一种表皮组织培养方法、制得的表皮组织培养物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种表皮组织培养方法、该方法获得的表皮组织培养物以及该表皮组织培养物在皮肤美容领域中的应用。所述表皮组织培养方法包括将黑色素细胞和表皮角质细胞所组成的培养混合物在以表皮角质细胞数量为100的情况下，黑色素细胞数量在0.01～50之间的细胞数量比进行培养。
【专利说明】-种表皮组织培养方法、制得的表皮组织培养物及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种表皮组织培养方法，该方法获得的表皮 组织培养物以及该表皮组织培养物在皮肤美容领域中的应用。
【背景技术】
[0002] 表皮组织培养物在医疗和美容领域有着广泛的应用。例如，从表皮细胞核真皮细 胞培养得到的表皮片组织可用于烧伤部位的治疗。对于一些疤痕情况也可采用这种治疗方 法。大面积黑痣切除后，通常也需要贴上培养的表皮组织，治疗黑痣而不留疤痕。
[0003] 决定皮肤颜色最重要的因子是一种被称为黑色素的色素性物质。黑色素的形成是 由存在于表皮基底层的黑色素细胞产生的。而后天性色素脱失症的寻常型白癜风，就是由 于黑色素的形成受到了异常的阻碍，或者黑色素细胞消失所引起的。目前，治疗白癜风的方 法包括激素治疗以及光化学疗法。但是，这些疗法的预后不稳定，需要持续性治疗。
[0004] 除上述治疗方法外，也有从其他部位取皮或毛囊进行移植的治疗方法。但是，这种 疗法会造成与治疗部位同等面积的皮肤缺损，因此当治疗部位面积相对大时就不能进行此 类治疗了。另外，也有从自体采取黑色素细胞，经过体外培养后再注射移植的治疗方法。此 疗法与自体取皮相比，可以进行相对大面积的治疗，但是在注射部位造成色素分布不均，大 面积治疗时要达到色素的均匀分布是非常困难的。
[0005] 针对上述问题，本发明提供了一种新的表皮组织培养方法，该方法包括在以表皮 角质细胞数量为100的情况下，黑色素细胞数量在0. 01?50之间的细胞数量比进行培养。 出人意料的是，该方法制备得到的表皮组织培养物具有完整的成片状形状，在美容和医疗 应用时能够实现大面积的色素均匀分布。
【发明内容】
[0006] 白癜风是一种常见多发的色素性皮肤病，该病以局部或泛发性色素脱失形成白斑 为特征，是一种获得性的，皮肤色素脱失形成的白色斑片。寻常型白癜风的主要病因为色素 异常，所以普遍认为寻常型白癜风的治疗不需要表皮角质细胞。但是，本发明的
【发明者】使用 黑色素细胞和表皮角质细胞共同培养的混合物，成功地对大面积寻常型白癜风患者进行了 移植治疗，且术后效果显著，色素亦能均匀地再生。
[0007] 因此，在本发明的一方面，提供了一种表皮组织培养方法，该方法包括将黑色素细 胞和表皮角质细胞所组成的培养混合物在以表皮角质细胞数量为1〇〇的情况下，黑色素细 胞数量在0. 01?50之间的细胞数量比进行培养。
[0008] 在本发明的一个实施方式中，表皮组织培养物的培养时间为10-50天。
[0009] 在本发明的一个实施方式中，在没有使用小鼠等动物来源的异种滋养细胞层的情 况下进行培养。
[0010] 在本发明的另一方面，提供了一种表皮组织培养物，该表皮组织培养物是通过将 黑色素细胞和表皮角质细胞所组成的培养混合物在以表皮角质细胞数量为100的情况下， 黑色素细胞数量在0. 01?50之间的细胞数量比进行培养得到的。
[0011] 在本发明的一个实施方式中，表皮组织培养过程中使用的黑色素细胞和表皮角质 细胞是自体获得的。
[0012] 在本发明的一个实施方式中，本发明方法的培养得到的表皮组织培养物有完整的 成片状的形状。
