一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法及该动物模型的应用。具体构建方法为，将实验动物按体重随机分为若干组，分别使用不同受试物对实验动物进行致敏反应，其中一组受试物为阴性对照，每个组再分为两小组，分别通过经口灌胃和腹腔注射途径，对实验动物进行致敏，后通过检测动物的特异性免疫蛋白等指标，对过敏原的致敏性进行评价，得到动物模型，再进行体外实验对受试物致敏性进行评价，比较两种评价结果一致。本发明得到的动物模型克服了体外评价方法不能完全模拟机体对外源蛋白产生的复杂免疫反应。可应用于评价食品原料及各种加工食品的致敏性，从根本上降低了食品过敏的风险。
【专利说明】一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明申请涉及医疗评价、检测【技术领域】，具体地说，涉及一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法。
【背景技术】
[0002]随着人们健康意识的提高，食品安全问题越来越受到人们的重视。食品安全指食品无毒、无害，符合应当有的营养要求，对人体健康不造成任何急性、亚急性或者慢性危害。食品过敏是过敏性疾病之一，可能会诱发某些严重过敏性疾病及其并发症。因此，可导致过敏的食品，势必存在着食品安全问题。
[0003]流行病学调查结果显示，近年来与过敏相关的疾病发病率呈逐年上升的趋势，发达国家有10%~25%的人发生过IgE介导的过敏反应，儿童食品过敏的发生率高于成人，3岁以下儿童的患病率高达5% I %。食品过敏的主要症状有恶心、呕吐、腹痛、腹泻等，严重时可导致过敏性休克甚至危及生命。食品过敏与机体所有免疫反应都有关系，其中关系最密切的为I型过敏反应。除了食品本身的成分可引起致敏外，食品中含有的抗生素、食品添加剂、食品色素及保鲜剂等均有可能引发食品过敏。
[0004]1999年食品法典标识委员会在第23次会议上列出了 8种主要的致敏性食品:花生、大豆、奶、蛋、鱼、贝壳类、小麦和坚果。尽管有超过160种食品与速发型过敏反应有关，但这8种食品导致的过敏反应占这160余种食品的90%以上。从理论上讲，任何含有蛋白质的食品都能激发机体的过敏反应，但其激发过敏反应的可能性和途径不同，分子量大于
3.5kDa的多肽就能与肥大细胞IgE发生交联并引发过敏反应。
[0005]目前国际上对于外源蛋白的致敏性评价方法主要有:生物信息学分析、模拟胃肠消化和血清学分析，血清学试验和胃蛋白酶抑制试验。这些方法为外源蛋白致敏性的评价提供了较全面的信息，但没有一个方法与外源蛋白的致敏有直接关系。当这些评价方法得到的结果为阴性时，待测蛋白质仍有可能是一种强致敏原；当结果为阳性时，也需要进行进一步试验来证实受试蛋白质的潜在致敏性。但是，这些对食品过敏原的评价方法局限于体外实验，不能很好的模拟人体内复杂的环境。因此，缺乏一种评价蛋白质致敏性最直接的方法，即建立一种被广泛接受的检测食品中过敏原的动物评价模型。而且，动物模型在了解食品过敏反应发生和发展过程中所包含的复杂的免疫学及病理生理学机制等也是很研究价值的。
[0006]在利用动物实验评价食品致敏性的研究中，常用豚鼠、小鼠和大鼠3种啮齿类动物。目前研究较多的是大鼠，因为人们对大鼠免疫系统比较了解，又是许多免疫相关研究的工具，而且大鼠作为食品安全性评价研究最常用的实验动物，其他食品安全性研究的结果可作为蛋白质致敏性研究的基础。目前已经有利用BN大鼠评价食品过敏性的报道，还未见有关于使用Wistar大鼠建立食品过敏原动物模型的报道。
[0007]致敏性评价动物实验 中常用的致敏途径有两种:经口灌胃和腹腔注射。腹腔注射可以研究蛋白质的内在致敏性，但该途径不是人体摄入食品过敏原的天然途径。而口服的优点就是其暴露途径与人类接触食物过敏原最相关，其缺点是易产生口服耐受性。因此，最好的方法是结合二者的优点建立一种综合的动物模型。
【发明内容】
[0008]本发明申请的目的是针对现有技术的不足，提供一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法，包括下述步骤:
[0009]I)实验动物进行适应性喂养后进行实验，动物按体重随机分为若干组，自由饮水和进食，每周进行称重；
[0010]2)在第1，14和15-42天，对每一组实验动物分别使用不同受试物进行实验，其中一组实验动物接受阴性对照，每一组又根据致敏方式分为不同的小组；
[0011]3)在第0，14，28和42天，对动物进行致敏处理30min后采血；
[0012]4)在第49天进行大剂量刺激，之后在第1，3，5和7小时测定动物的收缩压，然后处死动物，取肝脏、肾脏、肺、心脏、脾和胸腺，计算脏器指数，并进行病理学检测。
[0013]其中，实验动物优选为，SPF级体重4(T60g的雌性Wistar大鼠。
