴细胞刺激因子(BlyS)、BACE, BACE-UBad, BAFF, BAFF-R、Bag-UBAK, Bax、BCA-U BCAM,Bcl、BCMA、BDNF、b-ECGF、bFGF、BID、Bik、BM、BLC、BL-CAM、BLK、BMP、BMP-2、BMP_2a、BMP-3、成骨蛋白(Osteogenin)、BMP-4、BMP-2b、BMP-5、BMP-6、Vgr-l、BMP_7 (0P-1)、BMP_8 (BMP_8a、OP-2)、BMPR、BMPR-1A (ALK-3)、BMPR-1B (ALK-6)、BRK-2、RPK-U BMPR-1I (BRK-3)、BMP、b-NGF、BOK、蛙皮素、骨衍生神经营养因子、BPDE, BPDE-DNA, BTC、补体因子3 (C3)、C3a、C4、C5、C5a、CIO、CA 125、CAD-8、降钙素、cAMP、癌胚抗原(CEA)、癌相关抗原、组织蛋白酶A、组织蛋白酶B、组织蛋白酶C/DPP1、组织蛋白酶D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶H、组织蛋白酶L、组织蛋白酶O、组织蛋白酶S、组织蛋白酶V、组织蛋白酶X/Z/P、CBL、CC1、CCK2、CCL、CCLl、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL2、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/10、CCR、CCRl、CCR10、CCR10、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、CCR8、CCR9、CDl、CD2、CD3、CD3E、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CDlla, CDllb, CDllc, CD13、CD14、CD15、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27L、CD28、CD29、CD30、CD30L、CD32、CD33 (p67 蛋白)、CD34、CD38、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD46、CD49a、CD52、CD54、CD55、CD56、CD61、CD64、CD66e、CD74、CD80 (B7-1)、CD89、CD95、CD123、CD137、CD138、CD140a、CD146、CD147、CD148、CD152、CD164、CEACAM5、CFTR、cGMP、CINC、肉毒杆菌毒素、产气荚膜梭菌(ClostridiumPerfringens)毒素、CKb8-1、CLC、CMV、CMVUL、CNTF、CNTN-1、COX、C-Ret, CRG-2、CT-1、CTACK、CTGF, CTLA-4、CX3CL1、CX3CR1、CXCL, CXCLl、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCLl0, CXCLlU CXCL12、CXCLl3, CXCL14、CXCLl5, CXCL16、CXCR, CXCRUCXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、细胞角蛋白肿瘤相关抗原、DAN、DCC、DcR3、DC-SIGN、补体抑制因子(衰变促进因子)、脱(l-3)-1GF-1 (脑IGF-1)、Dhh、地高辛、DNAM-U Dnase,Dpp、DPPIV/CD26、Dtk、ECAD、EDA、EDA-Al、EDA-A2、EDAR、EGF,EGFR(ErbB-1)、EMA,EMMPRIN、ENA、内皮素受体、脑啡肽酶、eNOS、Eot、Eotaxinl、EpCAM、Ephrin B2/EphB4、EP0、ERCC、E_ 选择素、ET-1、因子Ila、因子VI1、因子VIIIc、因子IX、成纤维细胞活化蛋白(FAP)、Fas、FcRl、FEN-l、铁蛋白、FGF、FGF-19、FGF-2、FGF3、FGF-8、FGFR、FGFR-3、纤维蛋白、FL、FLIP、Flt-3、Fl t-4、促卵胞激素、CXXXC 趋化因子、FZD1、FZD2、FZD3、FZD4、FZD5、FZD6、FZD7、FZD8、FZD9、FZD10、G250、Gas6、GCP-2、GCSF、GD2、GD3、GDF, GDF-U GDF-3 (Vgr-2)、GDF-5 (BMP-14,CDMP-1)、⑶F-6 (BMP-13、CDMP-2)、⑶F_7 (BMP-12、CDMP-3)、⑶F_8 (Myostatin,肌肉生长抑制素)、⑶F-9、⑶F-15(MIC-1)、⑶NF、⑶NF、GFAP、GFRa-1、GFR-a 1、GFR-a 2、GFR-a 3、GITR、胰高血糖素、Glut4、糖蛋白 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、GM-CSF、gpl30、gp72、GR0、生长激素释放因子、半抗原(NP-cap或NIP-cap)、HB-EGF、HCC、HCMVgB包膜糖蛋白、HCMV gH包膜糖蛋白、HCMV UL、造血生长因子(HGF), Hep B gpl20、乙酰肝素酶、Her2、Her2/neu (ErbB-2)、Her3 (ErbB-3)、Her4 (ErbB-4)、单纯疱疹病毒(HSV) gB糖蛋白、HSVgD糖蛋白、HGFA,高分子量黑色素瘤相关抗原(High molecular weight melanoma-associated antigen)(HMW-MAA) ,HIV gpl20、HIV IIIB gpl20V3 环、HLA、HLA_DR、HM1.24、HMFG PEM、HRG、Hrk、人心肌球蛋白、人巨细胞病毒(HCMV)、人生长激素(HGH)、HVEM、1-309、IAP、ICAM、ICAM-UI CAM-3, ICE、I COS、IFNg、Ig、IgA 受体、IgE、IGF、IGF 结合蛋白、IGF-1R、IGFBP、IGF-1,IGF-1I, IL、IL-1、IL-1R、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-5R、IL-6, IL-6R、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-18、IL-18R、IL-23、干扰素(INF) - a、INF- β、INF- y、抑制素、iNOS、胰岛素A链、胰岛素B链、胰岛素样生长因子1、整联蛋白a 2、整联蛋白a 3、整联蛋白a4、整联蛋白α4 /β1、整联蛋白α4/β7、整联蛋白a5(aV)、整联蛋白α5/β1、整联蛋白a 5/β 3、整联蛋白a 6、整联蛋白β 1、整联蛋白β 2、干扰素Y、IP-10、1-TAC、JE、激肽释放酶2、激肽释放酶5、激肽释放酶6、激肽释放酶11、激肽释放酶12、激肽释放酶14、激肽释放酶15、激肽释放酶L1、激肽释放酶L2、激肽释放酶L3、激肽释放酶L4、KC、KDR、角质形成细胞生长因子(KGF)、层连蛋白5、LAMP、LAP、LAP(TGF-1)、潜伏型TGF-1、潜伏型TGF-lbpULBP, LDGF, LECT2、Lefty、Lewis-Y 抗原、Lewis-Y 相关抗原、LFA-1、LFA-3、Lfo,LIF、LIGHT、脂蛋白、LIX、LKN、Lptn, L-选择素、LT_a、LT_b、LTB4、LTBP-1、肺表面、促黄体激素、淋巴毒素 β 受体、Mac-UMAdCAM, MAG、MAP2、MARC、MCAM、MCAM、MCK-2、MCP, M-CSF,MDC、Mer、金属蛋白酶、MGDF 受体、MGMT、MHC(HLA-DR)、MIF、MIG、MIP、MIP_1_ a、MK、MMAC1、MMP、MMP-1、MMP-10、MMP-11、MMP-12、MMP-13、MMP-14、MMP-15、MMP-2、MMP-24、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MPIF、Mpo、MSK、MSP、粘蛋白(Mucl)、MUC18、缪勒管抑制物质、Mug、MuSK、NAIP、NAP、NCAD、N-C粘附因子、NCA90、NCAM、NCAM、脑啡肽酶、神经营养素_3、神经营养素-4或神经营养素 _6、Neurturin、神经生长因子(NGF)、NGFR、NGF_P、nN0S、N0、N0S、Npn、NRG_3、NT、NTN、OB、OGG1、OPG, OPN、OSM、0X40L、0X40R、pl50、p95、PADPr,甲状旁腺激素、PARC、PARP,PBR、PBSF, PCAD, P-钙黏蛋白、PCNA, PDGF, PDGF, PDK-U PECAM, PEM、PF4、PGE, PGF, PGI2、PGJ2、PIN、PLA2、胎盘碱性磷酸酶(PLAP)、P1GF、PLP、PP14、胰岛素原、松弛素原、蛋白C、PS、PSA、PSCA、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、PTEN、PTHrp, Ptk, PTN、R51、RANK、RANKL, RANTES,RANTES、松弛素A链、松弛素B链、肾素、呼吸道合胞体病毒(RSV) F、RSV Fgp、Ret、类风湿因子、RLIP76、RPA2、RSK、S100、SCF/KL、SDF-U SERINE、血清白蛋白、sFRP-3、Shh、SIGIRR、SK-U SLAM、SLPI, SMAC, SMDF, SMOH、SOD、SPARC、Stat、STEAP、STEAP-1I, TACE, TACI,TAG-72 (肿瘤相关糖蛋白-72)、TARC, TCA-3、T细胞受体(例如，T细胞受体α / β )、TdT、TECK, TEMU TEM5、TEM7、TEM8、TERT、睾丸 PLAP 样碱性磷酸酶、TfR, TGF、TGF- α、TGF- β、TGF-β 泛特异性(TGF-β Pan Specific)、TGF-β RI (ALK-5)、TGF-β RH、TGF-β Rllb、TGF- β RII1、TGF- β 1、TGF- β 2、TGF- β 3、TGF- β 4、TGF- β 5、凝血酶、胸腺 Ck-1、促甲状腺激素、116、11]\^、1'10、组织因子、丁]\^卩卩2、1'115)0、丁]\^1?52、丁,、丁,-0、TNF-α β、TNF_3 2、TNFc, TNF-R1、TNF-RI1、TNFRSF10A (TRAIL RlApo-2、DR4)、TNFRSFIOB (TRAIL R2DR5、KILLER、TRICK-2A、TRICK-B)、TNFRSFIOC(TRAIL R3DcRl、LIT、TRID)、TNFRSFIOD (TRAILR4DcR2、TRUNDD)、TNFRSF11A(RANK ODF R、TRANCE R)、TNFRSF1 IB (OPG OCIF、TRl)、TNFRSF12 (TWEAK R FN14)、TNFRSF13B (TACI)、TNFRSF13C (BAFF R)、TNFRSF14 (HVEM ATAR、HveA、LIGHT R、TR2)、TNFRSF16 (NGFR p75NTR)、TNFRSF17 (BCMA)、TNFRSF18 (GITR AITR)、TNFRSF19 (TROY TAJ、TRADE)、TNFRSF19L (RELT)、TNFRSFIA (TNF RI CD120a、p55_60)、TNFRSF1B(TNF RII CD120b、p75_80)、TNFRSF26 (TNFRH3)、TNFRSF3 (LTbR TNF RII1、TNFCR)、TNFRSF4 (0X40ACT35、TXGPIR)、TNFRSF5 (CD40p50)、TNFRSF6 (Fas Apo-U APTl、CD95)、TNFRSF6B(DcR3M68、TR6)、TNFRSF7 (CD27)、TNFRSF8 (CD30)、TNFRSF9 (4-1BB CD137、ILA)、TNFRSF21(DR6)、TNFRSF22(DcTRAIL R2TNFRH2)、TNFRST23(DcTRAIL R1TNFRH1)、TNFRSF25(DR3Apo-3、LARD、TR-3、TRAMP、WSL-1)、TNFSF10 (TRAIL Apo-2 配体、TL2)、TNFSF11 (TRANCE/RANK 配体 ODF 、OPG 配体)、TNFSF12 (TWEAK Apo-3 配体、DR3 配体)、TNFSF13 (APRIL TALL2)、TNFSF13B (BAFF BLYS, TALLl、THANK、TNFSF20)、TNFSF14 (LIGHTHVEM 配体、LTg)、TNFSF15(TL1A/VEGI)、TNFSF18 (GITR 配体 AITR 配体、TL6)、TNFSF1A (TNF_a黏附素(Conectin)、DIF、TNFSF2)、TNFSFlB(TNF-b LTa、TNFSFl)、TNFSF3 (LTb TNFC、p33)、TNFSF4 (0X40 配体 gp34、TXGPI)、TNFSF5 (CD40 配体 CD154、gp39、HIGMU IMD3, TRAP)、TNFSF6 (Fas 配体 Apo-1 配体、APTl 配体)、TNFSF7 (CD27 配体 CD70)、TNFSF8 (CD30 配体CD153)、TNFSF9 (4-1BB 配体 CD 137 配体)、TP-U t_PA、Tpo、TRAIL、TRAILR、TRAIL-Rl、TRAIL-R2、TRANCE、运铁蛋白受体、TRF、Trk、TROP-2、TSG、TSLP、肿瘤相关抗原 CA125、肿瘤相关抗原表达病毒Y相关碳水化物、TWEAK、TXB2、Ung、uPAR、uPAR-1、尿激酶、VCAM、VCAM-1、VECAD, VE-钙黏蛋白、VE-钙黏蛋白-2、VEFGR-1 (flt-1)、VEGF, VEGFR、VEGFR-3 (flt-4)、VEGI, VM、病毒抗原、VLA、VLA-U VLA-4、VNR整联蛋白、冯维勒布兰德因子、WIF-U WNT1、WNT2、WNT2B/13、WNT3、WNT3A、WNT4、WNT5A、WNT5B、WNT6、WNT7A、WNT7B、WNT8A、WNT8B、WNT9A、WNT9A、WNT9B、WNT10A、WNT10B、WNTl1、WNT16、XCLl、XCL2、XCRl、XCRl、XEDAR、XIAP, XPD、HMGBl、IgA、A β、CD81、CD97、CD98、DDRl、DKKl、EREG、Hsp90、IL-17/IL-17R、IL-20/IL-20R、氧化LDL、PCSK9、激肽释放酶原、RON、TMEM16F、S0D1、嗜铬粒蛋白A、嗜铬粒蛋白B、tau、VAP1、高分子激肽原、IL-31、IL-31R、Navl.1、Navl.2、Navl.3、Navl.4、Navl.5、Navl.6、Navl.7、Navl.8、Navl.9、EPCR、CUClq, Clr, Cls、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、因子B、因子D、因子H、备解素、壳硬蛋白(sclerostin)、血纤蛋白原、血纤蛋白、凝血酶原、凝血酶、组织因子、因子V、因子Va、因子VI1、因子Vila、因子VII1、因子Villa、因子IX、因子IXa、因子X、因子Xa、因子X1、因子XIa、因子XI1、因子Xlla、因子XII1、因子XIIIa、TFP1、抗凝血酶II1、EPCR、血栓调节蛋白、TAP1、tPA、纤溶酶原、纤溶酶、PA1-1、PA1-2、GPC3、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖_2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、LPA、S1P、乙酰胆碱受体、AdipoRU AdipoR2、ADP核糖基环化酶-1、α -4/β-7整联蛋白、α-5/β-1整联蛋白、α-ν/β-6整联蛋白、α / β I整联蛋白、血管形成素配体-2、Angptl2、炭疽、钙粘蛋白、碳酸酐酶-1X、CD105、CD155、CD158a、CD37、CD49b、CD51、CD70、CD72、Claudinl8、艰难梭菌毒素、CSU δ -样蛋白配体 4、DHICA 氧化酶、Dickkopf-1配体、二肽基肽酶IV、EPOR、RSV的F蛋白、因子Ia、FasL、叶酸受体α、胰高血糖素受体、胰高血糖素样肽I受体、谷氨酸羧肽酶I1、GMCSFR、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、铁调素(Hepcidin)、IL-17受体、IL-22受体、IL-23受体、IL-3受体、Kit酪氨酸激酶、富亮氨酸a_2糖蛋白I (LRGl)、 溶鞘脂受体、膜糖蛋白0X2、间皮素(Mesothelin)、MET、MICA、MUC-16、髓鞘相关糖蛋白、神经毡蛋白-1、神经毡蛋白-2、Nogo受体、PLXNA1、PLXNA2、PLXNA3、PLXNA4A、PLXNA4B、PLXNBU PLXNB2、PLXNB3、PLXNCU PLXNDl、编程性细胞死亡配体1、前蛋白转化酶PC9、P-选择素糖蛋白配体-1、RAGE、Reticulon4、RF、RON-8, SEMA3A、SEMA3B、SEMA3C、SEMA3D、SEMA3E、SEMA3F、SEMA3G、SEMA4A、SEMA4B、SEMA4C、SEMA4D、SEMA4F、SEMA4G、SEMA5A、SEMA5B、SEMA6A、SEMA6B、SEMA6C、SEMA6D、SEMA7A、志贺样毒素 I1、1-磷酸鞘氨醇受体-1、ST2、葡萄球菌脂膜酸、生腱蛋白、TG2、胸腺基质淋巴细胞生成素(Thymic stromallymphoprotein)受体、TNF超家族受体12A、跨膜糖蛋白NMB、TREM-U TREM-2、滋养层糖蛋白、TSH受体、TTR、微管蛋白、ULBP2以及用于激素和生长因子的受体中在机体的体液中不锚定在细胞上而以可溶型存在的分子。在受体中，例如，在细胞表面表达的受体等由于包括蛋白酶的消化等在内的任何机制而存在于机体的体液中的可溶型抗原也适宜作为本发明的可溶型抗原。作为这样的分子的实例，可例示本说明书中记载的可溶型IL-6R分子(J.1mmunol.(1994) 152, 4958-4968)或 CD20, CD52 (Br.J.Haematol.(2003) 123(5),850-857)等。此外，不仅在机体内固有表达的分子，而且利用病毒等的感染性生物或在这些生物上提呈的抗原、或者属于朊蛋白等感染性分子存在于机体的体液中的可溶型抗原也可作为本发明的可溶型抗原例示。作为体液，可适宜举出:血液、血浆、血清、尿、淋巴液、唾液、泪液等的体液等。
