转录因子creb在调控jhdm2a基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用，通过在猪体内过表达CREB，或通过提高猪体内CREB的磷酸化水平，或通过促进猪体内CBP蛋白与磷酸化的CREB的结合，从而上调猪体内JHDM2A基因的表达，使其从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，从而减少猪脂肪沉积。本发明首次提出转录因子CREB在表观遗传学中的新用途，可用于减少猪脂肪沉积，即直接激活组蛋白去甲基化酶JHDM2a的表达，使其能够从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，使脂肪细胞变小，瘦肉率提高。为畜牧业的遗传育种、改善肉质等提供新的候选基因。
【专利说明】转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞信号转导和表观遗传学领域，具体地说，涉及转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用。
【背景技术】
[0002]盐酸克伦特罗(Clenbuter0l，CLB)，化学名为α-[(叔丁胺基)甲基]_4_氨基_3，5-二氯苯甲醇盐酸盐，最初是作为克喘素、氨哮素被合成出来的，用于防治支气管哮喘等疾病，后来作为兴奋剂用于竞技运动中。而CLB最广泛的用途是在畜牧业中作为饲料添加剂“瘦肉精”，不仅可以提高畜禽的生长速度，还可以显著减少脂肪沉积，提高胴体瘦肉率，但是因其在动物体内的残留会使人中毒而被禁止使用。这些功能都源自于盐酸克伦特罗是β 2-肾上腺素受体激动剂,可以结合肾上腺素受体(adrenergic receptor,AR)进而激活下游一系列信号通路，影响脂肪和肌肉组织的脂类代谢。
[0003]大量研究结果表明，CLB和β 2-AR结合后，使β 2-AR的化学结构发生变化，可以激活Gs蛋白的α亚基(Gsa )，进而激活细胞膜上腺苷酸环化酶，催化ATP成为第二信使cAMP, cAMP可以使蛋白激酶A (PKA)释放催化亚基到核内催化其它蛋白的磷酸化，其中包括转录因子 CREB (cAMP 反应兀件结合蛋白，cAMP responsive element binding protein,CREB)的磷酸化，进而调节很多依赖CRE元件的基因转录。
[0004]CRE元件在基因的启动子区,靠近转录起始位点,通常是一组8bp的反向互补序列(5’ -TGACGTCA-3’)，而一半的CRE元件5’ -TGACG-3’和5’ -CGTCA-3’序列也可以起到相同的作用。Creb基因的两个主要翻译产物是CREBa和CREB Λ a，前者有14个氨基酸的a区域，具有较高的活性。人与猪的CREB a和CREB Λ a蛋白质序列是完全相同的。依赖CREB的基因表达需要其KID结构域Serl33位点磷酸化，再结合CREB结合蛋白(CBP)的KIX结构域，从而以复合物的形式调控基因表达。
[0005]CREB调控转录的分子机制已确定。被公认的CREB目的基因的功能涉及信号转导、新陈代谢、神经传递、细胞结构等。但是CREB所能调控的目的基因及所涉及的功能还未被全部发现并报道。
[0006]2009年有报道证明组蛋白去甲基化酶JHDM2a敲除的小鼠比野生型小鼠更肥胖。JHDM2a (JMJDla ;KDM3a)含JmjC功能结构域，能够特异去除组蛋白H3K9的甲基基团，需要铁Fe(II)和α-酮戊二酸作为辅助因子。JHDM2a的去甲基化作用可以直接调控细胞脂类代谢PPAR通路上的基因表达。
[0007]激动剂盐酸克伦特罗引起的脂肪沉积减少，是否涉及表观修饰酶作用，为研究者提供了新的思路。
【发明内容】
[0008]本发明旨在提供转录因子CREB在表观遗传学中的新用途，具体提供转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用。
[0009]为了实现本发明目的，其是通过在猪体内过表达CREB，或通过提高猪体内CREB的磷酸化水平，或通过促进猪体内CBP蛋白与磷酸化的CREB的结合，从而上调猪体内JHDM2A基因的表达，使其从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，从而减少猪脂肪沉积。