[0014]进一步地，将动物按体重随机分为4组，每组实验动物又分为经口灌胃和腹腔注射两个小组，所述受试物为转人乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、卵白蛋白和生理盐水。
[0015]更进一步地，上述受试物的使用剂量如下:!^1^和131^:灌胃剂量为0.018/1^体重，腹腔注射剂量为0.001g/kg体重；0VA:灌胃剂量为0.15g/kg体重，腹腔注射剂量为
0.015g/kg体重；生理盐水:灌胃剂量和腹腔注射剂量均为8ml/kg体重。
[0016]进一步地，步骤3)的采血检测步骤为:对动物进行眼部内眦采血，分别取抗凝血(EDTA-K2作为抗凝剂)和非抗凝血，血液样本在5000r/min4°C下离心10min分别获得血清和血浆。血清和血浆样本保存在_20°C，用于特异性抗体和组胺水平的检测。全血用于嗜酸性粒细胞的检测。
[0017]上述特异性抗体为特异性IgE，特异性IgG和特异性IgG2a。
[0018]更进一步地，特异性抗体的检测步骤为:
[0019]I)包被
[0020]将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L，4°C过夜；
[0021]2)洗涤
[0022]倒掉孔内液体，每孔加入洗涤液200 μ L，室温放置3min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
[0023]3)封闭
[0024]每孔加入150 μ L封闭液，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤三次；
[0025]4)加一抗
[0026]每孔加入100 μ L按1:50~100稀释的待检血清,每个测试血清做三个平行孔,每板做三个阴性对照，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；
[0027]5)加二抗
[0028]每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgE 二抗工作液，置于37°C恒温培养箱中温育Ih,洗漆六次；[0029]6)显色
[0030]每孔加入新鲜配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒温培养箱中，显色5~15min,每孔加入50 μ L终止液；
[0031]7)测定
[0032]于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸收值。
[0033]进一步地，大剂量刺激的剂量为经口灌胃/腹腔注射剂量的10倍。
[0034]本发明的另一目的是，上述动物模型在检测食品过敏原中的应用。
[0035]为了验证本动物模型对受试物的致敏评价的正确性，本实验还通过2001年FAO/WHO推荐的体外评价食品中外源蛋白 致敏性的主要方法进行体外实验，与动物模型得到的结果进行比较，以确认评价结果的正确性。
[0036]体外实验主要分为3个部分，分别是:信息学分析，模拟胃液消化和血清学试验。
[0037](—)信息学分析
[0038]信息学分析是对食品过敏原的一级结构，即氨基酸序列的评价。将潜在食品过敏原的氨基酸序列与过敏原数据库中的已知阳性过敏原对比，来评价潜在食品过敏原是否具有致敏性。
[0039]在线致敏原数据库提供了一系列过敏原列表及其序列的搜索数据库，可用于对于存在潜在交叉反应的蛋白之间的对比。同时这个数据库可用于帮助检测基因工程或食品加工后的食品过敏原的安全性。目前这个数据库含有1603个过敏原序列，蛋白分类组603个。
[0040]将3种受试蛋白序列输入AllergenOnline数据库进行序列同源性比较。主要进行以下两项比较:
[0041]80个氨基酸序列比对:对比是否含有3条含有超过35%的序列与已知过敏原相同。
[0042]连续8个氨基酸比对:对比是否含有3条含有连续8个氨基酸与已知过敏原相同。
[0043](二)模拟胃液消化
[0044]模拟胃液消化是在体外模拟人体的胃消化过程，并判断潜在食品过敏原是否具有抗消化性。有文献指出，食品过敏原大多都具有抗消化性，所以抗消化性也是评价潜在食品过敏原是否具有致敏性的一个指标。
[0045]将模拟胃(肠)液与蛋白样品溶液(对照样品或受试蛋白)按照19:1 (v/v)的比例混合，快速振荡混匀，置于37°C水浴中，开始计时。在Os，15s，2min，30min，60min时间点取样，向模拟胃液中快速加入碳酸氢钠溶液终止反应，再加入5X上样缓冲液，向模拟肠液中直接加入加入5X上样缓冲液，沸水煮5min，进行蛋白电泳。电泳结束后进行考马斯亮蓝染色与脱色，并拍照。