[0698]mfr
[0699]表示存在于抗原中的抗原决定簇的表位，意指本说明书中公开的抗原结合分子中的抗原结合结构域所结合的抗原上的位点。所以，例如表位可通过其结构来定义。此外，也可以通过相对于识别该表位的抗原结合分子中的抗原结合活性来定义该表位。抗原为肽或者多肽时，还可以通过构成表位的氨基酸残基来规定表位。此外，表位为糖链时，也可以通过特定的糖链结构来规定表位。
[0700]线性表位是下述表位，其含有氨基酸一级序列被识别的表位。线性表位在固有序列中典型地含有至少3个氨基酸，和最普通地含有至少5个、例如约8至约10个、6至20个
氨基酸。
[0701]与线性表位相对地，立体结构表位是这样的表位，其中，含有表位的氨基酸的一级序列并非是被识别表位的单一规定成分(例如，氨基酸的一级序列不需要被规定表位的抗体所识别的表位)。立体结构表位相对于线性表位可以含有增大数目的氨基酸。关于立体结构表位的识别，抗体识别肽或蛋白质的三维结构。例如，蛋白质分子折叠形成三维结构时，形成立体结构表位的某氨基酸和/或多肽主链变得并排，使得抗体可以识别表位。确定表位的立体结构的方法包括例如:X射线晶体学、二维核磁共振分光学以及位点特异性旋转标记和电子顺磁共振分光学，但并非限定于此。例如，参照Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology (1996)、第 66 卷、Morris (编)。
[0702]结合活性
[0703]下述例示了通过含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法，但通过含有针对IL-6R以外的抗原的抗原结合结构域的被测抗原结合分子来确认对表位的结合的方法也可以基于下述例示而适宜实施。[0704]例如，含有针对IL-6R抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别存在于IL-6R分子中的线性表位，可通过如下所示操作来确认。为了上述目的，合成了含有构成IL-6R的胞外结构域的氨基酸序列的线性肽。该肽可化学地合成。或者，可以利用IL-6R的cDNA中编码相当于胞外结构域的氨基酸序列的区域，通过基因工程技术得到。其次，对含有构成胞外结构域的氨基酸序列的线性肽和含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合活性进行评价。例如，通过以固定化线性肽作为抗原的ELISA，可以评价该抗原结合分子对该肽的结合活性。或者，基于该抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合中的、线性肽造成的抑制水平，也可以明确对线性肽的结合活性。通过这些试验，可以明确该抗原结合分子对线性肽的结合活性。
[0705]此外，含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子识别立体结构表位，这可如下进行确认。为了上述目的，制备了表达IL-6R的细胞。可举出:含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子在与IL-6R表达细胞接触时强烈地与该细胞结合，但该抗原结合分子与经固定化的含有构成IL-6R胞外结构域的氨基酸序列的线性肽实质上不结合的情形等。这里，实质上不结合是指，对人IL-6R表达细胞的结合活性的80 %以下、通常50%以下、优选30%以下、特别优选15%以下的结合活性。
[0706]作为测定对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性的方法，可举出例如:Antibodies A Laboratory Manual记载的方法(Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) 359-420) ? 即，可通过以IL-6R表达细胞为抗 原的ELISA或FACS (荧光活化细胞分选(fluorescence activatedcell sorting))的原理来进行评价。
[0707]在ELISA形式中，对含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的IL-6R表达细胞的结合活性，通过比较由酶反应生成的信号水平而定量地进行评价。即，将被测抗原结合分子添加至固定有IL-6R表达细胞的ELISA板，利用识别被测抗原结合分子的酶标记抗体检测与细胞结合的被测抗原结合分子。或者在FACS中，制作被测抗原结合分子的稀释系列，确定相对于IL-6R表达细胞的抗体结合效价(titer),由此可以比较被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合活性。
[0708]被测抗原结合分子与悬浮于缓冲液等中的细胞表面上表达的抗原的结合可以通过流式细胞仪检测。作为流式细胞仪，已知例如如下的装置:
[0709]FACSCantoTM II
[0710]FACSAriaTM
[0711]FACSArrayTM
[0712]FACSVantageTM SE
[0713]FACSCaliburTM(均为 BD Biosciences 公司的商品名)
[0714]EPICS ALTRA HyPerSort
[0715]Cytomics FC500
[0716]EPICS XL-MCL ADC EPICS XL ADC
[0717]Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC(均为 Beckman Coulter 公司的商品名)。
[0718]例如，作为含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的抗原结合活性的优选测定方法的一例，可举出以下方法。首先，将表达IL-6R的细胞与被测抗原结合分子反应，将其用识别被测抗原结合分子的经FITC标记的二次抗体染色。将被测抗原结合分子用适宜的优选缓冲液稀释，由此将该抗原结合分子制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10 μ g/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。接着,通过FACSCalibur (BD公司)测定荧光强度和细胞数。抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software (BD公司)进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，能够测定由被测抗原结合分子的结合量表示的被测抗原结合分子的结合活性。
[0719]含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子与某抗原结合分子共有表位，这可通过两者对相同表位的竞争来确认。抗原结合分子间的竞争通过交叉阻断试验等来检测。例如竞争ELISA试验是优选的交叉阻断试验。
[0720]具体而言，在交叉阻断试验中，包被微量滴定板的孔上的IL-6R蛋白在候选竞争抗原结合分子的存在下或不存在下经过预培养后，添加被测抗原结合分子。与孔中的IL-6R蛋白结合的被测抗原结合分子的量与竞争结合相同表位的候选竞争抗原结合分子的结合能力间接地相关。即，竞争抗原结合分子对相同表位的亲和性越大，则被测抗原结合分子对包被有IL-6R蛋白的孔的结合活性越降低。
[0721]经由IL-6R蛋白而与孔结合的被测抗原结合分子的量可以通过预先标记抗原结合分子来容易地测定。例如，经生物素标记的抗原结合分子通过使用亲和素过氧化酶结合物和合适的底物来测定。利用过氧化酶等酶标记的交叉阻断试验特别被称为竞争ELISA试验。抗原结合分子能够用可检测或可测定的其它标记物质进行标记。具体而言，公知的是放射标记或突光标记等。
[0722]与在候选竞争抗原结合分子的不存在下实施的对照试验中得到的结合活性进行比较，竞争抗原结合分子只要可以阻断至少20%、优选至少20~50%、进一步优选至少50%的含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子的结合，则该被测抗原结合分子是与竞争抗原结合分子实质上结合于相同表位或者竞争结合于相同的表位的抗原结合分子。
[0723]在鉴定含有针对IL-6R的抗原结合结构域的被测抗原结合分子所结合的表位的结构时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这可通过比较两者的抗原结合分子对在构成该表位的肽中导入氨基酸突变而得的肽的结合活性来进行评价。
[0724]作为这种测定结合活性的方法，例如，在前述ELISA形式中，可通过比较被测抗原结合分子和对照抗原结合分子对导入了突变的线性肽的结合活性来测定。作为ELISA以外的方法，通过使被测抗原结合分子与对照抗原结合分子流过该柱后，对洗脱液中洗脱的抗原结合分子进行定量，也可以测定对结合于柱的该突变肽的结合活性。使突变肽作为例如与GST的融合肽的形式而吸附于柱的方法是公知的。
[0725]此外，鉴定的表位为立体表位时，被测抗原结合分子与对照抗原结合分子共有表位，这可通过以下方法来评价。首先，制备表达IL-6R的细胞和表达在表位中导入了突变的IL-6R的细胞。将这些细胞悬浮于PBS等适当的缓冲液中，向所得细胞悬浮液中添加被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。其次，用合适的缓冲液洗涤，向所得细胞悬浮液中添加能够识别被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的经FITC标记的抗体。被标记抗体染色的细胞的荧光强度和细胞数通过FACSCalibur (BD公司)来测定。被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的浓度通过合适的缓冲液适当稀释，由此可以制备为所期望的浓度来使用。例如，能够以10 μ g/ml至10ng/ml之间的任意浓度使用。标记抗体对该细胞的结合量被反映为使用CELL QUEST Software (BD公司)进行分析而得的荧光强度即几何平均值。即，通过得到该几何平均值，可以测定由标记抗体的结合量表示的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子的结合活性。
[0726]本方法中，例如“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”可通过以下方法判断。首先，用标记抗体染色与表达突变IL-6R的细胞结合的被测抗原结合分子和对照抗原结合分子。接着，检测细胞的荧光强度。荧光检测中使用作为流式细胞仪的FACSCalibur时，所得的荧光强度可以使用CELL QUEST Software进行分析。由抗原结合分子存在下和不存在下的几何平均值，根据下述的计算式算出该比较值(AGeo-Mean)，由此可以求出抗原结合分子的结合所带来的荧光强度的增加比例。
[0727]Δ Geo-Mean = Geo-Mean (抗原结合分子存在下)/Geo-Mean (抗原结合分子不存在下)
[0728]将通过分析得到的、反映被测抗原结合分子对突变IL-6R表达细胞的结合量的几何平均比较值(突变IL-6R分子AGeo-Mean值)与反映被测抗原结合分子对IL-6R表达细胞的结合量的AGeo-Mean比较值进行比较。此时，计算相对于突变IL-6R表达细胞和IL-6R表达细胞的AGeo-Mean比较值时使用的被测抗原结合分子的浓度特别优选制备为相互相同或者 实质上相同的浓度。预先确定了识别IL-6R中的表位的抗原结合分子被用作对照抗原结合分子。
[0729]被测抗原结合分子相对于突变IL-6R表达细胞的AGeo-Mean比较值只要小于被测抗原结合分子相对于IL-6R表达细胞的AGeo-Mean比较值的至少80%、优选50%、进一步优选30%、特别优选15%，则认为“实质上不与突变IL-6R表达细胞结合”。求出Geo-Mean值(几何平均)的计算式记载于 CELL QUEST Software User’s Guide (BD biosciences 公司)。通过对比较值进行比较，只要是能够将其实质上视为相同的程度，则能够评价被测抗原结合分子与对照抗原结合分子的表位相同。
[0730]抗原结合结构域
[0731]本说明书中，“抗原结合结构域”只要与目标抗原结合，则可以使用任意结构的结构域。作为这类结构域的实例，可优选举出例如:抗体的重链和轻链的可变区、机体内存在的细胞膜蛋白Avimer中所含的35个氨基酸左右的被称为A结构域的组件(W02004/044011、W02005/040229)、含有与在细胞膜表达的糖蛋白纤连蛋白中的蛋白结合结构域10Fn3结构域的Adnectin(W02002/032925)、以构成蛋白A的含有58个氨基酸的3个螺旋束(bundle)的IgG结合结构域为支架的Affibody (W01995/001937)、具有含33个氨基酸残基的转角和2个反向平行螺旋以及环的亚基重复重叠而成的结构的锚蛋白重复序列(ankyrin repeat:AR)的分子表面露出的区域DARPins (DesignedAnkyrin Repeat proteins) (W02002/020565)、支持嗜中性粒细胞明胶酶结合脂质运载蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))等脂质运载蛋白分子中高度保守的8个反向平行链在中央方向扭曲的桶结构的单侧的4个环区即Anticalin等(W02003/029462)、作为七鳃鳗、八目鳗等无颚类的获得免疫系统且不具有免疫球蛋白结构的可变性淋巴细胞受体(variable lymphocyte receptor(VLR))的富亮氨酸残基的重复(leucine-rich-repeat (LRR))组件重复重叠而成的马蹄铁形的结构内部的平行型片结构的凹陷区域(W02008/016854)。作为本发明的抗原结合结构域的优选实例，可举出含有抗体的重链和轻链的可变区的抗原结合结构域。作为这种抗原结合结构域的实例，优选可举出“scFv (单链 Fv) ”、“单链抗体”、1￥”、“8。?￥2(单链？￥2) ”、“Fab” 或 “F(ab，)2” 等。
