一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白及其在心血管方面应用的制作方法

文档序号:1252783阅读:303来源:国知局
一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白及其在心血管方面应用的制作方法
【专利摘要】一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白,制备步骤:取海带内生地衣芽孢杆菌DNN6,将地衣芽孢杆菌DNN6接种于液体培养基中,该液体培养基的配方为:蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10g/L,pH调配成9;上步骤结束后分装,每瓶装100-200mL液体培养基,温度30-35℃,转速为150-200rpm,摇床培养4-5天;将上步骤的发酵液在8000r/min的条件下离心处理,去除菌体,然后加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为95%,4℃静置过夜,过滤将沉淀用蒸馏水溶解后,再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天,取透析袋中物冷冻干燥,得海洋地衣芽孢杆菌蛋白。该蛋白在心血管方面的应用,工艺简单、成本低廉。
【专利说明】一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白及其在心血管方面应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及医药领域,特别是一种海带内生地衣芽孢杆菌DNN6 {Bacilluslicheniformis DNN6)菌株蛋白及在心血管方面的应用。
【背景技术】
[0002]海带QMmirmria Japonica Aresch)是一种在低温海水中生长的大型海生褐藻植物。它生长于水温较低的海中。海带主要是自然生长,也有人工养殖,多以干制品行销于市,质量以色褐、体短、质细而肥厚者为佳。海带有“长寿菜”、“海上之蔬” “含碘冠军”的美誉。
[0003]海带作为一种重要的海洋资源,其食用与药用价值早为世人所知。从海带中提取的有效成分具有降血糖、降血脂、抗肿瘤、抗HIV和增强免疫功能,对治疗心脑血管疾病和中、早期慢性肾衰等均有一定的作用。海带中还含有一些共附微生物,但这些微生物及其代谢产物迄今未止还没有被充分利用。

