加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物的制作方法
【专利摘要】[问题]为了提供具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，其中所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。[解决手段]发现经由包括合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤，及连接所述加成糖链肽片段与至少2个肽片段的步骤的方法，即可制作具有均一糖链结构且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽。
【专利说明】加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物
【技术领域】
[0001]本发明是有关加成糖链的多肽及含有该多肽的医药组合物。
【背景技术】
[0002]天然的人类干扰素β (IFN-β)为由166个氨基酸残基构成的糖蛋白质。干扰素β为属于细胞因子家族，已知参与免疫调节作用、抗病毒活性、细胞增殖抑制作用。此外，人类干扰素β在其氨基酸序列的第17位、31位、141位具有3个Cys，在第80位的天冬酰胺具有I个复合型N结合型的寡糖。此外，已知在第31位及141位的Cys具有二硫键。作为药剂的干扰素β利用细胞表达系统制造，根据用于表达的宿主不同，分类为IFN-P-1a或IFN-13_lb。IFN-13-la为糖蛋白质，而IFN-13-lb不具有寡糖。而已知，具有糖链的IFN-β-1a与IFN-β -1b相比，在免疫原性、抗病毒活性及抗肿瘤特性方面具有更强力的效倉泛。
[0003]此处，糖蛋白质中所含的糖链结构已知对于药物动力学具有强的影响力。尤其，已知在糖链的非还原末端有无唾液酸存在，对于延长血中半衰期方面有影响。然而，有报道指出至今生物合成的IFN-P-1a在其多肽中所具有糖链的结构为不均一的(例如经由CE-TOF-MS分析糖链结构不均一性的结果记载于非专利文献I)。此外，对于从合成的IFN-β或天然存在的IFN-β分离糖链结构实质上均一的IFN-β则均无报道。导致在推测何种糖链结构在生物活性上重要时有障碍。
[0004]近年来，利用细胞表达系统的生物技术可制造含有干扰素，如胰岛素、红细胞生成素(Erythropoietin) >G-CSF的生物活性蛋白质制剂。有报道指出对于这些蛋白质制剂中，蛋白质之糖基化模式对于如折叠步骤、构象特性(conformat1n property,)、稳定性、免疫反应、血中半衰期及生物体系中蛋白质功能等蛋白质的物理特性或化学特性造成变化(非专利文献2)。此外，若考虑到经由非人类型糖链产生的重大免疫原性，加成于这些蛋白质制剂的糖链的结构则优选为人类型的糖链。
[0005]这些糖蛋白质制剂其唯一的方法是经由细胞表达系统制造。然而，这些细胞表达系统的技术，如上所述，不能控制到糖链的结构，其结果，造成所制造的糖蛋白质中糖链的结构的不均一性(例如，非专利文献3)。因此，有制造批次间的质量差异性或糖链不能最优化等的问题。因此，长期期待可容易调整糖链结构的均一糖蛋白质的制备方法，但至今，对于经由化学合成，在活体内显示生物活性的人类型均一糖蛋白质的合成尚无报道。
[0006]此外，根据这样的细胞表达系统的技术制造的生物活性的糖蛋白质有可能含有病毒或遗传物质。此外，在使用从源自生物的样品所制备的糖链合成生物活性的糖蛋白质时，这些遗传物质等有可能混入。为了制造安全的蛋白质制剂，期待有可适用将这些遗传物质分解的加热处理法。然而，现今对于生物活性的糖蛋白质制剂的加热处理会使糖蛋白质失去活性，对于适用的加热处理法尚无报道。
[0007]现有技术文献
[0008]非专利文献
[0009]非专利文献1:Anal B1anall Chem(2011)400:295-303
[0010]非专利文献2:Nat.B1technol.，2006，24，1241-1252
[0011]非专利文献3:J.B1technol, 42, 117-131(1995)
【发明内容】
[0012](发明要解决的问题)
[0013]本发明的目的是提供具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。
[0014](解决问题的手段)
[0015]本发明的发明人等为了解决上述问题进行深入研究，结果成功地制造具有均一糖链结构的加成糖链的多肽，所述加成糖链的多肽具有干扰素β活性。
[0016]亦即，本发明是有关加成糖链的多肽，其是选自由
[0017](a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽；
[0018](b)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
[0019](C)干扰素β的类似物；及
[0020](d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0021]所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽；其特征为上述加成糖链的多肽具有实质上均一的糖链。
[0022]此处，于本发明加成糖链的多肽之一个实施方案，其特征为上述加成糖链的多肽系经由化学合成制作的。
[0023]此外，本发明的另一方面为经由包含:合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤，以及将上述加成糖链的肽片段与上述至少2个肽片段连接的步骤的方法，而获得的加成糖链的多肽，且
[0024]上述加成糖链的多肽是选自由
[0025](a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽；
[0026](b)在由列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
[0027](C)干扰素β的类似物；及
[0028](d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0029]所组成的组的多肽，其中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性。
[0030]此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，加成糖链的多肽为经由包含:合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段之步骤，及将上述加成糖链的肽片段与上述至少2个肽片段连接的步骤的方法而获得的加成糖链的多肽，
[0031]上述加成糖链的多肽是选自由
[0032](a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽；
[0033](b)在由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽；
[0034](c)干扰素β的类似物；及
[0035](d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽；
[0036]所组成的组的多肽，其中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性。
[0037]此处，在本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，其特征为上述加成糖链的多肽中的糖链为天冬酰胺结合型糖链。
[0038]此外，于本发明加成糖链的多肽的一个实施方案中，其特征为上述加成糖链的多肽中的糖链为下述式(a)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链。
[0039][化学式I]
[0040]
【权利要求】