[0732]本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相同的表位结合。这里，相同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白质中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白质中。或者，本发明的抗原结合分子中的抗原结合结构域可以与相互不同的表位结合。这里，不同的表位可以存在于例如含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的蛋白质中。此外，可以存在于含有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的第20位至第365位氨基酸的蛋白质中。
[0733]特异件
[0734]特异性是指特异性地结合的分子的一方的分子对于其一个或多个结合对象分子以外的分子不显示任何显著性结合的状态。此外，也可以用于抗原结合结构域对某抗原中所含的多个表位中特定的表位为特异性的情形。此外，抗原结合结构域所结合的表位含有在多个不同的抗原中时，具有该抗原结合结构域的抗原结合分子可以与含有该表位的各种抗原结合。
[0735]杭体
[0736]本说明书中，抗体是指天然的免疫球蛋白或者通过部分或完全合成制备得到的免疫球蛋白。抗体可从天然存在其的血浆或血清等天然资源或产生抗体的杂交瘤细胞的培养上清中分离得到，或者通过使用基因重组等方法而部分或完全合成。作为抗体的实例，优选可举出:免疫球蛋白的同种型和这些同种型的亚类。作为人的免疫球蛋白，已知有IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl、IgA2、IgD、IgE、IgM这9种类型(同种型)。本发明的抗体中可含有这些同种型中的IgGl、IgG2、IgG3、IgG4。IgG的恒定区中也含有由此自然产生的突变体等。作为人IgGl、人IgG2、人IgG3、人IgG4抗体的恒定区，基因多态性所致的多个的同种异型序列记载于 Sequences of proteins of immunological interest, NIH PublicationN0.91-3242中，本发明可以是其中的任一个序列。特别是作为人IgGl的序列，EU编号356-358位的氨基酸序列可以是DEL也可以是EEM。
[0737]制备具有所期望结合活性的抗体的方法对本领域技术人员来说是公知的。以下例示与IL-6R结合的抗体(抗IL-6R抗体)的制作方法。与IL-6R以外的抗原结合的抗体也可以根据下述例示而适宜制作。
[0738]抗IL-6R抗体可以使用公知的方法以多克隆或单克隆抗体的形式获得。作为抗IL-6R抗体，可优选制作来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体含有:由杂交瘤产生的单克隆抗体和利用基因工程技术通过用含有抗体基因的表达载体转化的宿主细胞产生的单克隆抗体等。应予说明，本申请发明的单克隆抗体包括“人源化抗体”和“嵌合抗体”。
[0739]产生单克隆抗体的杂交瘤可以通过使用公知技术，例如如下所示的方法来制作。即，使用IL-6R蛋白作为敏化抗原，按照通常的免疫方法来免疫哺乳动物。通过通常的细胞融合法，将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合。其次，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞，由此可以选择出产生抗IL-6R抗体的杂交瘤。
[0740]具体而言，单克隆抗体的制作例如如下所示地进行。首先，表达其核苷酸序列公开在SEQ ID N0:2中的IL-6R基因，由此可得到由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，其用作敏化抗原用于抗体制备。即，将编码IL-6R的基因序列插入公知的表达载体，由此转化适当的宿主细胞。以公知的方法从该宿主细胞中或培养上清中纯化所期望的人IL-6R蛋白。为了从培养上清中获得可溶型的IL-6R，代替由SEQ ID NO:1表示的IL-6R蛋白，表达了例如，如 Mullberg 等(J.1mmunol.(1994) 152 (10), 4958-4968)所记载的可溶型 IL-6R、即 SEQID NO:1表示的IL-6R多肽序列中、含有第I位至357位氨基酸的蛋白。此外，纯化的天然IL-6R蛋白也可以同样地用作敏化抗原。
[0741]作为用于免疫哺乳动物的敏化抗原，可使用该纯化IL-6R蛋白。此外，IL-6R的部分肽也可以用作敏化抗原。此时，该部分肽也可以根据人IL-6R的氨基酸序列通过化学合成获得。此外，也可以通过将IL-6R基因的一部分整合至表达载体并进行表达来获得。进而，还可以使用蛋白质分解酶分解IL-6R蛋白来获得，用作部分肽的IL-6R肽的区域和大小并不特别限于特定的方案。对于优选的区域，可以从SEQ ID NO:1的氨基酸序列中相当于第20-357位氨基酸的氨基酸序列中选择任意的序列。构成作为敏化抗原的肽的氨基酸的数目优选为至少5个以上、例如6个以上、或7个以上。更具体而言，可以将8~50、优选10~30个残基的肽用作敏化抗原。
[0742]此外，也可以将IL-6R蛋白的所期望的部分多肽或肽与不同的多肽进行融合而得的融合蛋白用作敏化抗原。为了制备用作敏化抗原的融合蛋白，例如，可以优选利用抗体的Fe片段或肽标签等。表达融合蛋白的载体可如下制作:将编码所期望的两种或两种以上的多肽片段的基因框内融合，将该融合基因如前所述地插入表达载体。融合蛋白的制作方法记载于 Molecular Cloning2nd ed.(Sambrook, J et al., Molecular Cloning2nded., 9.47-9.58 (1989) Cold Spring Harbor Lab.press)。用作敏化抗原的 IL-6R 的获得方法和使用它的免疫方法也具体记载于W02003/000883、W02004/022754、W02006/006693等中。
[0743]作为用该敏化抗原免疫的哺乳动物，并不限定于特定的动物，优选考虑与细胞融合中使用的亲本细胞的相容性来选择。通常适宜使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或兔、猴等。
[0744]按照公知的方法将上述动物用敏化抗原免疫。例如，作为通常的方法，通过将敏化抗原注射给予至哺乳动物的腹腔内或皮下来实施免疫。具体而言，将用PBS(磷酸缓冲盐水(Phosphate-Buffered Saline))或生理盐水等以适当稀释倍率稀释的敏化抗原根据需要与通常的佐剂、例如弗氏完全佐剂混合，在乳化后将该敏化抗原对哺乳动物每4至21天给予数次。此外，敏化抗原免疫时可以使用适当的载体。特别是将分子量小的部分肽用作敏
化抗原时，有时期望将与白蛋白、匙孔蜮.血蓝蛋白等载体蛋白质结合的该敏化抗原肽进行免疫。
[0745]此外，产生所期望抗体的杂交瘤也可通过使用DNA免疫如下所示来制作。DNA免疫是指下述免疫方法:被给予了以能在免疫动物中表达编码抗原蛋白的基因的方式构建的载体DNA的该免疫动物中，敏化抗原在该免疫动物的机体内表达，由此赋予免疫刺激。与将蛋白质抗原给予免疫动物的通常的免疫方法相比，DNA免疫期待如下优越性:
[0746]-能够维持如IL-6R的膜蛋白的结构而赋予免疫刺激
[0747]-无需纯化免疫抗原。[0748]为了通过DNA免疫获得本发明的单克隆抗体，首先，对免疫动物给予表达IL-6R蛋白的DNA。编码IL-6R的DNA可通过PCR等公知方法合成。将所得DNA插入适当的表达载体，给予免疫动物。作为表达载体，可优选利用例如PCDNA3.1等市售的表达载体。作为将载体给予机体的方法，可采用通常所使用的方法。例如，将吸附有表达载体的金颗粒用基因枪导入免疫动物个体的细胞内，由此进行DNA免疫。进而，识别IL-6R的抗体的制作也可以采用国际公开W02003/104453中记载的方法来制作。
[0749]如此将哺乳动物免疫，确认到血清中与IL-6R结合的抗体效价的上升后，从哺乳动物采集免疫细胞，进行细胞融合。作为优选的免疫细胞，特别可使用脾细胞。
[0750]作为与前述免疫细胞融合的细胞，可使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。骨髓瘤细胞优选具备用于筛选的适当的选择标记物。选择标记物是指赋予细胞能够在特定培养条件下存活(或死亡)的性质。选择标记物中，公知的是次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖基转移酶缺失(以下简称为HGPRT缺失)或胸苷激酶缺失(以下简称为TK缺失)等。具有HGPRT、TK缺失的细胞具有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷敏感性(以下简称为HAT敏感性)。HAT敏感性的细胞不能在HAT选择培养基中进行DNA合成而会死亡，但若与正常细胞发生融合，则可利用正常细胞的补救途径继续DNA的合成，因此在HAT选择培养基中也会生长。
[0751]HGPRT缺失、TK缺失的细胞各自可通过含有6_硫代鸟嘌呤、8_氮杂鸟嘌呤(以下简称为8AG)或5’溴脱氧尿苷的培养基来选择。DNA中整合有这些嘧啶类似物的正常细胞会死亡。而无法整合这些嘧啶类似物的缺乏上述酶的细胞则可以在选择培养基中存活。此外，被称为G418抗性的选择标记物可通过新霉素抗性基因赋予针对2-脱氧链霉胺系抗生素(庆大霉素类似物)的抗性。细胞融合中优选的各种骨髓瘤细胞是公知的。
[0752]作为这类骨髓瘤细胞，可适宜使用例如P3 (P3x63Ag8.653) (J.1mmunol.(1979) 123 (4), 1548-1550)> P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiologyand Immunology (1978)81, 1-7)、NS-1 (C.Eur.J.1mmunol.(1976)6 (7)，511-519)、MPC-1l (Cell (1976) 8 (3)，405-415)、SP2/0 (Nature (1978) 276 (5685)，269-270)、FO (J.1mmunol.Methods (1980) 35 (1-2), 1-21) , S194/5.ΧΧ0.BU.1 (J.Exp.Med.(1978) 148 (I)，313-323)、R210 (Nature (1979) 277 (5692)，131-133)等。
[0753]基本上，根据公知方法，例如Kohler和Milstein等的方法(Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等，进行前述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合。
[0754]更具体而言，例如，可以在细胞融合促进剂的存在下，在通常的营养培养液中实施前述细胞融合。作为融合促进剂，使用例如聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，进而为了提高融合效率，根据期望添加二甲基亚砜等助剂使用。
[0755]免疫细胞和骨髓瘤细胞的使用比例可以任意设定。例如，相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为I至10倍。作为用于前述细胞融合的培养液，使用例如适于前述骨髓瘤细胞株的生长的R PMI1640培养液、MEM培养液、以及用于此种细胞培养的通常的培养液，进而可优选添加胎牛血清(FCS)等血清补液。
[0756]对于细胞融合，将规定量的前述免疫细胞和骨髓瘤细胞在前述培养液中充分混合，将预先加热至37 °C左右的PEG溶液(例如平均分子量1000至6000左右)通常以30至60% (w/v)的浓度添加。混合液通过缓慢混合而形成所期望的融合细胞(杂交瘤)。其次，依次添加上述列举的适当的培养液，通过重复进行离心除去上清的操作，可以除去对杂交瘤的生长不利的细胞融合剂等。
[0757] 这样得到的杂交瘤可通过用通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。使用上述HAT培养液的培养可持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间(通常，所述足够的时间为数天至数周)。其次，通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0758]如此得到的杂交瘤可通过使用对应于用于细胞融合的骨髓瘤所具有的选择标记物的选择培养液来进行选择。例如，具有HGPRT或TK缺失的细胞可以通过用HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)培养来进行选择。即，在细胞融合中使用HAT敏感性的骨髓瘤细胞时，在HAT培养液中，与正常细胞的细胞融合成功了的细胞可选择性地生长。使用上述HAT培养液的培养可以持续足够所期望的杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间。具体而言，通常通过数天至数周的培养，可以选择所期望的杂交瘤。其次，可通过通常的有限稀释方法，实施产生所期望抗体的杂交瘤的筛选和单克隆。
[0759]所期望抗体的筛选和单克隆优选可通过公知的基于抗原抗体反应的筛选方法来实施。例如，与IL-6R结合的单克隆抗体可以与细胞表面表达的IL-6R结合。这样的单克隆抗体可通过例如FACS (荧光活化细胞分选)来筛选。FACS是可以通过用激光分析与荧光抗体接触的细胞并测定各细胞发出的荧光来测定抗体对细胞表面的结合的系统。
[0760]为了利用FACS来对产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤进行筛选，首先制备表达IL-6R的细胞。优选用于筛选的细胞是强制表达IL-6R的哺乳动物细胞。作为对照，通过使用用作宿主细胞的未转化的哺乳动物细胞，可以选择性地检测抗体对细胞表面的IL-6R的结合活性。即，通过选择产生不与宿主细胞结合、而与IL-6R强制表达细胞结合的抗体的杂交瘤，可以获得产生IL-6R单克隆抗体的杂交瘤。
[0761]或者，可以基于ELISA的原理来评价抗体对固定化的IL-6R表达细胞的结合活性。例如，将IL-6R表达细胞固定于ELISA板的孔中。使杂交瘤的培养上清与孔内的固定化细胞接触，检测与固定化细胞结合的抗体。单克隆抗体来源于小鼠时，与细胞结合的抗体可通过抗小鼠免疫球蛋白抗体检测。通过这些筛选选择出的、产生具有抗原结合能力的所期望的抗体的杂交瘤可以通过有限稀释方法等进行克隆。
[0762]这样制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在通常的培养液中传代培养。此外，该杂交瘤可以在液氮中长期保存。
[0763]按照通常的方法培养该杂交瘤，可从其培养上清中获得所期望的单克隆抗体。或者，可以将杂交瘤给予和其具有相容性的哺乳动物并使其生长，从其腹水中获得单克隆抗体。前者的方法适于获得高纯度的抗体。
[0764]也可以适宜地使用由从该杂交瘤等抗体产生细胞克隆的抗体基因编码的抗体。将克隆的抗体基因整合至适当的载体中，导入宿主，由此表达由该基因所编码的抗体。用于抗体基因的分离、向载体中的导入以及宿主细胞的转化的方法已经由例如Vandamme等确立(Eur.J.Biochem.(1990) 192 (3)，767-775)。此外，如下所述的重组抗体的制备方法也是公知的。
[0765]例如，由产生抗IL-6R抗体的杂交瘤细胞获得编码抗IL-6R抗体的可变区(V区)的cDNA。为此,通常首先从杂交瘤提取总RNA。作为用于从细胞提取mRNA的方法,例如可使用如下所述的方法:[0766]-胍超离心法(Biochemistry(1979) 18 (24)，5294-5299)
[0767]-AGPC法(Anal.Biochem.(1987) 162(I)，156-159)。
