猪prrsv、猪肺炎支原体和pvc-2抗原在制备疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应用。该应用对于猪肺炎支原体污染的猪群或受到猪肺炎支原体威胁的猪群在不影响猪肺炎支原体免疫效果的前提下，能使PCV2和PRRSV的免疫时间提前，能同时控制猪肺炎支原体、PRRSV和PCV-2三种疾病。
【专利说明】猪PRRSV、猪肺炎支原体和PVC-2抗原在制备疫苗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及猪PRRSV、猪肺炎支原体和PVC-2抗原在制备疫苗中的应用。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒病是由猪圆环病毒(porcine circovirus, PCV)引起的猪的一种多系统功能障碍性疾病。猪圆环病毒属于圆环病毒科，是迄今发现的最小的动物病毒中的一种。根据猪圆环病毒的致病性以及基因组差异又可将其分为无致病性(或PK15源性)的猪圆环病毒I型(PCV-1)和有致病性(PMWS源性)的猪圆环病毒II型(PCV-2)。我国自2000年报道猪群中存在PCV2感染的血清学证据以来，各地区陆续报道，流行范围已波及全国，猪群平均阳性率38.47%,猪场阳性率58.75%以上，危害日趋严重。针对该问题，国内已有商品化的灭活疫苗，可为猪群提供较好的免疫保护，特别在仔猪增重、抑制病毒、减少病毒血症方面具有显著的优势。
[0003]猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)对猪造成的危害是一个世界性难题。2006至2007年，我国二十多个省份发生了高致病性猪繁殖与呼吸综合征疫情，给我国养猪业造成了严重的经济损失。随着猪繁殖与呼吸综合征的发现，猪繁殖与呼吸综合征的疫苗研究也随之开展。目前国内外已经商品化的猪繁殖与呼吸综合征疫苗有灭活疫苗、弱毒疫苗和基因工程疫苗。
[0004]在经典株灭活疫苗方面，Bayer公司于1997年推出了灭活疫苗，随后中国也研制出猪繁殖与呼吸综合征灭活疫苗并商品化。灭活疫苗的优点是安全性好，但主要刺激猪体产生体液免疫反应，对清除感染巨噬细胞中的猪繁殖与呼吸综合征病毒无能为力，并且免疫剂量大、免疫次数多、免疫力产生期较长，因而不适合仔猪免疫。在免疫效力上灭活疫苗免疫后攻毒不能完全保户仔猪对繁殖与呼吸综合征病毒的感染。
[0005]在经典株猪繁殖与呼吸综合征弱毒活疫苗方面，美国于1995年首次推出商品化减毒疫苗Res PRRS/R印roTM，可供各阶段猪群使用，但主要供3~18周龄仔猪预防接种。随后多个国家，包括中国研制出猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗并商品化。据报道，接种猪繁殖与呼吸综合征经典株弱毒疫苗后110日用同源强毒攻击，可得到100%保护(童光志和田志军，猪繁殖与呼吸综合征疫苗研究进展，PRRS专刊，2005，2:32_33，46)。但有文献报道PRRS弱毒疫苗接种PRRS血清学阴性的母猪后，疫苗中病毒可经胎盘感染胎儿，并向未接种的母猪传播，有些猪群则表现出急性猪繁殖与呼吸综合征症状。并且该疫苗接种公猪后，随后以强毒攻击，发现有精液排毒和精液质量下降等现象。在国内哈尔滨兽医研究所通过对国内分离到经典株蓝耳病毒株进行致弱获得PRRSVCH-1R株，该毒株免疫原性好，刺激机体产生抗体速度快，效价高，保护时间长，用于经典株蓝耳病病毒的预防。
[0006]在高致病性猪繁殖与呼吸综合征活疫苗方面，国内专家通过对高致病性猪繁殖与呼吸综合征变异株(NVDC-JXA1)在Marcl45细胞上连续继代进行驯化，获得了具有良好免疫原性和安全性的弱毒株(NVDC-JXA1-R)，并作为预防高致病性蓝耳病疫情政府招标用疫苗株，在控制高致病性蓝耳病疫情中起到重要作用。随后又有两株高致病性蓝耳病变异株(TJM-F92株和HuM-Fl 12株)活疫苗上市。
[0007]高致病性和低致病力猪繁殖障碍综合症弱毒疫苗株交叉保护情况存在着争议，越来越多的数据表明，两类毒株之间都不能提供100%的交叉保护。因此，为更好的控制高致病性和低致病力的猪繁殖与呼吸综合征疾病，在受到两种不同毒力病毒威胁时养殖场多采用二种疫苗同时免疫。
