专利名称：MiR-181a-5p在非小细胞肺癌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种miRNA、一个靶基因及其应用。本发明涉及到用solexa测序和软件预测miRNA的靶基因、双荧光素酶报告基因分析和western-blot技术验证miRNA的祀基因以及过表达miR-181a_5p后利用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的变化、软琼脂实验检测对细胞集落形成的影响、流式细胞仪技术检测对细胞凋亡的影响。
背景技术：
MicroRNA (简称miRNA)是非编码小RNA家族的成员之一，长度为18 25个碱基，通过碱基互补原理能结合到靶基因mRNA的3’ -端非编码区(3’ -UTR)，抑制靶基因mRNA的翻译或诱导其降解从而改变靶基因的蛋白表达水平，并通过细胞内复杂的网络调控体系，对生物体的发育、分化、增殖、凋亡、免疫等生理活动进行精确调节。肺癌是癌症死亡的头号杀手，5年生存率不到15 %，其中非小细胞肺癌(non smallcell lung cancer, NSCLC)占所有肺癌病例的80 %以上。肺癌的发生伴随着miRNA丰度的变化，miRNA的表达具有时空特异性。在不同组织、不同发育阶段中miRNA的水平有差异。miRNA的表达异常会使细胞表型发生相应的变化，继而导致疾病的诱发和肿瘤的形成。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种miRNA，其具有抑制非小细胞肺癌增殖的功能。该miRNA通过solexa测序分析挑选出，为miR-181a_5p,其成熟序列为(5' -aacauucaacgcugucggugagu-3')。经CCK-8以及细胞集落等实验分析确定。本发明的目的之二在于提供miR-181a_5p在促进癌细胞凋亡中的应用。本发明的目的之三在于提供miR-18la_5p在A549细胞系中的靶基因是Kras。A549购自中科院生化细胞所细胞库。为达到上述目的，本发明采用如下技术手段:
第一步，通过solexa测序结果,利用qRT_PCR技术寻找出miR-181a_5p表达下调的非小细胞肺癌细胞系，并在此细胞系过表达miR-181a-5p，以检测其功能。第二步，利用流式细胞仪技术和CCK-8技术，分别检测过表达miR-181a_5p后A549细胞的凋亡、增殖情况。第三步，用软琼脂实验来研究过表达miR-18la-5p后细胞集落情况。第四步，将Kras的mRNA的3' -UTR连接到pGL_3载体，其上具有与miR-181a_5p种子序列相互补的碱基。将miR-181a-5p与重组质粒共转染HEK-293T细胞，48 h后检测荧
光信号。
第五步，western-blot检测在蛋白水平Kras被下调情况。
图1非小细胞肺癌细胞系中miR-181a_5p的相对表达量；
图2过表达miR-181a-5p后抑制A549细胞的增殖；
图 3 过表达 miR-181a_5p 后转染 NC、miR-181a_5p 以及 Ant1-miR-181a_5p 后显微镜下的细胞集落形态；
图4为过表达miR-181a-5p转染后平板下的细胞集落形态；
图5为过表达miR-181a-5p后细胞集落数的计数 图6过表达miR-181a-5p后促进A549细胞的凋亡，其中A为转染NC ;B为转染miR-181a_5p ；
图7为通过双荧光报告基因检测miR-181a-5p对Kras的抑制；
图8为western实验中转染miR-181a_5p后Kras的蛋白表达量；
图9为通过软件检测到的K·ras的相对蛋白表达量。
具体实施例方式以下结合具体实例进一步阐述本发明。在具体实验步骤中常规方法参照《分子克隆》(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)及试剂盒相关步骤。实施例一:根据solexa测序结果,确定miR-181a_5p在非小细胞肺癌细胞系中低表达
先对正常小鼠的肺组织和患有非小细胞肺癌的小鼠的肺组织进行取样，用TRIZOL法提取总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，以oligo dT为引物进行反转录，通过变性反应和反转录2步获得后续实验的cDNA。样品利用Solexa方法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)，分析得到的数据，结果发现与小鼠正常肺模型(L1805)相比较，miR-181a-5p的相对表达量在小鼠的肺癌模型(L703T2)下调了 65.6 %，(L822T1)下调了 85.6 %，(L903T1)下调了 69.7 %。miR-181a_5p在小鼠肺癌模型的表达量均有下调，进一步研究发现在非小细胞肺癌细胞系中miR-34a的表达显著下调(图1)。实施例二:miR-181a-5p对A549细胞增殖有抑制作用
将A549细胞均匀的铺在96孔板中，24 h后将miR-181a_5p的mimics转入A549细胞中，转染4-6 h后换掉细胞培养液。转染前先撤掉含有血清的培养液，用不含血清及抗生素的培养液取代，以提高转染效率。转染48 h后，开始用CCK-8法检测细胞的活力，每隔24 h检测一次，检测波长为450 nm。结果显示，转染miR-181a_5p的A549细胞的增殖速度低于对照组，说明miR-181a-5p对A549细胞增殖有抑制作用(图2)。实施例三:miR-181a-5p能抑制A549细胞集落的形成
