使用对受体的亲和力增加的突变型light分子用于癌症治疗的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】公开了使用与靶向试剂连接、融合或缀合的LIGHT蛋白质的具体形式靶向肿瘤细胞的方法和组合物。这些组合物与人和小鼠受体两者结合，其亲和力足以进行临床前和临床试验，并且与野生型人LIGHT蛋白质相比较具有增加的亲和力。LIGHT的具体形式对肿瘤细胞的靶向减少肿瘤生长并减少转移。
【专利说明】使用对受体的亲和力增加的突变型LIGHT分子用于癌症治 疗的方法和组合物
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C. § 119(e)要求于2011年12月15日提交的美国临时专利申 请号61/576, 222的优先权利益。引用的申请中所述的公开内容，包括如最初提交给美国专 利与商标局的所有信息，整体通过引用并入本文作。
[0003] 序列表
[0004] 本专利申请含有已经由EFS-Web以ASCII形式提交并在此整体引入作为参考的序 列表。所述ASCII拷贝于2012年12月5日创建，命名为700286_SEQ_ST25. txt并且大小 为54,899字节。
【背景技术】
[0005] 公开了使用与靶向试剂连接、融合或缀合的LIGHT蛋白质的具体形式靶向肿瘤细 胞的方法和组合物。这些组合物与人和小鼠受体两者结合，其亲和力足以进行临床前和临 床试验，并且与野生型人LIGHT蛋白质相比较具有增加的亲和力。LIGHT的具体形式对肿瘤 细胞的靶向减少肿瘤生长并减少转移。
[0006] 在免疫活性宿主中浸润已建立的肿瘤的少量活化T细胞帮助解释宿主处置肿瘤 的无能。在动物模型中的实验以及临床研究指示免疫系统可以识别并杀死个别肿瘤细胞， 但宿主一般不能根除已建立的实体瘤。存在可能是宿主有效响应已建立的肿瘤的失败的 几种解释：1)由于转移至淋巴样组织的肿瘤细胞（尤其是非造血起源的那些）数目的不 足够，由于在淋巴样组织中的弱直接或间接呈递，缺乏早期T细胞引发（priming) ;2)由于 在肿瘤组织周围的生物学障碍，迁移至肿瘤位点的免疫细胞的数目不足够；3)由于储库有 限，耗尽或短命的活化抗原特异性T细胞未能对抗肿瘤生长；4) T细胞对肿瘤的无应答性或 忽略；5)抑制性微环境或在肿瘤内缺乏活化免疫系统的刺激。
[0007] 在临床上，增加 T细胞对肿瘤部位的浸润与更佳的预后紧密相关。存在预防性疫 苗接种在诱导接种的肿瘤细胞排斥中有效的报道。然而，在肿瘤生长已建立后，治疗疫苗通 常未能排斥肿瘤。肿瘤的手术减少不增强对肿瘤的免疫应答。此外，据报道即使在肿瘤细 胞上的强抗原的表达也不足以促进已建立的肿瘤的排斥，尽管在淋巴样组织中存在过量数 目的抗原特异性T细胞。引发和/或浸润已建立的肿瘤的T细胞缺乏是针对抗原性癌症的 天然或治疗方法的主要障碍之一。另外，在肿瘤组织内部的共刺激分子的表达不充分可能 未能活化浸润T细胞，并且导致肿瘤反应性T细胞的无能。
[0008] 早期T细胞引发的缺乏可能由于仅少数肿瘤细胞从实体组织迁移到淋巴样组织 用于直接呈递。使用骨髓嵌合体的遗传分析已揭示用于引发MHC-I限制性CD8+T细胞的两 种抗原呈递模式。直接引发由T细胞与合成具有抗原表位的蛋白质的细胞的接合介导，而 交叉引发由吸收通过其他细胞合成的抗原的宿主抗原呈递细胞介导。肿瘤特异性T细胞被 引发的机制已进行热烈讨论，并且至今仍然没有定论。理解肿瘤抗原如何并在哪里呈递给 T细胞将帮助找到针对肿瘤的治疗作用。
[0009] LIGHT(与淋巴毒素同源，显示出可诱导的表达，并且与HSV糖蛋白D竞争疱 疹病毒进入介质，由T淋巴细胞表达的受体）是TNF配体超家族的II型跨膜糖蛋白。 LIGHT (TNFSF14)是与淋巴毒素 β受体（LTiiR)和疱疹病毒进入介质相互作用的肿瘤坏死 因子（TNF)家族成员，其主要分别在基质细胞和T细胞上表达。LTiiR发信号是组构的淋巴 样结构形成所需的，这可以至少部分由于其诱导趋化因子和粘附分子表达的能力，所述趋 化因子和粘附分子吸引淋巴样器官中的幼稚T细胞和树突状细胞（DC)。在体内通过LIGHT 刺激基质细胞上的LT β R导致CCL21的表达，所述CCL21在不存在LTaB (LT β R的另一种配 体）的情况下吸引脾脏的T细胞区域中的幼稚T细胞。这些结果证实LIGHT能够与LTiiR 相互作用，以调节CCL21趋化因子表达。另外，LIGHT显示出用于T细胞引发和扩增的有力 的CD28不依赖性共刺激活性，导致针对肿瘤增强的T细胞免疫和/或增加的自身免疫。经 由LTiiR发信号是组构的淋巴样组织形成所需的。淋巴毒素 B受体（LTPR)在淋巴样结构 形成中起重要作用。LTiiR通过TNF家族的两个成员：膜淋巴毒素 B和LIGHT活化。LTiiR 在淋巴结（LN)的形成以及次级淋巴样器官中的T、B区带的不同组构中起关键作用。经由 LT β R发信号调节次级淋巴样器官的趋化因子和粘附分子表达。趋化因子和粘附分子控制 脾脏中DC和淋巴细胞的迁移和定位。在非淋巴样组织中可溶性LT或TNF的过表达足以促 进肝内淋巴样新生。
[0010] LIGHT也已被称为HVEM-L和LT- γ。在新TNF命名法下，它被称为TNFSF14。LIGHT 是240个氨基酸（aa)的蛋白质，其含有37aa的细胞质结构域、22aa的跨膜区和181aa的细 胞外结构域。类似于其他TNF配体家族成员，LIGHT预测装配为同三聚体。LIGHT由活化T 细胞产生，并且首先通过其与HSV糖蛋白D竞争HVEM结合的能力得到鉴定。LIGHT也已显 示与淋巴毒素 B受体（LTPR)和诱饵受体（DcR3TR6)结合。