[0046](三)血清学试验
[0047]血清学实验使用的是过敏患者的血清与过敏原在体外进行Western实验，从而判断潜在的食品过敏原是否可以与过敏患者的血清结合。若能结合，则可以认为这种蛋白具有潜在的致敏性。
[0048]采用对牛奶或鸡蛋过敏患者的血清，采用allergen specific Pharmacia UniCAPtests检测血清中IgE分级应大于III级，或者血清中抗原特异性IgE含量应> 3.5KUA/L。采用健康人的血清作为阴性对照。[0049]I) SDS-PAGE电泳(与模拟胃肠消化中的SDS-PAGE步骤相同)。
[0050]2)转膜:
[0051]根据蛋白电泳胶的大小裁剪6张滤纸和I张硝酸纤维素膜(使用前要用电转缓冲液浸润)。每侧垫3张滤纸，胶靠近负极，硝酸纤维素膜靠近正极。80V，300mA条件下电转1.5h。
[0052]3)封闭
[0053]使用含有4%脱脂奶粉或3%BSA的TBST溶液封闭2h，用TBST溶液洗3次，每次5min。
[0054]4)加一抗
[0055]使用合适稀释度的血清室温下孵育2h，再用TBST溶液洗6次，每次5min。
[0056]5)加二抗
[0057]使用1:4000稀释度的生物素标记的抗IgE抗体室温下孵育Ih。使用TBST溶液洗6次,每次5min。
[0058]6)加三抗 [0059]使用1:8000稀释的HRP-链霉亲和素室温下孵育lh。使用TBST溶液洗6次，每次5min。
[0060]7)曝光
[0061]加ECL(electrochemiluminescence),将膜放在X-光片夹中，在暗室中，将IX显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X-光片，用切纸刀剪裁适当大小(比膜的长和宽均需大Icm);打开X-光片夹,把X-光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，计时5min。打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5~lOmin，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
[0062]8)照相
[0063]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果:
[0064]本发明得到的这个动物模型克服了体外评价方法不能完全模拟机体对外源蛋白产生的复杂免疫反应。可应用于评价食品原料及各种加工食品的致敏性，从根本上降低了食品过敏的风险。
【专利附图】
【附图说明】
[0065]图1为灌胃组各组特异性IgG检测结果；
[0066]A 为:0VA, B 为:bLF, C 为:rhLF, D 为:生理盐水。
[0067]图2为灌胃组各组特异性IgG2a检测结果；
[0068]A 为:0VA, B 为:bLF, C 为:rhLF, D 为:生理盐水。
[0069]图3为灌胃组各组嗜酸性粒细胞检测结果；
[0070]图4为灌胃组各组收缩压检测结果；
[0071]图5为腹腔注射组各组特异性IgG检测结果；
[0072]A 为:0VA, B 为:bLF, C 为:rhLF, D 为:生理盐水。
[0073]图6为腹腔注射组各组特异性IgG2a检测结果；[0074]A 为:0VA, B 为:bLF, C 为:rhLF, D 为:生理盐水。
[0075]图7为腹腔注射组各组嗜酸性粒细胞检测结果；
[0076]图8为腹腔注射组各组收缩压检测结果；
[0077]图9为OVA模拟胃液/肠液消化SDS-PAGE凝胶电泳结果；
[0078]电泳图上样顺序为:
[0079]8:预染标准蛋白，从上到下依次是:170kD、130kD、95kD、72kD、55kD、43kD、34kD、26kD、17kD、10kD ；
[0080]1，9:目的蛋白对照；
[0081 ] 7:胃蛋白酶对照；15:胰蛋白酶对照。
[0082]2-6:为目的蛋白在模拟胃液中分别消化0s、15s、2min、30min、60min的情况；
[0083]10-14:为目的蛋白在模拟肠液中分别消化Os、15s、2min、30min、60min的情况。
[0084]图10为bLF模拟胃液/肠液消化SDS-PAGE凝胶电泳结果；
[0085]电泳图上样顺序为: [0086]8:低分子量标准蛋白，从上到下依次是:97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20kD、14.4kD ；
[0087]2，10:目的蛋白对照；
[0088]1:胃蛋白酶对照；9:胰蛋白酶对照。
[0089]3-7:为目的蛋白在模拟胃液中分别消化0s、15s、2min、30min、60min的情况；