先配置1.2%的低熔点琼脂糖溶液，将1.2 g的低熔点琼脂糖加入100 ml超纯水中，灭菌，放4 °C保存。接着配置2XDMEM/E12培养液，每100 ml无血清DMEM/E12培养液中加25 ml FBS和2 %抗生素，再制备单细胞悬液，接着制备底层琼脂(终浓度0.6%)，在1.2%的琼脂糖中加入等体积的2 XDMEM/E12培养液，然后铺被六孔板，2 ml/孔，置于细胞培养箱30 min，备用。最后制备含有细胞的顶层琼脂(终浓度为0.3%)，在1.2 %的琼脂糖溶液中加入两倍体积2XDMEM/E12培养液，并加入制备好的单细胞悬液，调整细胞浓度为5000/ml，放置于培养箱培养14-20 day，每周观察。结果显示，过表达miR-181a_5p的A549细胞集落变小，数目减少。说明miR-18la-5p能抑制A549细胞集落的形成(图3、图4和图5)。实施例四:miR-181a-5p促进A549细胞的凋亡
将A549细胞均匀的铺在6孔板中，24 h后转染miR-181a_5p的mimics，48 h后，将收集到的细胞用BD FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I凋亡检测试剂盒染色细胞。用流式细胞技术检测A549细胞的凋亡情况。结果证明，转染了 miR-181a-5p的A549细胞凋亡率大于对照组(图6)。实施例五:双突光素酶报告基因的分析
将Kras mRNA的3, -UTR连接在pGL_3质粒上，该质粒上含有SV40的启动子，因为在Kras的:V -UTR上发现有miR-181a-5p的两个结合位点，为了研究那个结合位点是主要的结合位点，克隆的3' -UTR为三种，第一种只包含miR-181a-5p在Kras 3' -UTR的第一个结合位点，为280 bp，第二种只包含其在3' -UTR的第二个结合位点，大小为113 bp，而第三种不仅包含第一个结合位点还包含第二个结合位点，大小395 bp。用lip2000转染试剂把miR-181a_5p的mimics与构建好的质粒共转入HEK-293T细胞中，48 h后,用promega公司的双突光素酶报告基因分析试剂盒检测。转染的质粒的终浓度为200 nmol/L,mimics的终浓度为80 nmol/L。结果发现，转染了 miR-181a_5p的HEK-293T细胞中双荧光素酶的表达低于对照组，且包含两个结合位点的下降程度最明显，说明两个位点都会与miR-181a-5p结合，均为miR-181a-5p在Kras在3' -UTR的靶位点(图7、图8和图9)。实施例六:western_blot验证miR-181a_5p对A549细胞内源Kras基因的抑制作用
非小细胞肺癌细胞株A549被培养在含有10%小牛血清的F-12K培养基中。CO2培养箱中含有5 % 0) 2并且湿润，温度为37 °C。将单层贴壁细胞吸去培养液，PBS清洗两遍。按每I ml裂解液加10 1 PMSFj^匀置于冰上。每瓶细胞加入200 1含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min。裂解完后，用干净的刮棒刮拭培养瓶的一侧，在4 1:下12000 rpm离心15 min。本实验采用12% SDS-PAGE胶进行蛋白电泳后，将蛋白转移至硝酸纤维素膜上。转膜缓冲液和膜清洗液的配制均参照分子克隆。Kras蛋白的抗体按照1:1000稀释，GAPDH蛋白的抗体按照1:1000稀释。所采用的二抗稀释浓度为1:10000。先将A549细胞均匀地铺在6孔板中，24 h后将miR-181a_5p的mimics通过与Lip2000及无血清培养液的共孵育转入A549细胞中，转染6 h后换掉细胞培养液。转染48 h后，收集、裂解细胞，并定量各样品中的蛋白含量，采用Bradford法。用Kras的抗体来检测样品中Kras基因编码的蛋白含量。该抗体由Abcam公司生产。结果显示转染了miR-181a-5p的A549细胞中Kras基因编码的蛋白含量低于对照组。说明在A549细胞中Kras是miR-181a-5p的靶基 因((图7、图8和图9))。尽管本发明描述了具体的例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
权利要求
1.一种非小细胞肺癌中miR-181a-5p基因在抑制癌细胞的增殖及克隆形成中的应用。
2.一种非小细胞肺癌中miR-181a-5p基因在促进癌细胞的凋亡中的应用。
3.一种非小细 胞肺癌中miR-181a-5p基因下调Kras基因表达水平的应用。
全文摘要
本发明公开了在A549细胞系中miR-181a-5p具有抑制细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡，并抑制了细胞集落的大小和数量，miR-181a-5p通过与靶基因的mRNA的3′-UTR互补，抑制靶基因的翻译或直接降解靶基因的mRNA。实验通过荧光素酶报告基因实验验证了Kras是miR-181a-5p的靶基因，并通过qRT-PCR和western-blot进一步验证了下调作用，所公开的在A549细胞系中Kras为miR-181a-5p的靶基因是首次报道，该发明可以为临床对非小细胞肺癌药物靶向治疗提供一定的理论依据。
文档编号A61K48/00GK103146702SQ201310057039
公开日2013年6月12日 申请日期2013年2月22日 优先权日2013年2月22日
发明者马中良, 金由辛, 赵波涛, 邱翔, 田珂 申请人:上海大学