[0011] LIGHT在T细胞活化和淋巴样组织形成中起独特作用。LIGHT和LT β R之间的相 互作用恢复LT α +小鼠的脾脏中的淋巴样结构。另外，LIGHT的上调引起T细胞活化并迁 移到非淋巴样组织，提供淋巴样结构的形成。相反，LIGHT+小鼠显示受损的T细胞活化和 延迟的心脏排斥。因此，LIGHT是有力的共刺激分子，其也促进淋巴样组织的形成，以增强 局部免疫应答。在引流淋巴样组织中幼稚T细胞的有效引发的缺乏和在肿瘤内扩增肿瘤特 异性T细胞的无能阻止癌症的根除。
[0012] 微小转移灶（显微镜可见的癌细胞的小聚集体）可以在异质原发性肿瘤发育中的 极早期变得建立，并且在其临床检测到之前种植远侧组织部位。例如，当原发性肿瘤大小极 小时，可以观察到在乳腺癌中的可检测转移灶。因此，在诊断时，许多癌症患者已经具有微 观转移灶，该观察已导致用于具有实体瘤的患者的手术后佐剂治疗的发展。尽管这些进展， 成功仍是有限的，并且转移性疾病的最佳治疗仍在癌症治疗中构成显著挑战。
[0013] 多种人和鼠癌症已证明为抗原性的，并且能够由T细胞识别。肿瘤反应性T细胞 理论上可以找出并破坏肿瘤抗原阳性癌细胞，并且放过周围健康组织。然而，针对人中的恶 性肿瘤的天然存在的T细胞应答通常不足以引起肿瘤，原发性肿瘤或转移灶的消退。已报 道散发性自发性、但免疫原性肿瘤，通过诱导T细胞耐受而避免破坏。然而，肿瘤抗原特异 性T细胞的活化可完全阻止自发性肿瘤的发展。因此，在原发性肿瘤治疗时破坏耐受并生 成能够拒绝肿瘤的此类T细胞代表清除转移性肿瘤细胞的潜在方法。因为抗原丧失的变体 可以在免疫压力下逃避，所以不依赖于特异性肿瘤抗原的了解，免疫治疗应是可应用的。
[0014] 从免疫学角度来看，目前的临床策略妨碍针对恶性肿瘤的免疫防御，并且进一步 减小免疫治疗的有效性。尽管肿瘤的去除可以逆转肿瘤诱导的免疫抑制，但在免疫治疗之 前原发性肿瘤的手术切除还去除抗原的主要来源，这可以导致细胞毒性T淋巴细胞（CTL) 活化的减少，因为引发的效率与肿瘤抗原负荷关联。另外，意欲杀死残留肿瘤细胞的，包括 化学治疗和放射治疗的目前辅助治疗，实际上可以通过破坏或抑制T细胞而损害抗肿瘤免 疫应答。
[0015] 转移性疾病是癌症中的发病率和死亡率的主要原因。虽然手术、化学疗法或辐射 通常可以控制原发性肿瘤生长，但弥散性转移灶的成功根除仍是罕见的。一个未解决的问 题是此类应答是否允许新来的CTL被教育，并且随后离开肿瘤部位。另一个未解决的问题 是这些CTL随后是否可以巡察并有效消除在周围的自发性转移的肿瘤细胞。肿瘤用LIGHT 的局部治疗生成很多肿瘤特异性CTL，其离开原发性肿瘤并浸润远侧肿瘤，以完全根除先前 存在的自发性转移灶。
[0016] 如上所述，针对人中的恶性肿瘤的天然存在的T细胞应答通常不足以引起肿瘤、 原发性肿瘤或转移细胞的消退。免疫疗法将有可能引发肿瘤反应性T细胞，其可以寻找并 破坏弥散性肿瘤抗原阳性癌细胞，同时放过周围健康组织，但荷瘤宿主的主动疫苗接种仅 显示有限的利益。大多数肿瘤中充分确定的抗原的缺乏限制主动疫苗接种或过继转移治 疗。即使不测定特异性肿瘤抗原也有效的免疫疗法将是更可应用的以及在治疗上更可行 的。然而，仍不明确何时和如何增强针对肿瘤组织的主动免疫应答。
[0017] 幼稚或效应记忆T细胞可以通过主动过程离开周围并进入引流淋巴结内。尚未知 召募至原发性肿瘤的足够数目的肿瘤特异性CTL是否可以存活并离开微环境，以巡察周围 组织并根除弥散性转移灶。另外，开发有效免疫治疗中的挑战是设计增加循环肿瘤特异性T 细胞的数目或增强循环肿瘤特异性T细胞的功能的方法，所述循环肿瘤特异性T细胞可以 在微观转移细胞变得临床上有意义之前检测并破坏它们。LIGHT递送到原发性肿瘤内可以 帮助生成CTL，所述CTL随后可以离开局部肿瘤并且巡察周围组织，以在转移灶在临床上有 意义之前根除它们。
[0018] 批准的乳腺癌治疗包括手术、辐射、化学疗法（例如多柔比星、紫杉醇）、发信号抑 制剂（例如拉帕替尼、奈拉替尼）和单克隆抗体（例如曲妥珠单抗、帕妥珠单抗）。赫赛 汀（曲妥珠单抗）是批准的用于乳腺癌的抗Her2抗体疗法。Her2(人表皮生长因子受体 2(c-erbB2或neu)在25-30%的人乳腺癌中是扩增的。Her2的过表达与预后不良相关。
[0019] 采用在人IgG构架上的鼠抗原结合残基的靶向Her2的人源化单克隆抗体在1998 年由FDA批准用于单一疗法。总体应答率对于单一疗法在11. 6-35%之间。
[0020] 然而，存在关于抗Her2抗体疗法的问题。对于抗Her2/neu疗法，存在低于所需的 治疗成功和大量无应答率。抗Her2/neu疗法需要连同化学疗法一起的延长治疗才有效。大 多数患者发展抗性并且在一年内复发，并且治疗可以花费超过$100, 000USD。
[0021] 几种策略可以改善治疗抗体功效：
[0022] a.细胞毒性或免疫调节性免疫细胞因子（IL-2、LIGHT等）；
[0023] b.药物缀合物（化学药物）；
[0024] c.修改Fc介导的效应，例如改变抗体同种型；
[0025] 修饰亲和力或改变Fc受体结合；和增加半衰期。
[0026] 对抗原-抗体结合或设计的改善可通过下述寻求：
[0027] a.更高的亲和力
[0028] b.增加或降低的内在化
[0029] c.增加的抗体稳定性
[0030] d.双特异性、三特异性抗体。