1.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是在选自由 (a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽； (b)在由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽； (C)干扰素β的类似物；及 (d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽，且所述加成糖链的多肽具有实质上均一的糖链。
2.如权利要求1所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽经由化学合成而制备。
3.加成糖链的多肽,所述加成糖链的多肽为经由包括合成加成糖链的肽片段、至少2个肽片段的步骤、及将所述加成糖链的肽片段与所述至少2个肽片段连接的步骤的方法而获得的加成糖链的多肽，其特征在于， 所述加成糖链的多肽是在选自由 (a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽； (b)在由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽； (C)干扰素β的类似物；及 (d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链，且具有干扰素β活性的加成糖链的多肽。
4.如权利要求3所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽中的糖链为天冬酰胺结合型糖链。
5.如权利要求4所述的加成糖链的多肽,其中，所述加成糖链的多肽中的糖链为下述式(a)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链， [化学式I]
(a)[化学式2]
6.如权利要求3至5中任一项所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽在相当于干扰素β第31位及第141位的Cys形成二硫键。
7.如权利要求3至6中任一项所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽经加热处理。
8.如权利要求1或2所述的加成糖链的多肽，其中，所述加成糖链的多肽具有90%以上的纯度。
9.组合物，所述组合物含有如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽，其特征在于，所述组合物中的加成糖链的多肽是实质上均一的。
10.如权利要求9所述的组合物，其中，所述组合物中的加成糖链的多肽90%以上是均一的。
11.如权利要求9或10所述的组合物，其中，所述组合物中加成糖链的多肽具有90%以上的纯度。
12.医药组合物，其特征为含有: (I)如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽及/或其药学上可接受的盐，及 (II )药理学上可接受的载体。
13.如权利要求12所述的医药组合物，其中， 于所述加成糖链的多肽中，糖链实质上是均一的。
14.如权利要求13所述的医药组合物，其中， 于所述加成糖链的多肽中，糖链90%以上是均一的。
15.如权利要求12至第14中任一项所述的医药组合物，其中，所述加成糖链的多肽具有90%以上的纯度。
16.如权利要求12至15中任一项所述的医药组合物，其特征在于， 所述医药组合用于治疗或预防干扰素β相关的疾病。
17.如权利要求16所述的医药组合物，其中， 所述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤在内的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少I种疾病。
18.干扰素β相关的疾病的治疗或预防方法，其特征在于，施用有效量的如权利要求1至7中任一项所述的加成糖链的多肽。
19.如权利要求18所述的治疗或预防方法，其中， 所述干扰素β相关的疾病为选自由包含多形性胶质母细胞瘤、成神经管细胞瘤及星形细胞瘤在内的脑肿瘤、皮肤恶性黑色素瘤、B型慢性活动性肝炎、C型慢性肝炎、亚急性硬化性全脑炎、C型代偿性肝硬化及多发性硬化症所组成的组的至少一种疾病。
20.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是在选自由 (a)由序列编号I表示氨基酸序列构成的多肽； (b)在由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽； (C)干扰素β的类似物 '及 (d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的多肽； 所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且是在相当于干扰素β第17位、31位及141位的Cys经保护基保护的加成糖链的多肽。
21.如权利要求20所述的加成糖链的多肽，其中，所述糖链为下述式(c)表示的二唾液酸糖链或下述式(b)表示的去唾液酸糖链: [化学式3]
式中，R 表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph (OMe) 2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph (NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基、Me表示甲基、Ph表不苯基； [化学式4]
22.如权利要求20或21所述的加成糖链的多肽，其中，在相当于所述干扰素β第17位、31位及141位的Cys被选自由Acm基、烷氧基甲基、三苯基甲基、叔丁基、苯甲基及β位经取代的乙基所组成的组的任一种保护基保护。
23.加成糖链的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖链的多肽的制造方法包括:在权利要求20至22中任一项所述的加成糖链的多肽中，对经保护基保护的相当于所述干扰素β第17位、31位及141位的Cys进行脱保护的步骤。
24.如权利要求23所述的加成糖链的多肽的制造方法，其中，在将Cys的保护基脱保护之前，对所述加成糖链 的多肽进行加热处理。
25.加成糖链的多肽，其特征在于，所述加成糖链的多肽是选自由 (a)由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽； (b)在由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽中，I个或多个氨基酸缺失、经取代或经加成的多肽； (C)干扰素β的类似物 '及 (d)相对于由序列编号I表示的氨基酸序列构成的多肽，具有80%以上同源性的加成糖链的多肽； 所组成的组的多肽中，在相当于干扰素β中第80位的氨基酸具有糖链的加成糖链的多肽，且 所述糖链为下述式(c)表示的存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基经保护的二唾液酸糖链 [化学式5]
式中，R 表示-COOBn、-COOEt、-COOMe、-COOCH2COPh、-COOCH2PhOMe、-COOCH2Ph (OMe) 2、-COOCH2PhNO2或-COOCH2Ph (NO2)2，而且，式中，Bn表示苯甲基，Et表示乙基，Me表示甲基，Ph表不苯基。
26.加成糖链的多肽的制造方法，其特征在于，所述加成糖链的多肽的制造方法包括对在权利要求25所述的加成糖链的多肽中的存在于糖链非还原末端的唾液酸的羧基的保护基进行脱保护的步骤。
27.如权利要求23、24及26中任一项所述的加成糖链的多肽的制造方法，其中，所述加成糖链的多肽的制造方法进一步包括将所述加成糖链的多肽进行折叠的步骤。
【文档编号】A61K38/21GK104080803SQ201280058952
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2012年9月28日 优先权日:2011年10月1日
【发明者】坂本泉, 深江一博, 手塚克成, 田鹤圭亮, 前田政敏, 梶原康宏, 辻孝 申请人:株式会社糖锁工学研究所