[0768]提取的mRNA 可使用 mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience 制)等进行纯化。或者还市售有 QuickPrep mRNA Purification Kit (GE Healthcare Bioscience制)等这样的用于从细胞直接提取总mRNA的试剂盒。使用这种试剂盒，可从杂交瘤获得mRNA ο可以使用反转录酶由所得mRNA合成编码抗体V区的cDNA。cDNA可通过AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA SynthesisKit (生化学工业社制)等合成。此外，为了 cDNA的合成和扩增，可以适宜采用使用了 SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech制)和 PCR 的 5’-RACE 法(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1988)85(23), 8998-9002,Nucleic AcidsRes.(1989) 17 (8) ,2919-2932)。进而，可以在这种cDNA的合成过程中向cDNA的两末端导入后述适合的限制酶位点。
[0769]从所得PCR产物纯化出目标cDNA片段，接着与载体DNA连接。如此制作重组载体，并导入大肠杆菌等中，选择菌落后，可以由形成该菌落的大肠杆菌制备所期望的重组载体。而且，对于该重组载体是否具有目标cDNA的碱基序列，可以通过公知的方法例如双脱氧核苷酸链终止法等来确认。
[0770]为了获得编码可变区的基因，简便的是利用5’ -RACE法，其中使用了可变区基因扩增用的引物。首先 ，将从杂交瘤细胞提取的RNA作为模板来合成cDNA，获得5’-RACE cDNA文库。5’-RACE cDNA文库的合成中可适宜地使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒等市售的试剂盒。
[0771]以所得的5’_RACE cDNA文库为模板，通过PCR法扩增抗体基因。基于公知的抗体基因序列，可设计小鼠抗体基因扩增用的引物。这些引物根据免疫球蛋白的亚类而具有不同的碱基序列。因此，理想的是使用Iso Strip小鼠单克隆抗体同种型分型试剂盒(RocheDiagnostics)等市售试剂盒来预先确定亚类。
[0772]具体而言，例如为了获得编码小鼠IgG的基因时，可以使用能够扩增编码作为重链的Y?、Y 2a> Y 2b> Y3、作为轻链的κ链和λ链的基因的引物。为了扩增IgG的可变区基因，通常，3’侧的引物采用会退火到相当于接近可变区的恒定区的部分上的引物。而5’侧的引物则采用5’ RACE cDNA文库制作试剂盒所附带的引物。
[0773]利用如此扩增得到的PCR产物，可以重构由重链和轻链的组合构成的免疫球蛋白。将经重构的免疫球蛋白针对IL-6R的结合活性作为指标，可筛选所期望的抗体。例如，为了获得针对IL-6R的抗体时，进一步优选抗体对IL-6R的结合是特异性的。与IL-6R结合的抗体可例如如下所述进行筛选:
[0774](I)使含有由杂交瘤获得的cDNA所编码的V区的抗体与IL-6R表达细胞接触的步骤；
[0775](2)检测IL-6R表达细胞与抗体的结合的步骤；以及
[0776](3)选择与IL-6R表达细胞结合的抗体的步骤。
[0777]检测抗体和IL-6R表达细胞的结合的方法是公知的。具体而言，通过如前所述的FACS等方法，可检测抗体与IL-6R表达细胞的结合。为了评价抗体的结合活性，可适宜利用IL-6R表达细胞的固定标本。
[0778]作为以结合活性为指标的抗体的筛选方法，还可适宜采用淘选法，其利用了噬菌体载体。从多克隆抗体表达细胞群以重链和轻链的亚类的文库的形式获得抗体基因时，有利的是利用噬菌体载体的筛选方法。编码重链和轻链的可变区的基因通过用适当的接头序列连接，可形成单链Fv(ScFv)。通过将编码scFv的基因插入噬菌体载体，可以获得在表面表达scFv的噬菌体。该噬菌体与所期望的抗原接触后，回收与抗原结合的噬菌体，从而可以回收编码具有目标结合活性的scFv的DNA。通过根据需要重复该操作，可以浓缩具有所期望结合活性的scFv。
[0779]得到编码抗IL-6R抗体的V区的目标cDNA后，通过识别插入在该cDNA的两末端的限制酶位点的限制酶，将该cDNA消化。优选的限制酶会识别并消化在构成抗体基因的碱基序列中出现频率低的碱基序列。进而，为了将I拷贝的消化片段以正确方向插入载体，优选插入能提供粘性末端的限制酶。将如上所述消化的编码抗IL-6R抗体的V区的cDNA插入适当的表达载体，由此可获得抗体表达载体。此时，只要将编码抗体恒定区(C区)的基因和编码前述V区的基因框内融合，则可获得嵌合抗体。这里，嵌合抗体是指恒定区和可变区的来源不同。因此，除了小鼠-人等异种嵌合抗体之外，人-人同种嵌合抗体也含有在本发明的嵌合抗体中。通过在预先具有恒定区的表达载体中插入前述V区基因，可以构建嵌合抗体表达载体。具体而言，例如，可在保持有编码所期望抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体的5’侧适宜地配置消化前述V区基因的限制酶的限制酶识别序列。对经相同组合的限制酶消化的两者进行框内融合，由此构建嵌合抗体表达载体。 [0780]为了制备抗IL-6R单克隆抗体，以在表达调控区的调控下进行表达的方式，将抗体基因整合至表达载体中。用于表达抗体的表达调控区含有例如增强子和启动子。此外，可以在氨基末端添加合适的信号序列，以使表达的抗体分泌到细胞外。在后述实施例中，作为信号序列使用了具有氨基酸序列MGWSCIILFLVATATGVHS(SEQ ID NO:3)的肽，除此之外也可以添加合适的信号序列。表达的多肽在上述序列的羧基末端部分被切断，被切断的多肽能够以成熟多肽的形式分泌到细胞外。其次，用该表达载体转化适当的宿主细胞，由此可以获得表达编码抗IL-6R抗体的DNA的重组细胞。
[0781]为了表达抗体基因，编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA被分别整合于不同的表达载体中。通过用整合有H链和L链的载体共转化(co-transfect)相同的宿主细胞，可以表达具备H链和L链的抗体分子。或者，也可以将编码H链和L链的DNA整合于单一表达载体中，并用其转化宿主细胞(参照国际公开W01994/011523)。
[0782]用于将分离的抗体基因导入适当的宿主来制作抗体的宿主细胞和表达载体的多个组合是公知的。这些表达系统均可用于分离本发明的抗原结合结构域。将真核细胞用作宿主细胞时，可适宜使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞。具体而言，动物细胞可例示下述细胞。
[0783](I)哺乳类细胞:CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、Hela、Vero、HEK(人胚肾)293、Freestyle?293 等
[0784](2)两栖类细胞:非洲爪蟾卵母细胞等
[0785](3)昆虫细胞:sf9、sf21、Tn5 等。
[0786]或者，作为植物细胞，公知有基于来源于烟草(Nicotiana tabacum)等烟草(Nicotiana)属的细胞的抗体基因表达系统。植物细胞的转化中，可以适宜使用进行了愈伤组织培养的细胞。[0787]进而，作为真菌细胞，可以使用如下细胞:
[0788]-酵母:酿酒酵母(Saccharomycesserevisiae)等酵母(Saccharomyces)属、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)等毕赤酵母属
[0789]-丝状真菌:黑曲霉菌(Aspergillusniger)等曲霉(Aspergillus)属。
[0790]此外，利用原核细胞的抗体基因表达系统也是公知的。例如，使用细菌细胞时，可适宜利用大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌等细菌细胞。通过转化向这些细胞中导入含有目标抗体基因的表达载体。通过在体外培养经转化的细胞，可以从该转化细胞的培养物中获得所期望的抗体。
[0791]除了上述宿主细胞之外，重组抗体的产生也可以利用转基因动物。即，可以从导入有编码所期望抗体的基因的动物获得该抗体。例如，抗体基因可以通过框内插入编码乳汁中固有产生的蛋白质的基因的内部，而构建为融合基因。作为分泌至乳汁中的蛋白质，可利用例如山羊β酪蛋白等。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入山羊的胚胎，再将该进行了注入的胚胎导入母山羊。由接受胚胎的山羊生出的转基因山羊(或其后代)产生的乳汁中，能够以与乳汁蛋白的融合蛋白的形式获得所期望的抗体。此外，为了使由转基因山羊产生的含有所期望抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊给予激素(Bio/Technology (1994), 12(7)，699-702)。
[0792]对人给予本说明书中记载的抗原结合分子时，作为该分子中的抗原结合结构域，可以适宜采用来源于基因重组型抗体的抗原结合结构域，该基因重组型抗体为了降低针对人的异源抗原性等目的已进行了人工改变。基因重组型抗体含有例如人源化(Humanized)抗体等。这些改变抗体可使用公知方法适宜制备。
[0793]用于制作本说明书中记载的抗原结合分子的抗原结合结构域的抗体可变区通常由被4个框架区域(FR)保持的3个互补决定区(complementarity-determining region ；CDR)构成。CDR是实质上决定抗体的结合特异性的区域。CDR的氨基酸序列富有多样性。另一方面，构成FR的氨基酸序列即便是在具有不同结合特异性的抗体之间也多显示高度的同一性。因此，通常认为可以通过CDR的移植来将某抗体的结合特异性移植到其它抗体。
[0794]人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体。具体而言，将人以外的动物例如小鼠抗体的CDR移植到人抗体中的人源化抗体等是公知的。用于获得人源化抗体的通常的基因重组方法也是已知的。具体而言，作为用于将小鼠抗体的CDR移植到人的FR中的方法，公知的是例如重叠延伸PCR。重叠延伸PCR中，用于合成人抗体FR的引物中添加有编码待移植小鼠抗体CDR的碱基序列。针对4个FR分别准备引物。通常，对于将小鼠CDR移植到人FR中，选择与小鼠FR同一性高的人FR，在维持CDR功能方面认为有利。即，通常优选利用下述人FR，其含有与待移植小鼠CDR的相邻FR氨基酸序列的同一性高的氨基酸序列。
[0795]此外，连接的碱基序列被设计为相互框内连接。通过各引物单独地合成人FR。结果得到各FR上添加有编码小鼠CDR的DNA的产物。各产物的编码小鼠CDR的碱基序列被设计为相互重叠。接着，使以人抗体基因为模板合成的产物的重叠CDR部分相互退火，进行互补链合成反应。通过该反应，人FR通过小鼠⑶R序列而连接。
[0796]最终3个⑶R和4个FR连接得到的V区基因，通过会与其5’末端和3’末端发生退火并添加有适当的限制酶识别序列的引物而扩增出其全长。将如上所述得到的DNA和编码人抗体C区的DNA以进行框内融合的方式插入表达载体中，由此可以制作人型抗体表达用载体。将该整合载体导入宿主建立重组细胞后，培养该重组细胞，通过表达编码该人源化抗体的DNA，从而在该培养细胞的培养物中产生该人源化抗体(参照欧州专利公开EP239400、国际公开 W01996/002576)。
[0797] 通过定性或者定量地测定并评价如上所述制作的人源化抗体的抗原结合活性，可以适宜地选择人抗体FR，以便通过CDR连接时该CDR形成良好的抗原结合位点。根据需要，也可以按照重构人抗体CDR形成合适抗原结合位点的方式来取代FR的氨基酸残基。例如，可以应用将小鼠CDR移植到人FR中使用的PCR法，向FR导入氨基酸序列的突变。具体而言，可以向会与FR发生退火的引物中导入部分碱基序列的突变。通过这样的引物合成的FR中导入了碱基序列的突变。通过用上述方法测定并评价进行了氨基酸取代的突变型抗体的抗原结合活性，可以选择具有所期望性质的突变FR序列(Cancer Res., (1993) 53，851-856)。
[0798]此外，将具有人抗体基因的全部组成成分的转基因动物(参照国际公开W01993/012227, W01992/003918, W01994/002602, W01994/025585, W01996/034096、W01996/033735)作为免疫动物，可以通过DNA免疫获得所期望的人抗体。
[0799]进而，使用人抗体文库通过淘选获得人抗体的技术也是已知的。例如,人抗体的V区以单链抗体(scFv)的形式通过噬菌体展示法表达在噬菌体的表面。可以选择表达与抗原结合的scFv的噬菌体。通过对选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体V区的DNA序列。确定与抗原结合的scFv的DNA序列后，将该V区序列与所期望的人抗体C区序列框内融合后，插入适当的表达载体，由此可以制作表达载体。将该表达载体导入上述列举的适宜表达细胞中，通过使编码该人抗体的基因表达，可以获得该人抗体。这些方法已经公知(参照国际公开W01992/001047、W01992/020791、W01993/006213、W01993/011236、W01993/019172、W01995/001438、W01995/015388)。
[0800]此外，作为获得抗体基因的方法，除了上述之外，还可适宜地使用如Bernasconi等(Science (2002) 298，2199-2202)或TO2008/081008中记载的B细胞克隆(各抗体的编码序列的鉴定和克隆、其分离、以及用于制备各抗体(特别是IgGl、IgG2、IgG3或IgG4)的表达载体构建用的用途等)的方法。
[0801]EU编号和Kabat编号
[0802]根据本发明中使用的方法，分配给抗体的CDR和FR的氨基酸位置依照Kabat规定(Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institute ofHealth, Bethesda, Md., 1987年和1991年)。本说明书中，抗原结合分子为抗体或抗原结合片段时，可变区的氨基酸按照Kabat编号来表示，恒定区的氨基酸按照基于Kabat氨基酸位置的EU编号来表不。
[0803]离子浓度备件
[0804]金属离子浓度条件
[0805]本发明的一个方式中，离子浓度是指金属离子浓度。“金属离子”是指属于除了氢以外的碱金属和铜族等第I族、碱土类金属和锌族等第II族、除了硼之外的第III族、除了碳和硅之外的第IV族、铁族和钼族等第VIII族、V、VI和VII族的各A亚族的元素以及锑、铋、针等金属元素的离子。金属原子具有释放出原子价电子而形成阳离子的性质，称这为离子化倾向。认为离子化倾向大的金属富有化学活性。
[0806]作为本发明中优选的金属离子的实例，可举出钙离子。钙离子参与许多生命现象的调节，钙离子参与骨骼肌、平滑肌和心肌等肌肉的收缩，白细胞的运动和吞噬等的活化，血小板的变形和分泌等的活化，淋巴细胞的活化，组胺的分泌等肥大细胞的活化，儿茶酚胺α受体或乙酰胆碱受体介导的细胞应答，胞吐作用，递质从神经元末端的释放，神经元的轴浆流等。作为细胞内的钙离子受体，已知具有多个钙离子结合位点、且认为在分子进化上来源于共同起源的肌钙蛋白C、钙调蛋白、小白蛋白、肌球蛋白轻链等，其结合模体也大量已知。还熟知例如，钙黏蛋白结构域、钙调蛋白所含的EF手、蛋白激酶C所含的C2结构域、凝血蛋白因子IX所含的Gla结构域、脱唾液酸糖蛋白受体或甘露糖结合受体所含的C型凝集素、LDL受体所含的A结构域、膜联蛋白、血小板反应蛋白3型结构域和EGF样结构域。
[0807]本发明中，在金属离子为钙离子时，作为钙离子浓度条件，可举出低钙离子浓度条件和高钙离子浓度条件。结合活性随钙离子浓度条件而变化是指，低钙离子浓度和高钙离子浓度条件的不同导致抗原结合分子的抗原结合活性发生变化。可举出例如，高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。此外还可举出，低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性高于高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性的情形。