[0031] 在本公开内容中，与使用野生型LIGHT的先前结果相比较，不只用野生型LIGHT还 用LIGHT的多种具体形式靶向肿瘤生成针对原发性肿瘤和转移灶的强免疫。
【发明内容】
[0032] 用与针对肿瘤的靶向试剂连接、融合或缀合的LIGHT的具体形式例如突变型 LIGHT蛋白质、肽或其片段靶向肿瘤细胞减少肿瘤的生长，并且还减少转移包括微小转移。 靶向试剂包括抗体。进一步地，与针对肿瘤抗原的抗体连接的细胞因子可针对微小转移使 用。
[0033] LIGHT，TNF家族成员，是复杂分子网络的部分，并且是用作免疫细胞因子的极佳候 选物。（图8)
[0034] LIGHT (TNFSF14)在淋巴样组织、未成熟DC和活化T细胞上作为三聚体表达。
[0035] LIGHT结合靶细胞上的LTbR和HVEM。
[0036] LIGHT还结合由许多肿瘤分泌的在人中的可溶性诱饵受体3。
[0037] TNF家族成员的相互影响控制免疫调节。LIGHT的三管齐下活性使得其成为用作 免疫细胞因子的极佳候选物=LIGHT结合LT β R和HVEM两者用于免疫调节；与LT β R相互 作用以增加趋化因子和粘附分子；并且吸引T细胞。它通过HVEM活化T细胞和NK细胞用 于增加的免疫功能和肿瘤免疫；并且指导LT β R或HVEM表达肿瘤的细胞凋亡。（图9)
[0038] 使用腺病毒方法和以融合蛋白形式的LIGHT对肿瘤的递送在减少肿瘤大小和控 制转移方面是有效的。（图10,11)(表1)然而，使用LIGHT的融合构建体的产生已经是 有问题的。存在关于scFV(neu)-mLIGHT融合物的聚集和低生产问题。另外，在鼠模型 中难以显示有效性，因为与野生型LIGHT或小鼠 LIGHT相比较，人LIGHT构建体，例如抗 neu (Fab) -hLIGHT对小鼠受体具有减少的结合亲和力。
[0039] 因此，改造了具有增加的稳定性和亲和力的LIGHT分子，其可以用于生成 scFV (neu) -LIGHT融合蛋白或其他融合蛋白，所述融合蛋白可以在体外和体内在疾病的小 鼠模型和人中进行测试。
[0040] 此外，公开了新突变型人LIGHT分子，其以比野生型人LIGHT (hLIGHT)更大的亲和 力与LIGHT的小鼠受体结合，并且与野生型人LIGHT相比较，与LIGHT的人受体具有相等或 更大的结合。公开了对抗体介导的癌症治疗和用于癌症治疗的免疫疗法的改善。如本文使 用的"野生型"指表征来源哺乳动物例如人、小鼠中的序列的氨基酸或核酸序列。
[0041] 对产生改善的LIGHT和改善的LIGHT靶向试剂融合构建体的解决方案部分通过 下述步骤实现：人LIGHT (hLIGHT)( "野生型"）用作改造的平台，因为它比小鼠 LIGHT更稳 定。将hLIGHT改造为具有与鼠 LTbR和HVEM OnLTbR和mHVEM)以及人LTbR和HVEM (hLTbR 和hHVEM)相等或更大的结合，以及改善的表达和稳定性，以易于生产并增加治疗效果（图 17,18)。在这个意义上，经改造的LIGHT分子"衍生"自LIGHT。
[0042] hLIGHT进行改造，并且鉴定了具有增加的小鼠 LT PR和小鼠 HVEM结合（图21)以 及与人LTiiR和人HVEM的有利结合的克隆（图23)。与小鼠和人受体的结合的证实在CHO 细胞中产生的scFV-LIGHT融合物中进行（图23)。人突变型LIGHT构建体在体外作为融合 蛋白进行测试。如通过细胞计数和MTS测量的，与单独的7164抗体或单独的人LIGHT相比 较，7164-m4-14LIGHT (其为新的与ScFV(neu)融合的更高亲和力的人突变型LIGHT分子之 一）明显更佳地减慢TUBO细胞的生长。（图25, 26)
[0043] 人突变型LIGHT构建体在体外和体内在腺病毒构建体中就其刺激宿主免疫应答 的潜在功能进行测试（图29)。人LIGHT突变体m4-14细胞外结构域连同编码抗neu抗体 片段的单链片段（scFv) -起递送（ad-neu-突变型LIGHT)。与含有未经修饰的人LIGHT细 胞外结构域的构建体（ad-neu-人LIGHT)相比较，ad-neu-突变型LIGHT在体内和体内改 善针对neu的CD8+CTL应答（图30-32, 35)。与含有ad-neu-人LIGHT的构建体相比较， ad-neu-突变型LIGHT也刺激增加数目的抗neu抗体的产生（图33)。当作为抗癌疫苗进行 测试时，ad-neu-突变型LIGHT在预防肿瘤方面比仅含neu的疫苗更有效（图34)，并且具 有增加的neu特异性细胞杀死（图36)。LIGHT可以经由HVEM受体刺激NK细胞产生IFN， 同时经由LTbR刺激MEF以产生IL-6。图37证实突变型LIGHT在Rag-I-脾细胞中诱导比 Wt LIGHT高得多的IFN-γ生产。图38证实突变型LIGHT在MEF细胞中诱导比Wt人LIGHT 更高的IL-6生产。因此，突变型LIGHT是比Wt LIGHT更强的刺激物。
[0044] 在手术前经由抗体-人-突变型LIGHT融合物、人突变型LIGHT的腺病毒递送 或缀合组合物在肿瘤组织中诱导免疫应答，生成足够的引发抗原特异性效应T细胞，其 离开肿瘤并根除转移灶。对癌症抗原特异性的抗体和对蛋白酶消化抗性的LIGHT(例如 在LIGHT的位置81-84区域中的突变型LIGHT形式）也可以分开施用。在手术切除前用 TNFSF14(LIGHT)靶向原发性肿瘤是引发用于根除自发转移灶的更佳免疫应答的新策略。用 人突变型LIGHT治疗的处理减慢侵袭性肿瘤的生长。