[0090]11-15:为目的蛋白在模拟肠液中分别消化Os、15s、2min、30min、60min的情况。[0091 ] 图11为rhLF模拟胃液/肠液消化SDS-PAGE凝胶电泳结果；
[0092]电泳图上样顺序为:
[0093]8:低分子量标准蛋白，从上到下依次是:97.4kD、66.2kD、43kD、31kD、20kD、14.4kD ；
[0094]1,9:目的蛋白对照；7:胃蛋白酶对照；15:胰蛋白酶对照。
[0095]2-6:为目的蛋白在模拟胃液中分别消化0s、15s、2min、30min、60min的情况；
[0096]10-14:为目的蛋白在模拟肠液中分别消化Os、15s、2min、30min、60min的情况。
[0097]图12为OVA免疫印迹血清学检测结果；
[0098]图13为bLF免疫印迹血清学检测结果；
[0099]图14为rhLF免疫印迹血清学检测结果；
[0100]A图中泳道1:标准奶粉蛋白提取物(IOug) ；2:标准蛋粉蛋白提取物(IOug) ；3:重组人乳铁蛋白(40ng) ；4:人乳铁蛋白(40ng) ；5:牛乳铁蛋白(40ng)。所用血清为健康人血清。B图中泳道1:标准蛋粉蛋白提取物(IOug) ；2:重组人乳铁蛋白(40ng) ；3:人乳铁蛋白(40ng)；4:牛乳铁蛋白(40ng)。共检测了 12例对鸡蛋过敏患者的血清，上图所用血清为26号对鸡蛋过敏患者血清。C图中泳道1:标准奶粉蛋白提取物(IOug) ；2:重组人乳铁蛋白(40ng)；3:人乳铁蛋白(40ng);4:牛乳铁蛋白(40ng)。共检测了 21例对牛奶过敏的患者血清,上图所用血清为85号对牛奶过敏患者血清。
【具体实施方式】
[0101]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0102]实施例1
[0103]动物模型的构建
[0104]1.实验动物
[0105]SPF级体重40~60g的雌性Wistar大鼠。
[0106]2.受试物
[0107]转人乳铁蛋白(rhLF)，牛乳铁蛋白(bLF)，卵白蛋白0VA，生理盐水(阴性对照)。
[0108]3.动物分组
[0109]实验动物按照体重随机分为4组(每组两小组)，分别是:rhLF灌胃组/腹腔注射组，bLF灌胃组/腹腔注射组，OVA灌胃组/腹腔注射组和生理盐水灌胃组/腹腔注射组。每小组8只动物。
[0110]4.剂量
[0111]rhLF和bLF:灌胃剂量为0.01g/kg体重，腹腔注射剂量为0.001g/kg体重。
[0112]OVA:灌胃剂量为0.15g/kg体重，腹腔注射剂量为0.015g/kg体重。
[0113]生理盐水:8ml/kg体重。
[0114]大刺激剂量为灌胃/注射剂量的10倍。
[0115]5.动物处理
[0116]实验动物进行适应性喂养I周后进行实验。动物按体重随机分为4组(每组两小组)，自由饮水和进食，每周进行称重。
[0117]在第1，14和15~42天对动物进行灌胃/腹腔注射处理。
[0118]在第0，14，28和42天，动物灌胃/腹腔注射30min后，对动物进行眼部内眦采血，分别取抗凝血(EDTA-K2作为抗凝剂)和非抗凝血,在5000r/min4°C下离心10min分别获得血清和血浆。血清和血浆样本保存在_20°C，用于特异性抗体和组胺水平的检测。全血用于嗜酸性粒细胞的检测。
[0119]在第49天进行大剂量刺激，之后在第1，3，5和7小时测定动物的收缩压，然后处死动物，取肝脏，肾脏，肺，心脏，脾和胸腺等脏器，计算脏器指数，并进行病理学检测。
[0120]实施例2
[0121]反应指标的检测
[0122]1.特异性IgE的检测
[0123]I)包被
[0124]将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L，4°C过夜；
[0125]2)洗涤
[0126]倒掉孔内液体，每孔加入洗涤液200 μ L，室温放置3min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
[0127]3)封闭
[0128]每孔加入150 μ L封闭液，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤三次；
[0129]4)加一抗
[0130]每孔加入100 μ L按1:50~100稀释的待检血清,每个测试血清做三个平行孔,每板做三个阴性对照。于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；[0131]5)加二抗
[0132]每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgE 二抗工作液，置于37°C恒温培养箱中温育Ih,洗漆六次；