[0808]本说明书中，高钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自100μΜ至IOmM之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自200 μ M至5mM之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自500μΜ至2.5mM之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自200 μ M至2mM之间的浓度。进而，还可以是选自400μΜ至1.5mM之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内血浆中(血中)的钙离子浓度接近的500μΜ至2.5mM之间的浓度。
[0809]本说明书中，低钙离子浓度并不特别限于统一的数值，可以是优选选自0.ΙμΜ至30μΜ之间的浓度。此外，在其它方案中，可以是选自0.2μΜ至20μΜ之间的浓度。此外，在不同的方案中，可以是选自0.5 μ M至10 μ M之间的浓度，在其它的方案中也可以是选自ΙμΜ至5μΜ之间的浓度。进而，还可以是选自2μΜ至4μΜ之间的浓度。特别优选可举出选自与机体内的早期内体内的离子化钙浓度接近的I μ M至5 μ M之间的浓度。
[0810]本发明中，低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性意指，抗原结合分子在选自0.ΙμΜ至30μΜ之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于选自100μΜ至IOmM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。优选意指抗原结合分子在选自0.5 μ M至10 μ M之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自200 μ M至5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性，特别优选意指机体内的早期内体内的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于机体内的血浆中的钙离子浓度下的抗原结合活性，具体意指抗原结合分子在选自ΙμΜ至5μΜ之间的钙离子浓度下的抗原结合活性弱于在选自500 μ M至2.5mM之间的钙离子浓度下的抗原结合活性。
[0811]抗原结合分子的抗原结合活性随金属离子浓度条件而变化与否可以通过使用例如前述结合活性项目中所记载的公知测定方法来确定。例如，为了确认与低钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性相比高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性变得更高，对低钙离子浓度和高钙离子浓度条件下的抗原结合分子的抗原结合活性进行比较。
[0812]进而，本发明中，“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”的表述也可以表述为抗原结合分子的高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于低钙离子浓度条件下的抗原结合活性。应予说明，本发明中有时也将“低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”，此外，有时也将“使低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性”记载为“使低钙离子浓度条件下的抗原结合能力弱于高钙离子浓度条件下的抗原结合能力”。
[0813]本领域技术人员可以适宜选择测定抗原结合活性时的钙离子浓度以外的条件，没有特别限定。例如，可以在HEPES缓冲液、3 7 °C的条件下进行测定。例如，可以使用Biacore (GE Healthcare)等进行测定。对于抗原结合分子和抗原的结合活性的测定，在抗原为可溶型抗原时，通过对固定有抗原结合分子的芯片流过作为分析物的抗原，由此可以评价对可溶型抗原的结合活性，在抗原为膜型抗原时，通过对固定有抗原的芯片流过作为分析物的抗原结合分子，由此可以评价对膜型抗原的结合活性。
[0814]本发明的抗原结合分子中，只要低钙离子浓度条件的抗原结合活性弱于高钙离子浓度条件的抗原结合活性，则低钙离子浓度条件下的抗原结合活性和高钙离子浓度条件下的抗原结合活性之比没有特别限定，优选相对于抗原的低钙离子浓度条件下的KD (Dissociation constant:解离常数)和高钙离子浓度条件的KD之比KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值为2以上，进一步优选KD (Ca3 μ M)/KD (Ca2mM)的值为10以上，进一步优选KD (Ca3 μ M) /KD (Ca2mM)的值为40以上。KD (Ca3 μ Μ) /KD (Ca2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。此外，也可以特定10)(0&3 4]\0/1(0(0&1.21111)的值。BP,KD(Ca3 μ M)/KD(Ca1.2mM)的值为 2 以上，进一步优选 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值为 10 以上，进一步优选 KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值为40以上。KD (Ca3 μ M) /KD (Ca1.2mM)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术可以制作，则可以是400、1000、10000等任意的值。
[0815]作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用KD (解离常数)，而在抗原为膜型抗原时可以使用表观KD (Apparent dissociation constant:表观解离常数)。KD(解离常数)和表观KD(表观解离常数)可通过本领域技术人员公知的方法进行测定，例如可使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图(Scatchard plot)、流式细胞仪等。
[0816]此外，作为示出本发明的抗原结合分子的低钙浓度条件下的抗原结合活性和高钙浓度条件下的抗原结合活性之比的其它指标，还可适宜使用例如解离速率常数即kd (Dissociation rate constant:解离速率常数)。代替KD (解离常数)而使用kd (解离速率常数)来作为示出结合活性之比的指标时，相对于抗原的低钙浓度条件下的kd(解离速率常数)和高钙浓度条件下的kd(解离速率常数)之比即kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值优选为2以上，进一步优选为5以上，进一步优选为10以上，更优选为30以上。kd(低钙浓度条件)/kd(高钙浓度条件)的值的上限没有特别限定，只要本领域技术人员的技术常识可以制作，则可以为50、100、200等任意的值。
[0817]作为抗原结合活性的值，在抗原为可溶型抗原时可以使用kd(解离速率常数)，在抗原为膜型抗原时可以使用表观kd (Apparent dissociation rate constant:表观解离速率常数)。kd(解离速率 使用Biacore (GE healthcare)、流式细胞仪等。应予说明,本发明中，在测定不同钙离子浓度下的抗原结合分子的抗原结合活性时，钙浓度以外的条件优选为相同。
[0818]例如，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(C)的抗原结合结构域或抗体的筛选来获得:
[0819](a)获得低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；
[0820](b)获得高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性的步骤；以及
[0821](c)选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤。
[0822]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(C)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得:
[0823](a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体或其文库与抗原接触的步骤；
[0824](b)将在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤；以及
[0825](C)对在前述步骤(b)中解离的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0826]此外，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(d)的抗原结合结构域或抗体或其文库的筛选来获得:
[0827](a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；
[0828](b)选择在前述步骤(a)中不与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤；
[0829](c)使在前述步骤(b)中选择的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；以及
[0830](d)对在前述步骤(C)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0831]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(C)的筛选方法来获得:
[0832](a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与固定有抗原的柱接触的步骤；
[0833](b)将在前述步骤(a)中与柱结合的抗原结合结构域或抗体在低钙浓度条件下从柱洗脱的步骤；以及
[0834](C)对在前述步骤(b)中洗脱的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0835]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(d)的筛选方法来获得:
[0836](a)在低钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库通过固定有抗原的柱的步骤；
[0837](b)对在前述步骤(a)中不与柱结合而洗脱的抗原结合结构域或抗体进行回收的步骤；
[0838](C)使在前述步骤(b)中回收的抗原结合结构域或抗体在高钙浓度条件下与抗原结合的步骤；以及
[0839] (d)对在前述步骤(C)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0840]进而，作为本发明提供的一个方案的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体可通过包括以下步骤(a)~(d)的筛选方法来获得:
[0841](a)在高钙浓度条件下使抗原结合结构域或抗体的文库与抗原接触的步骤；
[0842](b)获得在前述步骤(a)中与抗原结合的抗原结合结构域或抗体的步骤；
[0843](c)将在前述步骤(b)中获得的抗原结合结构域或抗体置于低钙浓度条件下的步骤；以及
[0844](d)对前述步骤(C)中抗原结合活性弱于前述步骤(b)中进行选择的标准的抗原结合结构域或抗体进行分离的步骤。
[0845]应予说明，前述步骤可以重复2次以上。所以，根据本发明，可提供通过上述筛选方法中进一步包括将(a)~(C)或(a)~(d)的步骤重复2次以上的步骤的筛选方法而获得的低钙离子浓度条件的抗原结合活性低于高钙离子浓度条件的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体。(a)~(C)或(a)~(d)的步骤的重复次数没有特别限定，通常为10次以内。
[0846]本发明的筛选方法中，低钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为0.1 μ M~30 μ M之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出0.5μΜ~10 μ M之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度,可举出机体内的早期内体内的离子化钙浓度，具体可举出ΙμΜ~5μΜ下的抗原结合活性。此外，高钙浓度条件下的抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性只要是离子化钙浓度为100μΜ~IOmM之间的抗原结合活性则没有特别限定，作为优选的离子化钙浓度，可举出200 μ M~5mM之间的抗原结合活性。作为更优选的离子化钙浓度，可举出机体内的血浆中的离子化钙浓度，具体可举出0.5mM~2.5mM时的抗原结合活性。
[0847]抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可通过本领域技术人员公知的方法测定，对于离子化钙浓度以外的条件，本领域技术人员可以适宜确定。抗原结合结构域或抗体的抗原结合活性可以作为KD(Dissociation constant:解离常数)、表观KD(Apparentdissociation constant:表观解离常数)、解离速率即kd (Dissociation rate:解离速率常数)或表观kd (Apparent dissociation:表观解离速率常数)等来进行评价。它们可以通过本领域技术人员公知的方法来测定，例如可以使用Biacore(GE healthcare)、斯卡查德图、FACS等。
[0848]本发明中，选自高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤，与选择低钙浓度条件下的抗原结合活性低于高钙浓度条件下的抗原结合活性的抗原结合结构域或抗体的步骤含义相同。
[0849]只要高钙浓度条件下的抗原结合活性高于低钙浓度条件下的抗原结合活性，则高钙浓度条件下的抗原结合活性与低钙浓度条件下的抗原结合活性之差没有特别限定，优选高钙浓度条件下的抗原结合活性是低钙浓度条件下的抗原结合活性的2倍以上、进一步优选为10倍以上、更优选为40倍以上。
[0850]通过前述筛选方法筛选得到的本发明的抗原结合结构域或抗体可以是任意的抗原结合结构域或抗体，例如，可以筛选上述抗原结合结构域或抗体。例如，可以筛选具有天然序列的抗原结合结构域或抗体，也可以筛选氨基酸序列被取代的抗原结合结构域或抗体。
[0851]f库
[0852]根据一个方案，本发明的抗原结合结构域或抗体可以由文库获得，该文库主要由多种抗原结合分子形成，所述多种抗原结合分子的序列相互不同，并且其抗原结合结构域中含有至少一个使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸残基。作为离子浓度的实例，优选可举出金属离子浓度或氢离子浓度。
[0853]本说明书中，“文库”是指多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽、或编码它们的序列的核酸、多核苷酸。文库中所含的多种抗原结合分子或含有抗原结合分子的多种融合多肽的序列并非单一的序列，而是序列相互不同的抗原结合分子或含有抗原结合分子的融合多肽。