[0010]目前已有大量证据表明组蛋白修饰酶调节关键的生物学功能与基因表达，但是关于这些酶是由哪些转录因子调控的报道却很少。本发明通过一系列生物学软件来分析人和猪JHDM2a启动子上的转录因子结合位点。经过分析，发现JHDM2a基因启动子上存在CRE元件，即CREB结合的保守序列。
[0011]由此推断JHDM2a的表达是受CREB调节的，需要ρ-CREB/CBP直接结合在其启动子的CRE元件上。CREB的磷酸化受cAMP-PKA通路调控后，直接激活JHDM2a启动子的活性，从表观遗传学方面协助盐酸克伦特罗调控代谢及其他相关基因的表达，从而使脂肪细胞体积减小，肌肉纤维变得粗大。
[0012]CREB直接激活JHDM2a的表达通过以下实验结果进行验证:
[0013]1、饲喂了 CLB的香猪肌肉组织中，JHDM2a的表达量升高
[0014]提取全同胞香猪的CLB饲喂组和对照组的总RNA和核蛋白，通过电子克隆获得猪组蛋白H3K9去甲基化酶J HDM2a及其他代表性的表观修饰酶的序列，分别在mRNA和蛋白质水平上检测JHDM2a及其它酶在CLB饲喂组和对照组香猪肌肉组织中的表达情况。荧光实时定量PCR和western blot杂交的结果均显示，在肌肉组织里，各表观修饰酶中JHDM2a的表达量升高最为显著(图1A)。
[0015]饲喂了 CLB的香猪各组织(心、肝、脾、肾、肌肉、脂肪、脑)中JHDM2a的mRNA和蛋白质水平都比对照组相应组织中的有显著升高(图1B)。
[0016]2、JHDM2a表达量与CREB表达量、CREB磷酸化水平及p-CREB/CBP的结合正相关
[0017]荧光素酶活性检测发现，在猪和人的细胞中，CREBa可以显著提高连有JHDM2a启动子的荧光素酶活性。说明CREB的表达量升高，JHDM2a的启动子活性就加强。分别将JHDM2a启动子区的两个CRE元件突变，离转录起始位点近的CREl被突变后，CREB不能使启动子活性升高；而离转录起始位点远的CRE2被突变后，启动子的活性依然可以受到CREB的影响。说明只有在转录起始位点上游500bp左右的CRE元件能够影响JHDM2a的启动子活性。转染了外源CREB表达载体的猪LLC-PKl细胞，JHDM2a的表达量也升高了。利用siRNA干扰内源CREB的表达，在CREB表达量降低的同时，JHDM2a的表达量也随之降低了。以上实验结果表明，去甲基化酶JHDM2a的表达量和转录因子CREB的表达量是呈正相关的(图2A)。
[0018]在细胞培养基中添加影响CREB磷酸化的信号通路中的激活剂和抑制剂。其中盐酸克伦特罗和IC1-118，551分别是β 2肾上腺素受体的激活剂和抑制剂，福斯克林是腺苷酸环化酶的激活剂，Η-89是PKA的抑制剂。在mRNA水平上，经激活剂处理过的细胞JHDM2a表达量升高，经抑制剂处理过的细胞表达量下降。在蛋白水平上，激活剂盐酸克伦特罗和福斯克林使CREB的磷酸化水平升高的同时，也使JHDM2a表达量升高；抑制剂ICI和H-89使CREB的磷酸化降低的同时，也使JHDM2a表达量降低。结合了药物处理实验的荧光素酶实验也得到相同的结果。说明JHDM2a的表达和CREB的磷酸化水平有一致性的变化(图2B)。
[0019]CREB磷酸化以后，需要与CREB结合蛋白CBP结合，才能发挥作用。KG-501是一类能阻止CREB和CBP相互作用的抑制剂。在细胞培养基中加入KG-501，免疫共沉淀实验结果的表明，KG-501的浓度越大，CBP分别与CREB和磷酸化的CREB的结合量就越低。相同条件下，JHDM2a的表达量也就越低。荧光素酶实验也验证了这一结果。这些结果说明，CREB与CBP的结合也影响JHDM2a的表达(图2C)。
[0020]3、CREB结合在JHDM2a启动子的CRE元件上，直接调控JHDM2a的表达
[0021]以上实验结果只能说明JHDM2a的表达量与CREB是有关系的，还需要通过体外的直接结合实验，凝胶阻滞实验，以及体内的直接结合实验，染色质免疫共沉淀实验来验证。
[0022]凝胶阻滞EMSA实验结果表明，猪的CREl序列和CREB纯化蛋白在体外可以结合，突变探针不能结合。超迁移实验利用CREB的抗体，进一步验证了这一结合的特异性(图3A)。染色质免疫共沉淀实验，不仅说明CREB是直接结合在距离人和猪JHDM2a基因的转录起始位点较近的CREl元件上。而且在受到盐酸克伦特罗刺激后，CREB与CREl的结合量还增加了。说明盐酸克伦特罗促进JHDM2a的表达量，也可以通过促进CREB的结合来实现(图3B)。
[0023]综上，CREB可以作为β 2-AR信号通路和JHDM2a的链接媒介，CREB直接激活JHDM2a的表达，继而在表观遗传学领域发挥作用，其中包括调控下游脂类代谢相关基因的表达。