[0133]6)显色
[0134]每孔加入新鲜配制的底物工作液150μ L，置于37°C恒温培养箱中，显色5~15min,每孔加入50 μ L终止液；
[0135]7)测定
[0136]于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0137]2.特异性IgG的检测
[0138]编号同上包被:将受试蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100μ L,4°C过夜；
[0139]洗涤:倒掉孔内液体，每孔加入洗涤液200 μ L，室温放置3min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
[0140]封闭:每孔加入150 μ L封闭液，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤三次；
[0141]加一抗:每孔加入100μ L按1:50~100稀释的待检血清，每个测试血清做三个平行孔，每板做三个阴 性对照。于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；
[0142]加二抗:每孔加入100μ L辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgG 二抗工作液，置于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；
[0143]显色:每孔加入新鲜配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒温培养箱中，显色5~15min,每孔加入50 μ L终止液；
[0144]测定:于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0145]3.特异性IgG2a的检测
[0146]编号同上包被:将样品蛋白及阳性对照蛋白分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔,每孔加入包被液100μ L,4°C过夜；
[0147]洗涤:倒掉孔内液体，每孔加入洗涤液200 μ L，室温放置3min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次；
[0148]封闭:每孔加入150 μ L封闭液，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤三次；
[0149]加一抗:每孔加入100μ L按1:50~100稀释的待检血清，每个测试血清做三个平行孔，每板做三个阴性对照。于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；
[0150]加二抗:每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgG2a 二抗工作液，置于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次；
[0151]显色:每孔加入新鲜配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒温培养箱中，显色5~15min,每孔加入50 μ L终止液；
[0152]测定:于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸收值(A)。
[0153]4.嗜酸性粒细胞的检测
[0154]在第0，14，28和42天，动物灌胃/腹腔注射30min后，对动物进行眼部内眦采血，收集血液的离心管中含有EDTA-K2抗凝剂。使用血细胞分析仪对全血中的嗜酸性粒细胞计数。
[0155]5.组胺水平的检测[0156]血浆中组胺的检测选用大鼠组胺ELISA试剂盒。将试剂盒在室温下放置至少平衡室温半小时后，取出试剂盒中反应板，加入IOOyL已稀释标本于相应反应板孔中。轻轻混匀30秒，20-25°C温育20分钟。甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板(每孔内加入350 μ L洗漆液)，并去除水滴(在厚吸水纸上拍干)，反复洗漆3次。每孔加入100μ L Biotin anti ratHistamine。轻轻混匀30秒，20-25°C温育20分钟。重复洗涤步骤。每孔加入100 μ LI XHRP。轻轻混匀30秒,20_25°C温育10分钟。重复上述洗板过程。每孔加入100 μ L TMB显色液，轻轻混匀30秒；15分钟内在450nm处读OD值。