[0008]大量研究表明PRRSV和PCV2都可以导致免疫细胞的凋亡，造成机体免疫抑制，并且两种病毒多同时存在，从而更容易继发其它病原体的感染，导致更为严重的传染病。但现有技术中不存在同时预防两种疾病的疫苗。
[0009]猪肺炎支原体(MH)作为猪呼吸道疾病综合征的重要原发病原，可诱发猪支原体肺炎(又称为猪气喘病、猪地方流行性肺炎)，一年四季均可发生。尤以寒冷、潮湿气候剧变时多发。病原体感染后可破坏呼吸道纤毛，引发肺炎，使感染、发病猪生产性能下降，治疗费用上升，还可导致猪体的体液免疫和细胞免疫功能降低。
[0010]猪肺炎支原体与猪繁殖和呼吸系统综合征病毒(PRRSV)在实验条件下共感染，猪肺炎支原体可以促进蓝耳病的发生。肺炎支原体感染后，一方面可以破坏呼吸道的局部清除病原体的能力，使得病毒性病原体严重继发感染；另一方面，肺炎支原体可以调制肺脏局部的免疫应答，使肺泡巨噬细胞的功能发生改变，从而促进了 PRRSV的感染，延长了 PRRSV感染的时间。而且PRRSV和肺炎支原体在临床感染上存在协同效应，增强彼此的致病力，而且加重了 PRRSV造成的损失。而且支原体是PRDC的主要诱发者，即使支原体引起的疾病较轻微，即猪群发生低水平支原体感染，也能使蓝耳病很快表现出临床症状。
[0011]最新研究表明，肺炎支原体可以促进PCV-2的感染。PCV-2/肺炎支原体的混合感染模型本身表明，PCV-2或肺炎支原体单独感染只能引起轻微的一过性呼吸道疾病和病变，但如果二者混合感染，猪肺炎支原体感染可加剧PCV-2所致肺部和淋巴病变的严重程度、增加PCV-2抗原的量、延长PCV-2抗原的存在时间，从而提高猪断奶后多系统消耗性综合征的发病率。
[0012]由于猪支原体肺炎、PRRSV和PCV-2这三种病毒在养殖场中广泛存在，并且经常出现猪肺炎支原体和PRRSV、猪肺炎支原体和PCV-2、PRRSV和PCV-2、甚至出现猪肺炎支原体和PRRSV和PCV-2三种致病因子混合感染现象。国内外许多资料证实支原体感染更易诱发PRRSV和PCV-2的继发感染，从而产生更为严重的呼吸障碍综合症。因此，有必要采取有效措施控制这3种疾病。目前尚没有PCV-2和PRRSV弱毒疫苗联合配苗和PCV-2、猪肺炎支原体和PRRSV弱毒株三联苗应用的报道。
[0013]有学者(Van Thacker, 1999)表明如果在接种肺炎支原体疫苗的同时感染了 PRRS病毒或者接种了 PRRS弱毒活疫苗，均会降低猪肺炎支原体疫苗的功效。因此如何在预防PRRSV和PCV-2的同时提高猪支原体肺炎的免疫效果为本【技术领域】的有待解决的问题。
[0014]专利申请CN101420975A公开了一种抗支原体和PRRSV疫苗，该专利申请基于“猪感染或接种了 PRRSV病毒，猪肺炎支原体疫苗的功效将会显著降低”的理由而设计的技术路线为:首先用猪肺炎支原体给小猪首次接种，接着用猪肺炎支原体和活的减毒PRRSV进行第二次接种，它们会迅速产生对PRRSV病毒感染和猪肺炎支原体感染的良好保护作用。
[0015]即如果以联合的方式给已知首次接触猪肺炎支原体疫苗的小猪施用致免疫剂量的猪肺炎支原体的免疫原性物质和致免疫剂量的活的减毒PRRSV病毒，就能避开所谓“已知的问题”。
[0016]该申请的第一个实施方案涉及致免疫剂量的猪肺炎支原体的免疫原性物质和致免疫剂量的活的减毒PRRSV在制备用于给已接触猪肺炎支原体的猪联合施用猪肺炎支原体疫苗和PRRSV疫苗的疫苗中的应用。
[0017]该申请通过猪肺炎支原体单苗和含猪支原体肺炎组份的联苗两次免疫仔猪，尽管避免了所谓的“PRRSV减毒株疫苗对猪肺炎支原体免疫效果的影响，但却推迟了 PRRSV疫苗的免疫时间7~35日，这样势必延长了仔猪免疫PRRSV疫苗的时间，降低猪群耐受PRRSV的能力。
【发明内容】
[0018]为解决现有技术的不足，本发明提供一种有猪肺炎支原体污染的猪群或受到猪肺炎支原体威胁的猪群在不影响猪肺炎支原体免疫效果的前提下，使PCV2和PRRSV的免疫时间提前，以控制猪肺炎支原体、PRRSV和PCV-2三种疾病的方法。
[0019]本发明的主要目的在于提供一种致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应用。
[0020]优选地，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免所述猪，用致免疫量的所述猪肺炎支原体和致免疫量的所述PCV-2抗原二次免疫所述猪。