[0854]本说明书中，序列相互不同的多种抗原结合分子的记载中的“序列相互不同”这一术语意指文库中的各抗原结合分子的序列相互不同。即，文库中的相互不同的序列的数量反映文库中的序列不同的独立克隆的数量，有时也被视为“文库大小”。通常的噬菌体展示文库为IO6至1012，通过使用核糖体展示法等公知的技术，可将文库大小放大至1014。然而，噬菌体文库的淘选选择时使用的噬菌体颗粒的实际数目通常比文库大小大10至10，000倍。该过量倍数也称为“文库当量数”，表示具有相同氨基酸序列的各克隆能够存在10至10，000个。所以，本发明中的“序列相互不同”这一术语意指文库当量数除外的文库中的各抗原结合分子的序列相互不同，更具体意指序列相互不同的抗原结合分子存在IO6至IO14个分子、优选IO7至IO12个分子、进一步优选IO8至IO11个分子、特别优选IO8至IO12个分子。
[0855]此外，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库这一记载中的术语“多种”，对于例如本发明的抗原结合分子、融合多肽、多核苷酸分子、载体或病毒来说，通常是指这些物质的2种以上的集合。例如，只要某2个以上的物质在特定形态方面相互不同，则表示该物质存在2种以上。作为实例，可举出氨基酸序列中的特定氨基酸位置观察到的突变体氨基酸。例如，当除了柔性残基以外或除了露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸以外，序列实质上相同、优选相同的本发明的2个以上的抗原结合分子存在时，则本发明的抗原结合分子存在多种。在其它实施例中，当除了编码柔性残基的碱基以外或除了编码露出于表面的超变氨基酸位置的特定突变体氨基酸的碱基以外实质上相同、优选相同的序列的本发明的2个以上的多核苷酸分子存在时，则本发明的多核苷酸分子存在多种。
[0856]进而，本发明的主要由多种抗原结合分子形成的文库的记载中的“主要由...形成”的表述反映出文库中的序列不同的独立克隆的数量中抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的数量。具体而言，优选表现出这种结合活性的抗原结合分子在文库中至少存在IO4个分子。此外，更优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO5个分子的文库中获得。进一步优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO6个分子的文库中获得。特别优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO7个分子的文库中获得。还优选本发明的抗原结合结构域可由表现出这种结合活性的抗原结合分子至少存在IO8个分子的文库中获得。其它表述中，也可适宜地表述为文库中的序列不同的独立克隆的数量中的抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而不同的抗原结合分子的比例。具体而言，本发明的抗原结合结构域可以由表现出这种结合活性的抗原结合分子占文库中序列不同的独立克隆的数量的0.1%至80%、优选0.5%至60%、更优选I %至40 %、进一步优选2 %至20 %、特别优选4%至10 %的文库中获得。融合多肽、多核苷酸分子或载体的情形也与上述相同，可以用分子的数量或全部分子中的比例来表述。此外，病毒的情形也与上述相同，可以用病毒个体的数量或全部个体中的比例来表述。
[0857]抗原结合结构域的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸
[0858]通过前述筛选方法筛选的本发明的抗原结合结构域或抗体可用任意方法制备，例如，在金属离子为钙 离子浓度的情形中，可以使用预先存在的抗体、预先存在的文库(噬菌体文库等)、由对动物进行免疫得到的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞制得的抗体或文库、向这些抗体或文库导入能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的抗体或文库(能螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸的含有率提高的文库或者在特定位置导入能够螯合钙的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)或非天然氨基酸突变而得的文库等)等。
[0859]如前所述，作为使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，例如，在金属离子为钙离子时，只要是形成钙结合模体的氨基酸即可，不论其种类如何。钙结合模体是本领域技术人员所周知的，并且有详细记载(例如Springer 等(Cell (2000) 102，275-277)、Kawasaki 和 Kretsinger (Protein Prof.(1995)2，305-490),Moncrief等(J.Mol.Evo1.(1990)30，522-562),Chauvaux等(Biochem.J.(1990)265，261-265)、Bairoch 和 Cox(FEBS Lett.(1990) 269，454-456)、Davis (NewBiol.(1990)2，410-419)、Schaefer等(Genomics(1995)25，638 ~643),Economou 等(ΕΜΒ0J.(1990)9，349-354)、Wurzburg 等(Structure.(2006) 14,6，1049-1058))。即，本发明抗原结合分子中可以含有ASGPR，⑶23、MBR、DC-SIGN等C型凝集素等任意的公知钙结合模体。作为这种钙结合模体的优选实例，除了上述之外，还可举出SEQ ID N0:62所述的抗原结合结构域中所含的钙结合模体。
[0860]此外，作为抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的实例，还可适宜使用具有金属螯合作用的氨基酸。作为具有金属螯合作用的氨基酸的实例，优选可举出例如:丝氨酸(Ser(S))、苏氨酸(Thr(T))、天冬酰胺(Asn(N))、谷氨酰胺(Gin (Q))、天冬氨酸(Asp(D))和谷氨酸(Glu(E))等。
[0861]含有前述氨基酸的抗原结合结构域的位置并不限于特定的位置，只要是使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化，则可以是形成抗原结合结构域的重链可变区或轻链可变区中的任意位置。即，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由重链的CDR3的以Kabat编号表示的95位、96位、IOOa位和/或101位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。[0862]此外，在本发明的非限定的一个方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的抗原结合结构域中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。此外，在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDRl中含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDRl的以Kabat编号表示的30位、31位和/或32位含有该氨基酸、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0863]此外，在其它非限定的方式中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR2中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，提供下述文库，该文库主要由轻链的CDR2的以Kabat编号表示的50位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。 [0864]进而，在其它非限定的方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3中含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。在其它方案中，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的CDR3的以Kabat编号表示的92位含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0865]此外，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库作为本发明的不同方案来获得，该文库主要由选自上述记载的轻链的CDRl、CDR2和CDR3中的2个或3个CDR含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。进而，本发明的抗原结合结构域可以由下述文库获得，该文库主要由轻链的以Kabat编号表示的30位、31位、32位、50位和/或92位中的任一个以上含有该氨基酸残基、且序列相互不同的抗原结合分子形成。
[0866]在特别优选的实施方案中，理想的是抗原结合分子的轻链和/或重链可变区的框架序列具有人的种系框架序列。因此，在本发明的一个方案中，若框架序列完全为人的序列，则认为在给予人(例如疾病的治疗)时，本发明的抗原结合分子基本或完全不会引起免疫原性反应。根据上述含义，本发明的“含有种系序列”意指本发明的框架序列的一部分与任意的人的种系框架序列的一部分相同。例如，在本发明的抗原结合分子的重链FR2的序列为多个不同的人的种系框架序列的重链FR2序列组合得到的序列时，也是本发明的“含有种系序列”的抗原结合分子。
[0867]作为框架的实例，优选可举出例如:V_Base(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)等网站中所包括的、现在已知的完全人型框架区域的序列。这些框架区域的序列能够适宜用作本发明的抗原结合分子中所含的种系序列。种系序列可基于其相似性来分类(Tomlinson 等(J.Mol.Biol.(1992) 227，776-798)Williams 和 Winter(Eur.J.1mmunol.(1993)23，1456-1461)和 Cox 等(Nat.Genetics (1994) 7, 162-168))。可以从分类为 7 个亚类的Vk、分类为10个亚类的V λ、分类为7个亚类的VH中适宜选择合适的种系序列。
[0868]完全人型VH序列并不仅限于下述，可适宜举出例如:VH1亚类(例如，VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1_69)、VH2 亚类(例如，VH2-5、VH2-26、VH2-70)、VH3 亚类(VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74)、VH4 亚类(VH4-4、VH4-28、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61)、VH5 亚类(VH5-51)、VH6 亚类(VH6-1)、VH7 亚类(VH7-4、VH7_81)的 VH 序列等。它们也记载于公知文献(Matsuda等(J.Exp.Med.(1998) 188, 1973-1975))等中，本领域技术人员可以基于它们的序列信息适宜设计本发明的抗原结合分子。还可适宜使用它们以外的完全人型框架或框架的亚区(sub-region)。
[0869]完全人型VK序列并不仅限于下述，可适宜举出例如:分类为Vkl亚类的A20、A30、L1、L4、L5、L8、L9、Lll、L12、L14、L15、L18、L19、L22、L23、L24、02、04、08、012、014、018 ;分类为 Vk2 亚类的 Al、A2、A3、A5、A7、A17、A18、A19、A23、01、011 ；分类为Vk3 亚类的 All、A27、L2、L6、L10、L16、L20、L25 ;分类为 Vk4 亚类的 B3 ;分类为 Vk5 亚类的B2 (本说明书中也称为Vk5-2);分类为VK6亚类的A10、A14、A26等(Kawasaki等(Eur.J.1mmunol.(2001) 31，1017-1028)、Schable 和 Zachau (Biol.Chem.HoppeSeyler (1993)374, 1001-1022)和 Brensing-Kuppers ^ (Gene (1997) 191，173-181))。
[0870]完全人型的VL序列并不仅限于下述，可适宜举出例如:分类为VLl亚类的V1-2、Vl-3、Vl-4、Vl-5、Vl-7、Vl-9、Vl-ll、Vl-13、Vl-16、Vl-17、Vl-18、Vl-19、Vl-20、Vl-22 ;分类为 VLl 亚类的 V2-1、V2-6、V2-7、V2-8、V2-11、V2-13、V2-14、V2-15、V2-17、V2-19 ;分类为 VL3 亚类的 V3-2、V3-3、V3-4 ;分类为 VL4 亚类的 V4-1、V4-2、V4-3、V4-4、V4-6 ;分类为VL5 亚类的 V5-l、V5-2、V5-4、V5-6 等(Kawasaki 等(Genome Res.(1997)7,250-261))。
[0871]通常这些框架序列根据一个或更多个氨基酸残基的区别而相互不同。这些框架序列可以与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用。作为与本发明的“使抗原结合分子的抗原结合活性随离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基”一起使用的完全人型框架的实例，并不仅限于此，此外还可举出:KOL、NEWM、RE1、EU、TUR、TE1、LAY、POM 等(例如，前述的 Kabat 等(1991)和 Wu 等(J.Exp.Med.(1970) 132,211-250))。
[0872]本发明并不受特定理论的束缚，认为种系序列的使用有望排除大多数个体中有害免疫反应的一个原因如下所述。通常的免疫反应中产生的亲和性成熟阶段的结果造成免疫球蛋白的可变区频繁地产生体细胞的突变。这些突变主要产生在其序列为超变的⑶R的附近，对框架区域的残基也造成影响。这些框架的突变在种系的基因中不存在，而成为患者的免疫原性的可能性也小。其是由于:通常的人类种群暴露于种系的基因所表达的框架序列的大多数，作为免疫耐受性的结果，预测这些种系的框架在患者中的免疫原性低或为非免疫原性。为了使免疫耐受性的可能性最大，编码可变区的基因可以从通常存在的功能性种系基因的集合中选择。
[0873]为了制作本发明的、前述框架序列中含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的氨基酸的抗原结合分子，可适宜采用位点特异性诱变法(Kunkel等(Proc.Natl.Acad.Sc1.USA (1985) 82，488-492))或重叠延伸 PCR 等公知方法。
[0874]例如，通过将被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区、与被制作为随机可变区序列文库的重链可变区组合 ，由此可以制作含有本发明的多种序列相互不同的抗原结合分子的文库。作为这样的非限定性实例，在离子浓度为钙离子浓度时，可适宜举出例如:将SEQ IDN0:62(Vk5-2)所述的轻链可变区序列所代表的属于Vk5-2家族的轻链可变区序列和被制作作为随机可变区序列文库的重链可变区组合而成的文库。
[0875]此外，也可以进行设计，以使前述被选择作为预先含有使抗原结合分子的抗原结合活性随钙离子浓度条件而变化的至少一个氨基酸残基的框架序列的轻链可变区的序列中含有作为该氨基酸残基以外的残基的各种氨基酸。本发明中，这样的残基也被称为柔性残基。本发明的抗原结合分子的抗原结合活性只要随离子浓度条件而变化，则该柔性残基的数目和位置并不限于特定的方案。即，重链和/或轻链的CDR序列和/或FR序列中可以含有一个或更多个的柔性残基。例如，在离子浓度为钙离子浓度时，作为导入SEQ IDN0:62(Vk5-2)所述的轻链可变区序列中的柔性残基的非限定性实例，可举出表1或表2中所述的氨基酸残基。