【发明内容】

[0004]本发明的目的是提供一种操作简单、成本低廉的海带内生地衣芽孢杆菌DNN6(,Bacillus licheniformis DNN6)菌株蛋白及其在心血管方面的应用,以充分利用海带的共附微生物,克服现有技术的不足。
[0005]本发明的一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白,按如下步骤制备:
a.取海带内生地衣芽抱杆菌DNN6(Bacilluslicheniformis DNN6),该菌株已于2012年12月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号:CGMCC No: 7077 ;
b.将地衣芽孢杆菌DNN6接种于液体培养基中,该液体培养基的配方为:蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10 g/L,pH调配成9;
c.b步骤结束后分装,每瓶装100-200 mL液体培养基,温度30_35°C,转速为150-200rpm,摇床培养4-5天;
d.将c步骤的发酵液在8000r/min的条件下离心处理,去除菌体,然后加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为95%,4°C静置过夜,过滤将沉淀用蒸馏水溶解后,再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天,取透析袋中物冷冻干燥,得海洋地衣芽孢杆菌蛋白。
[0006]本发明的一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白在心血管方面的应用。
[0007]本发明的海洋地衣芽孢杆菌蛋白制备方法工艺简单、成本低廉,从海带内生地衣芽孢杆菌菌株的发酵液中所提取的蛋白具有降血压活性,可应用于降血压药物的研制和开发,具有产业价值。
[0008]本发明中应用的海洋地衣芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号:CGMCC No: 7077。【具体实施方式】
[0009]本发明实施例依次按如下步骤进行:
a.将菌株地衣芽孢杆菌DNN6接种于蔗糖40-50 g/L和蛋白胨8_10 g/L, pH为9的液体培养基中,每瓶装100-200 mL液体培养基,温度30-35°C,转速为150-200 rpm,摇床培养4-5天。该地衣芽孢杆菌菌株已于2012年12月31日保藏于位于北京市朝阳区北辰西路I号院3号的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号:CGMCCNo: 7077。
[0010]b.将发酵液8000 r/min离心去除菌体,然后加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为95%,4°C静置过夜,过滤将沉淀用蒸馏水溶解后,再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天,取透析袋中物冷冻干燥,得海洋地衣芽孢杆菌蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明该沉淀物为蛋白质。
[0011]取冻干样品用PBS溶液溶解成I mg/mL的溶液,分别用180 mg/kg和18 mg/kg的剂量,颈静脉给药SD大鼠(第二军医大学实验动物中心提供),两个剂量均能使收缩压下降
3.17±0.1 KPa;离体心脏灌注18 mg/kg可以降低SD大鼠离体心脏的收缩幅度。
[0012]c.对大鼠血压的影响
实验动物:雄性SD大鼠购自第二军医大学实验动物中心。实验期间,保持动物房室温在22°C左右,相对湿度70%左右,早8点至晚8点自动照明。动物自由进食,自由饮水。
[0013]动脉导管的制备:PElO (内径0.3 cm,外径0.5 cm)和PE50 (内径0.58 mm,外径
0.96 mm)两种规格导管制备动脉导管,将PElO管与PE50管通过细铁丝对接,加热后按压对接处形成的隆起,冷却后抽出铁丝,检查对接处牢固、通畅后即可应用。
[0014]20%氨基甲酸乙酯(乌拉坦)5 mL / kg腹腔麻醉大鼠,将其仰卧固定于动物恒温解剖台,分离一侧股动脉,远心端结扎,近心端插入注满1%肝素生理盐水的动脉插管,插管的另一侧连接三通管后经由PowerLab MLTl 199有创血压测量系统,动态记录动脉血压。待血压稳定后,由颈静脉插管给DNN6菌株蛋白(180 mg/kg和18 mg/kg),并记录血压变化。实验结果表明两个剂量均能使收缩压下降3.17±0.1 KPa,具有开发降压药的潜力。
[0015]d.离体鼠心模型的建立:将SD大鼠用乌拉坦(1.2 g*kg_l)和肝素(400IU ?kg-l)混合液腹腔麻醉后 ,迅速开胸取心,按经典的Langendorff方法,经升主动脉逆行插入灌注管,使其置于主动脉瓣上方,以利冠状动脉灌注。采用KH液进行平衡灌注,于灌注前30 min及灌注时充以混合气体(95% 02 + 5% C02 ),使平衡灌注的KH液充分达到氧饱和,pH值维持在7.35^7.45,保持灌注温度为37.(TC ^37.5°C,灌注压力为60 mmHg。将两根悬浮心电记录电极分别放置于肺动脉圆锥及心尖部引导出心电图,并记录心率等心功能指数。实验结果表明当用含菌株DNN6的蛋白(18 mg/kg)的K-H液灌流心脏后4 min,心脏收缩幅度降低23%。再用K-H液恢复灌流后,心脏收缩幅度和静息张力逐渐恢复。菌株DNN6蛋白的降血压作用可能与降低心脏功能有关。
【权利要求】
1.一种海洋地衣芽孢杆菌蛋白,其特征在于:按如下步骤制备: a.取海带内生地衣芽抱杆菌DNN6(ifeci77w5.licheniformis DNN6),该菌株已于2013年I月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号:CGMCC No: 7077 ; b.将地衣芽孢杆菌DNN6接种于液体培养基中,该液体培养基的配方为:蔗糖40-50g/L和蛋白胨8-10 g/L,pH调配成9; c.b步骤结束后分装,每瓶装100-200 mL液体培养基,温度30_35°C,转速为150-200rpm,摇床培养4-5天; d.将c步骤的发酵液在8000r/min的条件下离心处理,去除菌体,然后加入硫酸铵,硫酸铵的饱和终浓度为95%,4°C静置过夜,过滤将沉淀用蒸馏水溶解后,再用截留分子量为3600道尔顿的透析袋透析4天,取透析袋中物冷冻干燥,得海洋地衣芽孢杆菌蛋白。
2.根据权利要求1所述的海洋地衣芽孢杆菌蛋白在心血管方面的应用。
【文档编号】A61P9/12GK103965303SQ201310034684
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2013年1月30日 优先权日:2013年1月30日
【发明者】张付云, 徐凤, 杨阳, 王维才 申请人:大连海洋大学, 张付云
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