[0045] 适合于癌症治疗的组合物包括与人LIGHT蛋白质的片段连接、融合或缀合的肿瘤 特异性抗体，其中LIGHT片段对肿瘤环境中的蛋白酶消化是抗性的，并且足以诱导针对肿 瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞。
[0046] 合适的组合物包括肿瘤特异性靶向试剂和相对于人野生型序列具有突变的突变 型LIGHT氨基酸序列（图6和7)，或与人突变型LIGHT蛋白质的片段连接的肿瘤特异性靶 向试剂。靶向试剂和人突变型LIGHT蛋白质的片段可以形成融合蛋白，或LIGHT蛋白质的 片段可以与靶向试剂或靶向试剂的片段化学缀合或以其他方式连接。
[0047] 组合物包括通过合适的方法例如直接注射、腺病毒载体、微球体或纳米颗粒递送 至肿瘤的能力。
[0048] 衍生自LIGHT蛋白质的任何肽片段包括重组肽、合成肽、重组LIGHT蛋白质、突变 型LIGHT蛋白质、截短的LIGHT蛋白质、LIGHT的细胞外结构域、LIGHT的保守结构域、类似 LIGHT结构域的肽模拟物、具有经修饰的氨基酸的LIGHT蛋白质或其肽，通过使其与肿瘤特 异性试剂例如抗体或其片段连接、融合或缀合而适用于诱导免疫应答，条件是LIGHT片段 能够稳定存在于肿瘤细胞表面上，并且对于LIGHT的小鼠和人受体具有增加的亲和力。 [0049] 合适的组合物包括人源化单克隆抗体或嵌合抗体或异微型抗体 (heterominibody)或单链抗体。
[0050] 与LIGHT结合使用的抗体片段足以识别肿瘤抗原。片段足以刺激细胞毒性T淋巴 细胞。
[0051] LIGHT的片段可以包括LIGHT的约100-150个氨基酸。
[0052] LIGHT的片段可以具有对应于LIGHT的位置约85-240的氨基酸序列。LIGHT的片 段还可以包括LIGHT的约100-150个氨基酸。LIGHT的片段可以包括来自LIGHT的位置约 90-240的氨基酸序列。LIGHT的片段可以包括来自LIGHT的位置约84-240或83-240或 82-240的氨基酸序列。
[0053] LIGHT的片段还可以包括LIGHT的约100-150个氨基酸，条件是该片段能够诱导针 对肿瘤细胞的免疫应答。LIGHT的片段可以包括来自LIGHT的位置约90-235的氨基酸序 列。
[0054] LIGHT的片段诱导蛋白酶抗性片段。LIGHT的片段可以包括在蛋白酶识别序列 EQLI (SEQ ID NO: 1)中的突变。
[0055] 包括新型人突变型LIGHT细胞外结构域的组合物适合于癌症治疗。公开了这样的 组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列中的至少一种的细胞外结构域：
[0056] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSY HDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYICRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLG GVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:2)〇
[0057] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0058] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLSGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLGERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:3)
[0059] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
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[0093] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
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[0095] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0096] RSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGCP LGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDGT RSYFGAFMV(SEQ ID NO:18)
[0097] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0098] RRSHEVNPAAHLTGANSNLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVQDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:19)
[0099] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0100] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:20)