[0021]更优选地,所猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体,所述PRRSV抗原为PRRSV减毒株，所述PCV-2抗原为灭活的PCV-2病毒。
[0022]更优选地,所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株,所述PRRSV抗原为PRRSV NVDC-JXA1-R减毒株，所述PCV-2抗原为灭活的PCV-2病毒SH株。
[0023]PCV2SH 株，保藏号为 CGMCC N0.2389，公开于专利文献 CN101240264A。
[0024]猪肺炎支原体菌株HN0613株，保藏编号为CCTCC M2012230，保藏单位为位于中国武汉的中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，保藏日期:2012年6月13日。
[0025]PRRSV NVDC-JXA1-R株，保藏号为CGMCC N0.2467，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2008年4月29日，在CN101307305A中公开。
[0026]更优选地，所述猪肺炎支原体抗原为2X 18CCU~5X 18CCU,优选3X 18CCU~5 X 18CCU ;所述 PRRSV 抗原为≤ I X 15TCID5tl，优选≤ I X 16TCID50 ；，所述 PCV-2 抗原为≤ I X 14TCID5。，优选≤ IX15TCID50o
[0027]更优选地，所述首免和二次免疫间隔7~35日，优选14~28日，更优选21~28曰。
[0028]更优选地，所述PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免I~7龄仔猪，优选5~7日龄仔猪。
[0029]疫苗组合物中猪肺炎支原体抗原是指灭活后支原体菌体或其有效成分，灭活前含量每头份含量在2 X 18CCU~5 X 18CCU,优选3 X 18CCU~5 X 18CCU ;组合物中PRRSV抗原可以为致弱的PRRSV病毒液，还可以为或含有其保护性抗原GP5蛋白和M蛋白一种成份或多种成份，其中为PRRSV病毒液时每头份含量> IX 15TCID5tl，优选每头份病毒液含量≥I X 16TCID50 ;组合物中PCV-2抗原是指灭活后的PCV-2全病毒液，或含有PCV-2有效保护抗原VP2等成份，其中为PCV-2抗原时每头份含量> I X 14TCID5tl，优选病毒液含量≥ 1X105TCID5。。
[0030]本发明的另一目的在于提供一种疫苗试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述PCV-2抗原、所述猪肺炎支原体抗原和佐剂的组份I，以及含所述PRRSV抗原的组份II。
[0031]在疫苗组合物组成成分上将灭活的PCV-2抗原、猪肺炎支原体抗原混合后加入水性佐剂作为组份I，组份II为含PRRSV弱毒株抗原冻干保存。使用时组份I和和组分II可单组使用，组分I免疫仔猪可预防和控制PCV-2和猪肺炎支原体感染，组份II加入稀释液单独使用免疫仔猪用于预防PRRSV感染；组份I和组份II也可联合使用，用组份I中的二联苗作为稀释液来稀释组份II配制成三种抗原成份的联苗，用于同时预防和控制猪肺炎支原体、PCV2和PRRSV这三种疾病的感染。
【具体实施方式】
[0032]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0033]本发明实施例中分别以猪圆环病毒2型SH株、PRRSVNVDC-JXA1-R株、猪肺炎支原体HN0613株为例说明本发明。
[0034]实施例1、猪圆环病毒2型、PRRSV、猪肺炎支原体组合疫苗的制备
[0035]1.抗原制备
[0036]1.1猪圆环病毒2型抗原的制备
[0037](I)制苗用细胞的传代与培养:取PK15细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含0.25胰酶(I: 250)、0.02% EDTA的Hank' s液消化传代，以含90 % MEM液、10 %牛血清、各100单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH调整为7.2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器。