[0876][表 I]
【权利要求】
1.含有抗原结合分子的药物组合物，其中，所述抗原结合分子含有:在PH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域。
2.权利要求1所述的药物组合物，其中，上述抗原为可溶型抗原。
3.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
5.权利要求1或2所述的药物组合物，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
6.权利要求5所述的药物组合物，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
7.权利要求1飞中任一项所述的药物组合物，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
8.权利要求f 7中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fe Y受体结合结构域含有抗体的Fe区。
9.权利要求8所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
10.权利要求9所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个； 222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个； 224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个； 227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个； 231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys> Pro或Tyr中的任一个； 232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；`233位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； `234位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； ` 235位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； `236位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr、Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； ` 237位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； `238位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任 个； ` 239位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； `240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； `241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个； `243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一个； `244位的氨基酸为His; `245位的氨基酸为Ala; ` 246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； ` 247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个； ` 249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个； ` 250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个； `251位的氨基酸为Phe; ` 254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个； `255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个； `256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个； `258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个； `260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； `262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个； ` 263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； ` 264位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr λ Trp或Tyr中的任一个； `265位的氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr λ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； ` 266位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； ` 267位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、IIe、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个；`268位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、lie、Lys、Leu、Met、Pro、Gin、Arg、Thr、Val 或
11.权利要求1-10中任一项所述的药物组合物，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
12.权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fe Y受体为FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
13.权利要求1-11中任一项所述的药物组合物，其中，上述人Fe Y受体为FcYRIIb。
14.权利要求8~13中任一项所述的药物组合物，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: .238位的氨基酸为Asp，或 .328位的氨基酸为Glu。
15.以下(i)-(vi)中任一项的方法，该方法包括使抗原结合分子与表达FeY受体的细胞在机体内或机体外进行细胞接触的步骤，所述抗原结合分子含有:在PH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域；以及，在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域，(i)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法； (ii)使血浆中的抗原消除的方法； (iii)改善抗原结合分子的药代动力学的方法； (iv)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法; (V)促进不与抗原结合的状态的抗原结合分子向细胞外释放的方法；或 (vi)使血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度减少的方法。
16.权利要求15所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
17.权利要求15或16所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
18.权利要求17所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
19.权利要求15或16所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
20.权利要求19所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
21.权利要求15~20中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
22.权利要求15~21中任一项所述的方法，其中，上述FeY受体结合结构域含有抗体的Fe区。
23.权利要求22所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434位、436位和440位。
24.权利要求23所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个； 222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个； 224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个； 227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；.230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个； .231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个； .232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； . 233位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； . 234位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .235位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； .236位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 237位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .238位的氨基酸 为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .239位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； .241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个； .243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一个； . 244位的氨基酸为His ； .245位的氨基酸为Ala; . 246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； .247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个； .249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个； .250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个； .251位的氨基酸为Phe; .254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个； .255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个； .256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个； .258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个； . 260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； .262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个； .263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； . 264位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、HiS、Ile、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gln、Arg、Ser、Thr λ Trp或Tyr中的任一个； .265位的氨基酸为 Ala、Leu、Phe、Gly、HiS、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser、Thrλ Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 266位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
25.权利要求15~24中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
26.权利要求15~25中任一项所述的方法，其中，上述人Fcy受体为FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
27.权利要求15~25中任一项所述的方法，其中，上述人FeY受体为FcyRIIb。
28.权利要求22~27中任一项所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: .238位的氨基酸为Asp，或 .328位的氨基酸为Glu。
29.以下(i广(vii)的任一项所述的方法，该方法包括:使抗原结合分子中的Fcy受体结合结构域在PH中性范围条件下的Fe Y受体结合活性较EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区在pH中性范围条件下的Fe Y受体结合活性增强的步骤，所述抗原结合分子含有在PH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性、且对抗原的结合活性随离子浓度条件而变化的抗原结合结构域以及Fe Y受体结合结构域， (i)使结合的抗原向细胞内的摄入得到促进的抗原结合分子的改变方法； (?)使一分子的抗原结合分子可结合的抗原数目增加的方法； (iii)使抗原结合分子的血浆中抗原消除能力增大的方法； (iv)改善抗原结合分子的药代动力学的方法； (v)促进在细胞外与抗原结合分子结合的抗原在细胞内从抗原结合分子解离的方法; (vi)促进在与抗原结合的状态下摄入到细胞内的抗原结合分子在不与抗原结合的状态下向细胞外释放的方法；或 (vii)可减少血浆中的总抗原浓度或游离抗原浓度的抗原结合分子的改变方法。
30.权利要求29所述的方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