[0101] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0102] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0103] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWEPQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLTRTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATPSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLMDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:21)
[0104] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0105] RGSHEVNPAAHLTGASSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEEVVVRVLDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:22)
[0106] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0107] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGRASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVQDERLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:23)
[0108] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0109] RSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLSFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLRGVGCP LGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSSLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRLMDGT RSYFGAFMV(SEQ ID NO:24)
[0110] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0111] RRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKTGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLAGTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLGKRLVRLRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO:20)
[0112] 公开了这样的组合物，其中LIGHT片段包括具有下述氨基酸序列的细胞外结构 域：
[0113] QRSHEVNPAAHLTGANSSPTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGC PLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSLQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERLVRPRDG TRSYFGAFMV(SEQ ID NO :25)
[0114] 与人和小鼠受体结合的新型人LIGHT细胞外结构域在图6、7和28中列出。本文公 开的LIGHT突变体在其生物学特性及其功效方面是出乎意料的。如图21中所示（"hLIGHT 突变体具有增加的与mLTbR和mHVEM的结合亲和力"），这些新突变体不仅具有增加的对于 小鼠 LIGHT受体的结合亲和力，与野生型人LIGHT相比较，还具有显著增加的对于人LIGHT 受体的结合亲和力。另外，与野生型人LIGHT相比较，这些突变体具有增加的稳定性。除 了其显著改善的交叉物种亲和力之外，这些突变体在细胞杀死方面还基本上比野生型人 LIGHT更有效，如图31和32中所示（超级LIGHT可以改善对neu的⑶8CTL应答--体内 杀死")。在本发明时本领域技术人员无法预测，可以生成会具有这些特性的LIGHT突变体。 图6和7显示许多突变体具有在214处突变为E的K，这也是小鼠序列中的情况。特别有利 的是突变体m4_14、m4_7和m4_16。
[0115] 减少原发性肿瘤的生长和/或癌症转移的方法包括下述步骤：
[0116] 施用包含与LIGHT的具体化中的至少一种例如片段连接的肿瘤特异性抗体的药 物组合物；和
[0117] 通过刺激针对肿瘤特异性T细胞的活化，减少原发性肿瘤的生长和/或癌症转移。
[0118] 该抗体识别表面肿瘤抗原，并且该抗体可以与LIGHT片段化学缀合或者与LIGHT 片段重组融合或以其他方式连接。