[0038](2)细胞毒种的繁殖:用病毒培养液，将PCV-2接种到步骤(1)制备的生长良好单层细胞继续培养，接种量为0.2M0I，培养温度为37°C，至细胞80%以上病变时收获病毒。
[0039](3)PK15细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤(1)制备生长良好的ΡΚ15细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有预处理好的微载体，设定培养温度37°C，pH7.2，溶氧50，搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为50L; " B1NOC II"载体，在载体罐中的加入量为50~70g/L，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为:1)称量B1NOCII球形微载体250g、使用1L PBS液浸泡三小时；2)用1L PBS液清洗3遍；3)加入1LPBS液浸泡微载体，121 °C蒸汽灭菌30min。
[0040](4)制苗毒液的繁殖:培养后第三日观察微载体上细胞基本长满，且细胞计数结果为约IXlOfVml后进行接毒操作，接种量为0.2M0I，设定培养温度37°C，pH7.4，溶氧50ppm,搅拌速度60rpm,进行反应器自动控制培养,接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况，同时取反应器中病毒液，用间接免疫荧光法(IFA)测定PCV-2病毒含量。待细胞病变达50%~80%病变时(IFA病毒含量达到最高)停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液。
[0041](5)病毒液的收获:培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后加入0.02%灭活剂BEI灭活37°C灭活72h，然后37°C加入10% V/V(0.1M)硫代硫酸钠终止BEI活性，然后将灭活后的病毒液于_20°C冷冻保存备用。
[0042](6)PCV-2抗原灭活检验:灭活后，无菌从每瓶病毒灭活液中取样，接种96孔板，同步介入PK15细胞，培养120h后，做间接免疫荧光，细胞无免疫荧光。
[0043]1.2猪PRRSV抗原的制备
[0044](I)制苗用细胞的传代与培养:取Marcl45细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液(含
0.25胰酶(I: 250)、0.02% EDTA的HanV s液消化传代，以含90% MEM液、10%牛血清、各100单位/ml的青霉素钠和硫酸链霉素，pH调整为7.2的细胞生长液继续培养，培养温度为37°C，形成良好细胞单层时，用于继续传代或接种于生物反应器中进行微载体悬浮培养，其中生物反应器为能够自动控制温度、pH、溶氧、搅拌速度等参数，适用于微载体悬浮培养的生物反应器。
[0045](2)细胞毒种的繁殖:用病毒培养液，将PRRSV接种到步骤(1)制备的生长良好单层细胞继续培养，接种量为0.2M0I，培养温度为37°C，至细胞80%以上病变时收获病毒。
[0046](3)Marcl45细胞在生物反应器中的微载体悬浮培养:取步骤⑴制备生长良好的Marcl45细胞，经EDTA-胰酶细胞分散液消化制备为细胞悬液，细胞计数后接种于生物反应器中，在生物反应器中加有预处理好的微载体，设定培养温度37°C，pH7.2，溶氧50、搅拌速度60rpm，进行反应器自动控制培养，其中生物反应器容积为50L ; " B1NOC II"载体，在载体罐中的加入量为50~70g/L，微载体在使用前，需清洗、灭菌，具体步骤为:1)称量B1NOC II球形微载体250g、使用1L PBS液浸泡三小时；2)用1L PBS液清洗3遍；3)加入1L PBS液浸泡微载体，121°C蒸汽灭菌30min。
[0047](4)制苗用PRRSV病毒液的繁殖:观察微载体上细胞基本长满，细胞计数结果达到IXlOVml~IXlOVml后进行接毒操作，所接入种毒为步骤(2)中之种毒，设定培养温度37°C, H7.2~7.6，溶氧30~60、搅拌速度30~60rpm，进行反应器自动控制培养，接毒后每隔一定时间取细胞微载体观察细胞病变情况待细胞病变达80%以上病变时，停止反应器搅拌，待微载体全部沉到反应器底部后，收获上清液。