[0157]6.脏器指数
[0158]解剖动物，取肝、脾、肾、心、肺和胸腺等脏器，肉眼观察其大体变化并称重，计算各脏器的脏器指数[(脏器质量/体重)X100%]。
[0159]7.数据处理
[0160]结果均以平均值土标准差表示。
[0161]使用SPSS的单因素方差分析进行显著性分析，当P < 0.05认为具有显著性差异。
[0162]实施例3
[0163]试验结果及分析
[0164]1.日常状况
[0165]在试验期间，各组实验动物状态良好，营养状况正常，未出现死亡等任何中毒现象。
[0166]2.灌胃组结果
[0167]I)特异性IgE结果
[0168]表1为灌胃组各组特异性IgE检测结果:从结果中可以看出，OVA组在第28天和42天要显著性高于bLF组(P〈0.05)，在第42天要显著性高于生理盐水对照组(P〈0.05)。而rhLF几乎没有诱发实验动物产生IgE应答。
[0169]表1灌胃组各组特异性IgE检测结果(平均值土标准差，n=8)
[0170]
【权利要求】
1.一种检测食品中过敏原的动物模型的构建方法，包括下述步骤: 1)实验动物进行适应性喂养后进行实验，动物按体重随机分为若干组，自由饮水和进食，每周进行称重； 2)在第1，14和15-42天，对每一组实验动物分别使用不同受试物进行实验，其中一组实验动物接受阴性对照，每一组又根据致敏方式分为不同的小组； 3)在第O，14，28和42天，对动物进行致敏处理30min后采血； 4)在第49天进行大剂量刺激，之后在第1，3，5和7小时测定动物的收缩压，然后处死动物，取肝脏、肾脏、肺、心脏、脾和胸腺，计算脏器指数，并进行病理学检测。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述实验动物为SPF级体重4(T60g的雌性Wistar大鼠，动物按体重随机分为4组，每组实验动物又分为经口灌胃和腹腔注射两个小组，所述受试物为转人乳铁蛋白、牛乳铁蛋白、卵白蛋白和生理盐水。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述受试物的剂量如下:转人乳铁蛋白和牛乳铁蛋白:灌胃剂量为0.01g/kg体重，腹腔注射剂量为0.001g/kg体重；卵白蛋白:灌胃剂量为0.15g/kg体重，腹腔注射剂量为0.015g/kg体重；生理盐水:灌胃剂量和腹腔注射剂量均为8ml/kg体重。
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述采血检测步骤为:对动物进行眼部内目此采血，分别为抗凝血和非抗凝血，血液样本在5000r/min4°C下离心10min分别获得血清和血浆，血清和血浆样本保存在-20°C，用于特异性抗体和组胺水平的检测，全血用于嗜酸性粒细胞的检测。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述特异性抗体的检测为特异性IgE，特异性IgG和特异性IgG2a的检测。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述特异性抗体的检测步骤为: (1)包被 将受试物分别用包被缓冲液稀释至10mg/L，在96孔板上选择需要包被的孔，每孔加入包被液100yL，4°C过夜； (2)洗涤 倒掉孔内液体，每孔加入洗涤液200 μ L，室温放置3min，甩净洗涤液，在吸水纸上拍打数次，至孔内无明显液滴，重复两次； (3)封闭 每孔加入150 μ L封闭液,于37°C恒温培养箱中温育Ih,洗漆三次； (4)加一抗 每孔加入100 μ L按1:50~100稀释的待检血清，每个测试血清做三个平行孔,每板做三个阴性对照，于37°C恒温培养箱中温育lh，洗涤六次； (5)加二抗 每孔加入100 μ L辣根过氧化物酶标记的抗大鼠IgE二抗工作液，置于37°C恒温培养箱中温育Ih，洗涤六次； (6)显色 每孔加入新鲜配制的底物工作液150 μ L，置于37°C恒温培养箱中，显色5~15min，每孔加入50 μ L终止液；(7)测定 于终止显色30min内用酶标仪测定各孔在450nm下的吸收值。
7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，大剂量刺激的剂量为经口灌胃/腹腔注射剂量的10倍。
8.权利要求1或2 所述方法构建的动物模型在检测食品过敏原中的应用。
【文档编号】A61K38/38GK104001160SQ201310059155
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2013年2月25日 优先权日:2013年2月25日
【发明者】车会莲, 王静, 周催, 孙娜, 王翠燕, 贺晓云 申请人:中国农业大学