[0119] 包括抗体-LIGHT的药物组合物可以通过技术人员已知或本文公开的其他方法静 脉内施用。
[0120] 减少原发性肿瘤的生长和/或癌症转移的方法包括下述步骤：
[0121] (a)施用包含与LIGHT的至少一种具体形式连接的肿瘤特异性抗体的药物组合 物；
[0122] (b)在肿瘤部位处将编码其LIGHT具体形式的核酸分子引入个体内，其中LIGHT是 蛋白酶抗性的；和
[0123] (C)通过刺激针对肿瘤的肿瘤特异性T细胞的活化，减少原发性肿瘤的生长癌症 转移。
[0124] 核酸可以递送至先前存在的肿瘤部位或相对于先前存在的肿瘤部位远侧的部位。
[0125] 化学治疗剂还可以在抗体-LIGHT治疗过程中或之前或之后施用。
[0126] 放射疗法还可以在LIGHT治疗过程中或之前或之后施用。
[0127] 对肿瘤抗原特异性的抗体的具体形式可以选自HER2、HER4、HERB、STEAP、c-MET、 EGFR、甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原（ETA)、酪氨酸酶、黑 色素瘤相关抗原（MAGE)、ras或p53的异常产物、DcR3及任何其他抗癌抗原。
[0128] 减少原发性肿瘤的生长和/或癌症转移的方法包括下述步骤：
[0129] (a)施用包含肿瘤特异性抗体的药物组合物；
[0130] (b)在肿瘤部位处引入编码LIGHT蛋白质或其片段的核酸分子，其中LIGHT是蛋白 酶抗性的；
[0131] (c)在肿瘤细胞的表面上表达LIGHT蛋白质或其片段；和
[0132] (d)通过刺激针对肿瘤的肿瘤特异性T细胞的活化，减少肿瘤的生长和/或癌症转 移。
[0133] 公开了包括识别肿瘤抗原的肽区域和LIGHT蛋白质的片段的嵌合蛋白。试剂可以 是结合肿瘤表面受体的配体。
[0134] 描述了包括LIGHT蛋白质的片段和特异性识别肿瘤细胞的试剂的组合物。
[0135] 药物组合物包括与肿瘤特异性组分偶联的LIGHT肽片段。肿瘤特异性组分可以包 括针对肿瘤细胞表面中的受体的配体或识别肿瘤细胞表面上的配体的受体。
[0136] 治疗肿瘤（特别是实体瘤）的新型方法是通过使用突变型LIGHT分子产生淋巴样 微环境，其表达引发幼稚T细胞和扩增活化T细胞所需的趋化因子、粘附分子和共刺激分 子。生成针对肿瘤的更广泛的T细胞。抗体-LIGHT融合物或缀合物的直接递送针对肿瘤 和转移灶是有效的。与用对照治疗的肿瘤相比较，当抗体-LIGHT缀合物或融合产物靶向肿 瘤时，肿瘤体积在体内减少。
[0137] 在多种实施方案中，突变型人LIGHT具有在蛋白酶解位点中的氨基酸变化，所述 蛋白酶解位点包括来自天然LIGHT蛋白质的位置81-84的氨基酸序列EQLI(SEQ ID NO: 1)。 在一个实施方案中，突变型LIGHT不具有蛋白酶解位点，来自天然LIGHT蛋白质的位置 81-84 的氨基酸序列 EQLI (SEQ ID NO: 1)。
[0138] 在多种实施方案中，突变型人LIGHT具有在位置214处的氨基酸变化，其中在位置 214处的赖氨酸变成谷氨酸。
[0139] 公开的核酸分子编码包括细胞外结构域的重组LIGHT :
[0140] QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSY HDGALVVTKAGYYYIYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGG WHLEAGEKVWRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:26)。
[0141] 癌症转移通过细胞毒性T淋巴细胞的刺激和/或通过用于引发幼稚T细胞的趋化 因子、粘附分子和共刺激分子的刺激得到减少。T细胞在肿瘤部位内活化，并且可以在血液 中循环。循环T细胞优选是癌症特异性的。T细胞生成可以是CD8+依赖性的。
[0142] 分离的重组核酸包括编码蛋白酶消化抗性突变型LIGHT的核苷酸序列。核苷酸序 列的实施方案是：
[0143] ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGG CTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGC TGGGCTGGCCGTCCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACG GACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGG GCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCT CAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTG TGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTG GAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCT GGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTG ATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA(SEQ ID NO :27),