[0024]本发明首次提出转录因子CREB在表观遗传学中的新用途，可用于减少猪脂肪沉积，即直接激活组蛋白去甲基化酶JHDM2a的表达，使其能够从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，使脂肪细胞变小，瘦肉率提高。为畜牧业的遗传育种、改善肉质等提供新的候选基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1表明饲喂了 CLB的香猪JHDM2a表达量升高；其中，图1A表示饲喂及未饲喂CLB的香猪肌肉组织中，14种表观修饰酶的表达情况，其中只有JHDM2a表达量显著升高；图1B表示饲喂了盐酸克伦特罗的香猪各组织(脂肪、肌肉、心、肝、脾、肾)中JHDM2a的mRNA(上)和蛋白(下)相对表达量升高。GAPDH基因作为定量PCR的内参。分别比较表达量差异显著性。*P〈0.05，#P〈0.01。组蛋白H3作为Western blot实验中核蛋白的内参。共三次独立实验，每次实验重复三次。所用数据表示平均值+标准误(下同)。
[0026]图2A-C分别表示JHDM2a表达量与CREB表达量、CREB磷酸化水平及p-CREB/CBP的结合正相关。图2A上为用人293T细胞和猪LLC-PKl细胞分别共转染CREBa或CREB Λ a表达载体，以及相应的h/sJHDM2a启动子荧光素酶报告基因载体或hCREl/2和sCREl/2位点突变的报告基因载体，海肾荧光素酶载体pRL-TK，使荧光素酶活性均一化。NI表示pEGFP-Nl空载体；图2A左下为CREB α过表达后，JHDM2a在LLC-PKl细胞核蛋白中表达升高；图2A右下为SiRNA-CREB-+460nt转染后，JHDM2a表达降低(NC表示无义干扰RNA，H3为核蛋白内参)。图2B左上为qRT-PCR检测JHDM2a mRNA在药物处理(激活剂CLB、Forskolin和抑制剂IC1、H89)后的LLC-PKl细胞中的表达，GAPDH作为内参；图2B右上为药物处理后的细胞中CREB的磷酸化水平和JHDM2a的蛋白表达情况，CREB作为p-CREB的内参，H3作为核蛋白的内参；图2B下为在转染了荧光素酶报告基因载体的293T和LLC-PKl细胞中加入激活剂(CLB、Forskolin)和抑制剂(IC1、H89)，检测h/sJHDM2a启动子和突变启动子的活性。图2C左上显示在LLC-PKl细胞培养基中升高KG-501的浓度(O、10、100、200 μ M)，用CBP分别免疫共沉淀CREB和磷酸化的CREB，随KG-501的浓度增大，细胞中CBP分别与CREB和磷酸化的CREB的结合量减少，无义兔IgG(NR IgG)作为阴性对照；图2C右上表明KG-501处理后LLC-PKl细胞中JHDM2a的蛋白表达水平降低；图2C下为荧光素酶报告基因载体转染的293T和LLC-PKl细胞用浓度升高的KG-501处理后检测荧光素酶活性，表明KG-501影响CREB与CBP的结合，继而影响JHDM2a的启动子活性。
[0027]图3表明CREB结合在JHDM2a启动子的CRE元件上，直接调控JHDM2a的表达。图3A的凝胶阻滞实验(EMSA)检测CREB重组蛋白与sCREl和突变的sCREl的体外结合，左图表明猪的CREl序列和CREB纯化蛋白在体外可以结合，突变探针不能结合；右图的超迁移实验用CREB抗体结合CREB/sCREl复合物，验证了结合的特异性。图3B为染色质免疫共沉淀实验，JHDM2a启动子s/hCREl/2元件用CREB抗体共沉淀，无义兔IgG(NR IgG)为阴性对照。Input为免疫共沉淀前总基因组扩增CRE片段，为阳性对照。LLC-PKl和293T细胞都分为CLB(10yM)处理和未处理组。结果显示，CREB是直接结合在离人和猪JHDM2a基因转录起始位点较近的CREl元件上，盐酸克伦特罗刺激后，CREB与CREl的结合量增加。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029]以下实施例中实验对象为全同胞香猪的CLB饲喂组和对照组(不饲喂CLB)。所用细胞系为LLC-PKl (猪肾近曲小管上皮细胞系)和293T (人肾上皮细胞系)。
[0030]实施例1Western Blot 分析
[0031]利用细胞核-细胞质提取试剂盒制备猪各组织和细胞的核提取物。利用BCA试剂盒测定蛋白浓度后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，然后将蛋白转移到PVDF膜上，分别与JHDM2a、CREB、p-CREB (磷酸化的CREB)和His的抗体杂交，H3作为核蛋白的内参。