[0048](5)病毒液的收获:培养的上清液经过滤、横向切留超滤处理去除细胞碎片及部分杂蛋白，即制得病毒液。然后将病毒液于-20°C冷冻保存备用。
[0049]1.3猪肺炎支原体培养基及支原体抗原制备
[0050]采用KM2液体培养基或固体培养基，配方如下:乳清蛋白水解物，10.0g ;鲜酵母浸出物，20.0ml ；Eagles氏液，1000.0ml ;Dulbecco磷酸盐缓冲液,600.0ml ;健康猪血清,400.0ml ;酚红(0.4% )，3.5ml ;醋酸铊(1% )，25.0ml ;青霉素，400000.0IU。pH 为 7.4 ~7.6。
[0051]将冻干菌种猪肺炎支原体HN0603株接种于KM2固体培养基，5% CO2环境培养72小时后，选取3个典型菌落转接入KM2液体培养基，培养48h后纯粹检验合格作为种子液，按发酵罐容积的70%加入生产用的KM2培养基，按培养基量的0.02%加入消泡剂(Antifoam204, Sigma)，当培养基温度升至37°C时，将种子液按10%加入到发酵罐内。搅拌转速300r/min, ρΗ7.2，罐压0.02~0.04Mpa之间、溶氧量40%，培养时间48小时，当浓度达到约IX 109(XU/ml时，经检验纯粹后，加入然后加入0.02%灭活剂BEI灭活37°C灭活72h，然后37°C加入10% V/V(0.1M)硫代硫酸钠终止BEI活性，4°C保存备用，即为猪肺炎支原体抗原。
[0052]1.4半成品检验
[0053]无菌检验:按《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》附录301页对猪PCV-2和PRRSV和猪肺炎支原体抗原液进行检验，均无菌生长。
[0054]2疫苗组合物的配制
[0055]2.1组份I的制备:将灭活的PCV-2病毒液和猪肺炎支原体培养液混合均匀后，抗原液按1: 2比例，并加入1份水性佐剂，混匀后作为组份I，分装、加塞、压盖，2~8°C保存。
[0056]2.2组份II的制备:将PRRSV弱毒抗原加入冻干保护剂，充分混匀后定量分装，冻干，即得到组份II。
[0057]3疫苗组合物预防控制猪肺炎支原体、PCV-2和PRRSV这三种疾病方法:用组份I作为稀释液稀释组份II首免，28日后用组份I 二免。
[0058]实施例2、PCV-2、PRRSV、猪肺炎支原体组合疫苗应用
[0059]用本发明实施例1自制的组份I和组份II联合使用，用组份I作为稀释液稀释组份II组成联苗预防猪肺炎支原体、PCV-2和PRRSV这三种疾病。免疫程序如下:首先7日龄仔猪用组份I稀释组份II组成联苗首免，21日后用组份I 二免。在免疫的同时，对照组用相应的单苗进行免疫，以评价三种抗原成份联合应用和相应单一抗原单独使用在免疫效果上的差异。
[0060]1.材料
[0061]PCV-2和猪肺炎支原体二联苗，即组份I，按实施例1制备检验。
[0062]PRRSV弱毒疫苗，即组份II，按按实施例1制备检验。
[0063]PCV-2单组份疫苗，按实施例1制备，其中每头份病毒液含量> IX 15TCID5tl。
[0064]猪肺炎支原体单组份疫苗，按实施例1制备，其中每头份病毒液含量> 3X 108CCU。
[0065]2.试验方法
[0066]2.1组份I和组份II联合应用与PCV-2单组份疫苗免疫效果比较
[0067]用I周龄PCV-2抗原、抗体检测双阴性仔猪20头，分成4组，每组5头。7日龄第2组颈部肌肉注射PCV-2单组份疫苗I头份，2周后(21日龄)用PCV-2单组份疫苗二免I头份；第I组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫I头份，2周后(21日龄)用组份I 二联苗进行二免。第3、4组不免疫。二免2周后(35日龄)第1、2、3组注射PCV2SH株2ml攻毒(含106 °TCID5Q/ml)，观察21日；第四组作为空白对照。分别于攻毒后的7d，14d，21d称量各组猪的体重作记录。于攻毒后第21日扑杀，剖检，根据病理学变化和免疫组化判定结果。
[0068]2.2组份I和组份II联合应用与PRRSV单组份疫苗免疫效果比较