[0144] 其中编码蛋白酶消化位点的序列GAGCAGCTGATA(SEQ ID N0:28)是突变的。
[0145] 野生型人LIGHT DNA序列（编码蛋白酶位点EQLI (SEQ ID NO: 1)的序列以粗体显 示）：
[0146] ATGGAGGAGAGTGTCGTACGGCCCTCAGTGTTTGTGGTGGATGGACAGACCGACATCCCATTCACGAGG CTGGGACGAAGCCACCGGAGACAGTCGTGCAGTGTGGCCCGGGTGGGTCTGGGTCTCTTGCTGTTGCTGATGGGGGC TGGGCTGGCCGTCCAAGGCTGGTTCCTCCTGCAGCTGCACTGGCGTCTAGGAGAGATGGTCACCCGCCTGCCTGACG GACCTGCAGGCTCCTGGGAGCAGCTGATACAAGAGCGAAGGTCTCACGAGGTCAACCCAGCAGCGCATCTCACAGGG GCCAACTCCAGCTTGACCGGCAGCGGGGGGCCGCTGTTATGGGAGACTCAGCTGGGCCTGGCCTTCCTGAGGGGCCT CAGCTACCACGATGGGGCCCTTGTGGTCACCAAAGCTGGCTACTACTACATCTACTCCAAGGTGCAGCTGGGCGGTG TGGGCTGCCCGCTGGGCCTGGCCAGCACCATCACCCACGGCCTCTACAAGCGCACACCCCGCTACCCCGAGGAGCTG GAGCTGTTGGTCAGCCAGCAGTCACCCTGCGGACGGGCCACCAGCAGCTCCCGGGTCTGGTGGGACAGCAGCTTCCT GGGTGGTGTGGTACACCTGGAGGCTGGGGAGAAGGTGGTCGTCCGTGTGCTGGATGAACGCCTGGTTCGACTGCGTG ATGGTACCCGGTCTTACTTCGGGGCTTTCATGGTGTGA-3' （SEQ ID N0:29)。
[0147] 天然人LIGHT氨基酸序列（蛋白酶消化位点以粗体下划线显示）：
[0148] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVOGWFLLOLHWRLGEMV TRLPDGPAGSffEOLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLffETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSK VQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDER LVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID NO :30)
[0149] 突变型人LIGHT氨基酸序列（EQLI (SEQ ID NO: 1)不存在，由点指示）的一个方 面：
[0150] MEESVVRPSVFVVDGQTDIPFTRLGRSHRRQSCSVARVGLGLLLLLMGAGLAVQGffFLLQLHffRLGEMV TRLPDGPAGSff. . . QERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDGALVVTKAGYYYIYSKV QLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVHLEAGEKVVVRVLDERL VRLRDGTRSYFGAFMV(S EQ ID N0:31)。
[0151] 以ATG开始的小鼠突变型LIGHT的密码子最佳化的核苷酸序列以粗体突出显示：
【权利要求】
1. 一种具有由核酸序列编码的氨基酸序列的突变型LIGHT分子，其中所述突变型 LIGHT分子 i) 与野生型人LIGHT相比较，以增加的亲和力与LIGHT的鼠受体结合，和 ii) 与野生型人LIGHT相比较，以至少相同的亲和力与LIGHT的人受体结合。
2. 权利要求1的突变型LIGHT分子，其中所述突变在LIGHT的细胞外结构域的编码序 列中。
3. 权利要求2的突变型LIGHT分子，其中所述细胞外结构域选自图6或7中列出的氨 基酸序列（以出现的次序分别为 SEQ ID NO 6-8、8-10、10、4、3、5、5、11-13、12、14-17、20、 19-23、45、20 和 25)。
4. 权利要求2的突变型LIGHT分子，其具有在野生型人LIGHT蛋白质的细胞外结构域 的位置214处的赖氨酸至谷氨酸的氨基酸置换。
5. 权利要求1的突变型LIGHT分子，其选自突变型LIGHT蛋白质、肽、蛋白质或肽的片 段、和编码突变型LIGHT的核酸分子的表达产物。
6. 权利要求1的突变型LIGHT分子，其包含衍生自人LIGHT序列的氨基酸序列。
7. -种免疫组合物，其包含权利要求1的突变型LIGHT分子。
8. -种药物组合物，其包含与权利要求1的突变型LIGHT分子连接、缀合或融合的肿瘤 特异性试剂，其中所述组合物足以刺激针对肿瘤细胞的细胞毒性T淋巴细胞。
9. 权利要求8的组合物，其中所述试剂与所述突变型LIGHT分子化学缀合。
10. 权利要求8的组合物，其中所述试剂是人源化单克隆抗体。
11. 权利要求8的组合物，其中所述试剂是嵌合抗体。
12. 权利要求8的组合物，其中所述试剂是异微型抗体。
13. 权利要求8的组合物，其中所述试剂是单链抗体。