31.权利要求29或30所述的方法，其中，上述离子浓度为钙离子浓度。
32.权利要求31所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在高钙离子浓度条件下的抗原结合活性高于在低钙离子浓度条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
33.权利要求29或30所述的方法，其中，上述离子浓度条件为pH条件。
34.权利要求33所述的方法，其中，上述抗原结合结构域为在pH中性范围条件下的抗原结合活性高于在pH酸性范围条件下对该抗原的结合活性的抗原结合结构域。
35.权利要求29~34中任一项所述的方法，其中，上述抗原结合分子为具有针对上述抗原的中和活性的抗原结合分子。
36.权利要求29~35中任一项所述的方法，其中，上述FeY受体结合结构域含有抗体的Fe区。
37.权利要求36所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中以下的任一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222位、223位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235 位、236 位、237位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249 位、250 位、251位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266 位、267 位、268位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279 位、280 位、281位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293 位、294 位、295位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305 位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327 位、328 位、329位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376 位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429 位、434 位、436位和440位。
38.权利要求37所述的方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个； 222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个；. 223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个；. 224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； . 225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个； . 227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；. 228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；. 230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个； .231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个； . 232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； . 233位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个； . 234位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个； . 235位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；. 236位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr> Val、Trp 或 Tyr 中的任一个；. 237位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个； . 238位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser>Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个； . 239位的氨基酸为 Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Thr、Val、Trp或Tyr中的任一个； .240位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个； .241位的氨基酸为Asp、Glu、Leu、Arg、Trp或Tyr中的任一个； .243位的氨基酸为Leu、Glu、Leu、Gin、Arg、Trp或Tyr中的任一个； .244位的氨基酸为His ； . 245位的氨基酸为Ala; .246位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； .247 位的氨基酸为 Ala、Phe、Gly、His、lie、Leu、Met、Thr、Val 或 Tyr 中的任一个； . 249位的氨基酸为Glu、His、Gln或Tyr中的任一个； . 250位的氨基酸为Glu或Gln中的任一个； .251位的氨基酸为Phe ； . 254位的氨基酸为Phe、Met或Tyr中的任一个； . 255位的氨基酸为Glu、Leu或Tyr中的任一个； . 256位的氨基酸为Ala、Met或Pro中的任一个； . 258位的氨基酸为Asp、Glu、His、Ser或Tyr中的任一个； . 260位的氨基酸为Asp、Glu、His或Tyr中的任一个； . 262位的氨基酸为Ala、Glu、Phe、Ile或Thr中的任一个； . 263位的氨基酸为Ala、lie、Met或Thr中的任一个；
39.权利要求29~38中任一项所述的方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
40.权利要求29~39中任一项所述的方法，其中，上述人FeY受体为Fe Y RIa,Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
41.权利要求29~39中任一项所述的方法，其中，上述人FeY受体为FcyRIIb。
42.权利要求36~41中任一项所述的方法，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 238位的氨基酸为Asp，或 328位的氨基酸为Glu。
43.抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a广(f)的步骤: (a)获得在高钙离子浓度条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤； (b)获得在低钙离子浓度条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤； (C)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤； (d)使编码在(C)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码FeY受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域； (e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及 (f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
44.抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a广(f)的步骤: (a)获得在高钙离子浓度条件下抗体对抗原的结合活性的步骤； (b)获得在低钙离子浓度条件下抗体的抗原结合活性的步骤； (C)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤； (d)使编码在(C)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码FeY受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围具有人FcRn结合活性，且在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域； (e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及 (f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
45.抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a广(f)的步骤: (a)获得在pH中性范围条件下抗原结合结构域对抗原的结合活性的步骤； (b)获得在pH酸性范围条件下抗原结合结构域的抗原结合活性的步骤； (C)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗原结合结构域的步骤； (d)使编码在(C)中选择的抗原结合结构域的多核苷酸与编码FeY受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在PH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域； (e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及 (f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
46.抗原结合分子的制备方法，该方法包括以下(a广(f)的步骤: (a)获得在pH中性范围条件下抗体对抗原的结合活性的步骤； (b)获得在pH酸性范围条件下抗体对抗原的抗原结合活性的步骤；(C)选择在(a)中获得的抗原结合活性高于在(b)中获得的抗原结合活性的抗体的步骤； (d)使编码在(C)中选择的抗体的抗原结合结构域的多核苷酸与编码FeY受体结合结构域的多核苷酸连接的步骤，所述Fe Y受体结合结构域是:在pH酸性范围条件下具有人FcRn结合活性，且在pH中性范围条件下Fe Y受体结合活性与EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区的Fe Y受体结合活性相比高的Fe Y受体结合结构域； (e)培养导入了有效连接有在(d)中获得的多核苷酸的载体的细胞的步骤；以及 (f)从在(e)中培养的细胞培养液中回收抗原结合分子的步骤。
47.权利要求43~46中任一项所述的制备方法，其中，上述抗原为可溶型抗原。
48.权利要求43~47中任一项所述的制备方法，其中，上述FeY受体结合结构域含有抗体的Fe区。
49.权利要求48所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中选自以下的至少一个以上的氨基酸与天然型Fe区的对应位点的氨基酸不同的Fe区:221位、222 位、223 位、224 位、225 位、227 位、228 位、230 位、231 位、232 位、233 位、234 位、235位、236 位、237 位、238 位、239 位、240 位、241 位、243 位、244 位、245 位、246 位、247 位、249位、250 位、251 位、254 位、255 位、256 位、258 位、260 位、262 位、263 位、264 位、265 位、266位、267 位、268 位、269 位、270 位、271 位、272 位、273 位、274 位、275 位、276 位、278 位、279位、280 位、281 位、282 位、283 位、284 位、285 位、286 位、288 位、290 位、291 位、292 位、293位、294 位、295 位、296 位、297 位、298 位、299 位、300 位、301 位、302 位、303 位、304 位、305位、311 位、313 位、315 位、317 位、318 位、320 位、322 位、323 位、324 位、325 位、326 位、327位、328 位、329 位、330 位、331 位、332 位、333 位、334 位、335 位、336 位、337 位、339 位、376位、377 位、378 位、379 位、380 位、382 位、385 位、392 位、396 位、421 位、427 位、428 位、429位、434位、436位和440位。
50.权利要求49所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有选自以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 221位的氨基酸为Lys或Tyr中的任一个； 222位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 223位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Lys中的任一个； 224位的氨基酸为Phe、Trp、Glu或Tyr中的任一个； 225位的氨基酸为Glu、Lys或Trp中的任一个； 227位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 228位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个； 230位的氨基酸为Ala、Glu、Gly或Tyr中的任一个； 231位的氨基酸为Glu、Gly、Lys、Pro或Tyr中的任一个； 232位的氨基酸为Glu、Gly、Lys或Tyr中的任一个；
233位的氨基酸为 Ala、Asp、Phe、Gly、His、lie、Lys、Leu、Met、Asn、Gin、Arg、Ser> Thr>Val、Trp或Tyr中的任一个；
234位的氨基酸为 Ala、Asp、Glu、Phe、Gly、His、lie、Lys、Met、Asn、Pro、Gin、Arg、Ser>
51.权利要求43~50中任一项所述的制备方法，其中，上述EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgG的Fe区是:EU编号297位连接的糖链为含岩藻糖糖链的天然型人IgGl、天然型人IgG2、天然型人IgG3或天然型人IgG4的任一个的Fe区。
52.权利要求43~51中任一项所述的制备方法，其中，上述人Fcy受体为FcyRIa、Fe Y RIIa(R) ,Fe Y RIIa(H) ,Fe Y RIIb, Fe Y RIIIa(V)或 Fe YRIIIa(F)。
53.权利要求43~51中任一项所述的制备方法，其中，上述人FeY受体为FcyRIIb。
54.权利要求48~53中任一项所述的制备方法，其中，上述Fe区是在Fe区的以EU编号表示的位点中含有以下的至少一个以上的氨基酸的Fe区: 238位的氨基酸为Asp，或 328位的氨基酸为Glu。
【文档编号】A61P37/02GK103974721SQ201280058920
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年9月30日
【发明者】井川智之, 前田敦彦, 原谷健太, 岩柳有起, 橘达彦 申请人:中外制药株式会社