[0069] 用I周龄的PRRSV抗原、抗体检测双阴性仔猪15头，分为3组，每组5只。7日龄第2组用PRRSV单组份疫苗(即组份II) I头份；第I组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫I头份。第3、4组不免疫。免疫3周后(28日龄)第1、2、3组每头注射PRRSV NVDC-JXAI强毒株3ml (含105_°TCID5(l/ml)，攻毒后观察21d。攻毒后仔猪死亡判为发病，根据发病情况判定免疫组攻毒保护效果。
[0070]2.3组份I和组份II联合应用与猪肺炎支原体免疫效果比较
[0071]用I周龄猪肺炎支原体抗原、抗体检测双阴性仔猪15头，分成3组，每组5头。7日龄第2组颈部肌肉注射猪肺炎支原体单组份疫苗I头份，2周后(21日龄)用猪肺炎支原体疫苗二免I头份;第I组用组份I稀释组份II配制成三联苗免疫I头份，2周后(21日龄)用组份I 二联苗进行二免。第3组不免疫。在首次免疫后70d，第1、2、3组用猪肺炎支原体进行攻毒(CVCC354株，购自中国兽医药品监察所，该菌株为中国兽医药品监察所保藏的猪支原体肺炎疫苗效力检验用毒株)，气管注射5ml/头(100MID)，攻毒后观察30天，剖杀试验猪。根据猪支原体肺炎肺病变指数记分标准对试验猪的肺病变进行记分。免疫组与对照组进行肺病变指数差异分析。各试验组仔猪均在攻毒前称重，观察结束时称重，计算攻毒后至观察结束时的平均日增重。
[0072]3结果与讨论
[0073]3.1组份I和组份II联合免疫与PCV-2单组份疫苗免疫效果比较结果
[0074]免疫效果研究结果如表1，组份I和组份II联合应用时对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5(100% )，单苗对猪圆环病毒2型SH株的攻毒保护为5/5(100% )，均呈现良好的免疫效果，表明PCV-2与PRRSV活苗和猪肺炎支原体联合免疫与PCV-2单苗的免疫效果基本相当。在增重方面，多组分疫苗在平均体重增长率比PCV-2 (SH株)单组分疫苗的体重增长率高，这是一个令人意外的结果。
[0075]表1组份I和组份II联合应用与猪圆环病毒2型灭活疫苗单苗(SH株)
[0076]的免疫效果比较
[0077]
【权利要求】
1.致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原在制备预防和治疗猪肺炎支原体污染的猪或受到猪肺炎支原体威胁的猪的疫苗中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，使用致免疫量的PRRSV抗原、致免疫量的猪肺炎支原体抗原和致免疫量的PCV-2抗原首免所述猪，用致免疫量的所述猪肺炎支原体和致免疫量的所述PCV-2抗原二次免疫所述猪。
3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体，所述PRRSV抗原为PRRSV减毒株，所述PCV-2抗原为灭活的PCV-2病毒。
4.根据权利要求2所述的应用 ，其中，所述猪肺炎支原体抗原为灭活的猪肺炎支原体HN0613株，所述PRRSV抗原为PRRSVNVDC-JXA1-R减毒株，所述PCV-2抗原为灭活的PCV-2病毒SH株。
5.根据权利要求2所述的应用，其中，所述猪肺炎支原体抗原为2X18CCU~5 X 18CCU,优选 3 X 18CCU ~5 X 18CCU ；所述 PRRSV 抗原为≥ IX15TCID50,优选≥ I X 16TCID50 ；，所述 PCV-2 抗原为≥ I X 14TCID5。，优选≥ IX15TCID50o
6.根据权利要求2所述的应用，其中，所述首免和二次免疫间隔7~35日，优选14~28日，更优选21~28日。
7.根据权利要求2所述的应用，其中，所述首免I~7日龄仔猪，优选5~7日仔猪。
8.一种疫苗试剂盒，其中，所述试剂盒包括含所述PCV-2抗原、所述猪肺炎支原体抗原和佐剂的组份I，以及含所述PRRSV抗原的组份II。
【文档编号】A61K39/295GK104043118SQ201310076735
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月11日 优先权日:2013年3月11日
【发明者】张许科, 孙进忠, 白朝勇 申请人:普莱柯生物工程股份有限公司