14. 权利要求8的组合物，其中所述试剂是足以识别肿瘤抗原的抗体片段。
15. 权利要求8的组合物，其中所述突变型LIGHT分子包含足以刺激细胞毒性T细胞的 细胞外结构域区段。
16. 权利要求15的组合物，其中所述区段包含以人LIGHT氨基酸次序的LIGHT的约 100-150个氨基酸。
17. 权利要求15的组合物，其中所述区段包含来自人LIGHT蛋白质的位置约85-240的 氨基酸序列。
18. 权利要求8的组合物，其中突变型LIGHT包含在蛋白酶识别序列EQLI (残基81-84) (SEQ ID NO: 1)中的突变，由此使所述蛋白酶识别序列失活。
19. 权利要求8的组合物，其中突变型LIGHT包含缺失。
20. 权利要求8的组合物，其中所述突变型LIGHT包含在细胞外结构域中的突变，所述 细胞外结构域包含下述氨基酸序列： QLHWRLGEMVTRLPDGPAGSWEQLIQERRSHEVNPAAHLTGANSSLTGSGGPLLWETQLGLAFLRGLSYHDG ALVVTKAGYYYTYSKVQLGGVGCPLGLASTITHGLYKRTPRYPEELELLVSQQSPCGRATSSSRVWWDSSFLGGVVH LEAGEKVWRVLDERLVRLRDGTRSYFGAFMV(SEQ ID N0:40)。
21. 突变型LIGHT细胞外结构域序列，其命名为m4-14、m4-7和m4-16。
22. -种药物组合物，其包含与权利要求1的突变型LIGHT分子连接、缀合或融合的肿 瘤特异性试剂，用于减少原发性肿瘤生长或用于治疗癌症转移。
23. 人（hLIGHT)突变体分子，其如图6和7中所示（以出现的次序分别为SEQ ID NO 6-8、8-10、10、4、3、5、5、11-13、12、14-17、20、19-23、45、20 和 25)。
24. -种融合蛋白，其包含权利要求23的分子和针对Her-2的抗体。
25. -种组合物，其包含与特异性识别肿瘤细胞的试剂组合的蛋白酶抗性LIGHT蛋白 质的片段。
26. 权利要求25的组合物，其中所述试剂是针对肿瘤抗原的抗体。
27. 权利要求25的组合物，其中所述试剂是结合肿瘤表面受体的配体。
28. -种嵌合蛋白，其包含识别与LIGHT分子连接、融合或缀合的肿瘤抗原的氨基酸区 域，其中所述LIGHT分子对肿瘤环境中的蛋白酶消化是抗性的，或是突变型LIGHT分子。
29. -种将权利要求1的突变型LIGHT分子递送至肿瘤的方法，所述方法包括：(a)具 有编码所述分子的核酸分子的腺病毒，或；(b)纳米颗粒；或（c)直接转移。
30. -种减少原发性肿瘤的生长或癌症转移的方法，所述方法包括：(a)施用包含与 LIGHT多肽突变体或片段连接、缀合或融合的肿瘤特异性试剂的药物组合物，其中所述组合 物足以刺激细胞毒性T淋巴细胞的产生；和（b)通过刺激针对所述肿瘤的肿瘤特异性T细 胞的活化，减少原发性肿瘤的生长或癌症转移。
31. 权利要求30的方法，其中所述试剂是识别表面肿瘤抗原的抗体。
32. 权利要求30的方法，其中所述试剂是对选自下述的肿瘤抗原特异的抗体：HER2、 HER4、HERB、EGFR、STEAP、c-Met、甲胎蛋白（AFP)、癌胚抗原（CEA)、CA-125、MUC-1、ras 或 P53的异常产物和DcR3。
33. 权利要求30的方法，其中所述试剂是与所述LIGHT片段化学缀合或与所述LIGHT 片段重组融合的抗体。
34. 权利要求30的方法，其中所述LIGHT片段包含LIGHT的细胞外结构域，所述细胞外 结构域包含人LIGHT蛋白质的氨基酸85-240。
35. 权利要求30的方法，其中所述药物组合物静脉内施用。
36. 权利要求30的方法，其中所述癌症转移通过刺激用于引发幼稚T细胞的下述中的 至少一种的产生得到减少：趋化因子、粘附分子和共刺激分子。
37. 权利要求30的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、肾癌、肝 癌、白血病和皮肤癌。
38. 权利要求30的方法，其进一步包括施用化学治疗剂或放射治疗。
39. -种减少肿瘤的生长和癌症转移的方法，所述方法包括：(a)施用权利要求8的组 合物；或（b)在肿瘤部位处将编码LIGHT或其片段的核酸分子引入个体内，其中所述LIGHT 包含在所述细胞外结构域中的突变或是蛋白酶抗性的，并且其中LIGHT稳定存在于所述肿 瘤细胞表面上；和（c)通过刺激针对所述肿瘤的肿瘤特异性T细胞的活化，减少原发性肿瘤 的生长和癌症转移。
40. 权利要求39的方法，其中核酸递送至先前存在的肿瘤部位或对于先前存在的肿瘤 部位远侧的部位。
41. 一种减少原发性肿瘤和的生长癌症转移的方法，所述方法包括：(a)施用包含肿瘤 特异性抗体的药物组合物；(b)在肿瘤部位处引入编码LIGHT蛋白质的核酸分子，其中所述 LIGHT是人LIGHT蛋白质或其突变体或片段，或是蛋白酶抗性的；（c)在肿瘤细胞的表面上 稳定表达所述LIGHT蛋白质或其片段；和（d)通过刺激针对所述肿瘤的肿瘤特异性T细胞 的活化，减少所述肿瘤的生长和癌症转移。
【文档编号】A61K47/48GK104284680SQ201280069840
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2012年12月11日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】Y·X·傅 申请人:芝加哥大学