[0032]实验结果如图1B下、图2A下、图2B右上、图2C右上所示。具体实验步骤如下:
[0033]SDS-PAGE:
[0034](I)组装电泳装置:①将玻璃板先用蒸馏水洗净晾干，准备两个干净的小烧杯玻璃板在灌胶支架上固定好。
[0035](2)根据待分离的蛋白质量大小不同而配制不同浓度的分离胶(参见分子克隆)，灌入玻璃板夹层中，用水封至凝固。
[0036](3)配制浓缩胶，加入到玻璃板夹层中，直至加满。将梳子插入夹层的浓缩胶液体中。
[0037](4)在适量蛋白样品中加入5X蛋白上样缓冲液,连同蛋白Marker于100°C煮沸5 至 1min0
[0038](5)将凝胶板固定到电泳装置的上，加入IX电泳缓冲液，小心拔出梳子。
[0039](6)上样:用注射器(或移液器)将蛋白样品加入到样品孔中。
[0040](7)连接电源，进行电泳。初始电压60V左右，当指示剂显示进入分离胶后改为100V，直到溴酚蓝跑至凝胶底部时停止电泳。弃去电极缓冲液，将凝胶从玻璃板中取出。
[0041]蛋白质转膜过程:
[0042](I)将剥离好的凝胶用适量的转移缓冲液平衡20min。
[0043](2)根据凝胶大小裁剪PVDF膜一张，相同大小滤纸6张。PVDF膜根据使用说明书处理(在甲醇中浸湿10秒，用双蒸水清洗5min，再置于转移缓冲液中平衡1min)浸好，备用。将海绵和滤纸置于转移缓冲液中平衡10~20min，备用。
[0044](3 )组装转膜夹层:负极(黑板)-海绵-滤纸-凝胶-膜-滤纸-海绵-正极(白板)，用玻璃棒排去夹层间的气泡。夹紧转膜夹，完成组装。
[0045](4)在转膜槽中加入转移缓冲液，按正确的极性方向将转移夹放入电泳仪中，将电泳仪放入4°C室，连接电源。350mA电泳60至90min。
[0046](5)关闭电源，撤卸转膜装置，取出PVDF膜，并在膜上剪一个小角，标记定位。
[0047]抗体杂交:
[0048](I)封闭:将膜放入合适大小的自封袋中，加封闭液10~15ml,封闭。室温在旋转摇床或摆动平台中摇动60min或4°C过夜。
[0049](2)孵一抗:倾去封闭液。按抗体说明书提供的浓度用封闭液稀释一抗，将膜封闭在一抗中，室温孵育60min。
[0050](3)孵二抗:按抗体说明书封闭液稀释辣根过氧化物酶连接的抗Ig的二抗，室温孵育60min。用TBST洗膜三至六次，每次10~15min。
[0051]发光底物显影:
[0052](I)准备:取一定量的显影液、定影液分别盛于两容器，并再另用一容器盛一定量水作停影用；配发光底物(根据膜大小按1:1取A、B液一定体积混匀)；将膜从缓冲液中取出，吸干表面的TBST，勿干透，将膜正面(有蛋白面)朝上放在自封袋上，避免气泡；根据膜的大小剪好胶片。
[0053](2)将发光底物(AB混合液)滴加到膜上，均匀覆盖整张膜，室温温育l_2min (HRP0反应)，至可见荧光条带。
[0054](3)用自封袋盖住膜(避免气泡)，再将胶片放在其上，盖上暗盒压片5s~5min。
[0055](4)显影:将曝光过的胶片马上放入显影液中，显影时间根据观察而定。
[0056](5)定影:将显影过有条带的胶片放入水中停影，随即放入定影液中定影至胶片透明。
[0057](6)定影好的胶片从暗室中取出后，用自来水冲洗、晾干、标记，扫描，及分析。
[0058]实施例2 定量 PCR (qRT-PCR)
[0059]用TRIzon试剂盒提取猪组织和细胞的总RNA，利用反转录酶合成cDNA。设计定量PCR引物，定量PCR引物序列见表1，利用ABI7900HT定量PCR仪和SYBR Green等检测内源特定基因的mRNA水平。
[0060]表1猪组蛋白修饰酶定量PCR弓丨物
【权利要求】
1.转录因子CREB在调控JHDM2A基因表达及减少猪脂肪沉积中的应用，其特征在于，通过在猪体内过表达CREB，或通过提高猪体内CREB的磷酸化水平，或通过促进猪体内CBP蛋白与磷酸化的CREB的结合，从而上调猪体内JHDM2A基因的表达，使其从表观遗传学方面调控脂类代谢通路，从而 减少猪脂肪沉积。
【文档编号】A61K38/17GK104069482SQ201310102478
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月27日 优先权日:2013年3月27日
【发明者】胡晓湘, 李旸, 李宁 申请人:中国农业大学