[0013] 在本发明的一个实施方式中，本发明方法的培养得到的表皮组织培养物累积有 2?10层的细胞层状态。
[0014] 在本发明的一个实施方式中，本发明方法的培养得到的表皮组织培养物中的黑色 素细胞有树枝状结构。
[0015] 在本发明的又一方面，提供了 一种表皮组织培养物在制备皮肤美容产品中的应 用。
[0016] 在一些实施方式中，本发明提供了表皮组织培养物在制备美白产品中的应用。在 一些实施方式中，本发明提供了表皮组织培养物在制备白癜风治疗产品中的应用。在一些 实施方式中，本发明提供了表皮组织培养物在制备痤疮治疗产品中的应用。在一些实施方 式中，本发明提供了表皮组织培养物在制备烧伤治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本 发明提供了表皮组织培养物在制备大面积黑痣治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本 发明提供了表皮组织培养物在制备纹身治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提 供了表皮组织培养物在制备过度晒伤治疗产品中的应用。
[0017] 本发明表皮组织培养方法的优点包括：
[0018] (1)适用于治疗大面积的皮肤损伤（例如，寻常型白癜风、过度晒伤、大面积黑痣、 烧伤、疤痕、痤疮、纹身等等），并能达到色素均匀分布的再生效果；
[0019] (2)适用于美白产品，例如适用于考核美白效果时对黑色素细胞进行的药效评 价；
[0020] (3)由于所得表皮组织培养物的形态是皮片状的，所以进行移植也非常简易；以及
[0021] (4)在优选的实施方式中，黑色素细胞和表皮角质细胞来源于同一个体，移植后不 会有排异反应发生，预后也良好。
[0022] 黑色素细胞是形成黑色素的色素细胞。本发明对于黑色素细胞的采集没有部位的 局限性，可以从表皮基底层或毛囊基底部充分获取。表皮角质细胞是构成表皮的上皮细胞， 所以也可以从表皮基底部或毛囊基底部（Bulge位置）获取。
[0023] 本发明是着重于黑色素细胞和表皮角质细胞共同培养，通过细胞间的相互作用， 从而使黑色素细胞形成了近似人体内的树枝状结构，并使其保有很高的黑色素产生机能。 而且在移植前，因为必须将治疗部位的表皮先打磨掉，同时本发明的表皮组织培养物含有 表皮角质细胞，所以附着率非常高，预后良好。而且表皮角质细胞发挥了构建组织形态的机 能，使其更易保持片状的结构，移植手术也更易操作。
[0024] 黑色素细胞和表皮角质细胞的数量比，当表皮角质细胞为100时，黑色素细胞常 规为0.01?50之间，其中较好是0.05?30之间，很好是0. 1?20之间，非常好是1?10 之间。低于上述数量比下限的话，黑色素细胞的密度低，对于寻常型白癜风的治疗则不理 想。高于上述数量比上限的话，由于培养混合物的黑色浓度过高，不仅不利于色素的改善， 且术后容易产生色素分布不均匀的现象。上述比例应该根据不同人种在以上范围内进行适 当的调节。这个比例可根据之后所描述的培养方法和培养基等进行适当的调整。这个数量 比可以使用光学显微镜进行观测计算，而培养物则可以通过消化酶处理后，使用细胞计数 器或库尔特计数器来进行计算。
[0025] 本发明中的表皮组织培养物，对寻常型白癜风患者的治疗时优选自体由来的。而 且，黑色素细胞及表皮角质细胞都采自同一自体，因此可以给同一自体提供自己的表皮组 织培养物。
[0026] 本发明的表皮组织培养物中的黑色素细胞因为是和表皮角质细胞共同培养，会形 成多个树枝状突起形态，因此能够提供近似身体状态的环境。这类形态可以通过多巴染色 等方法对黑色素细胞混合物进行染色，然后通过光学显微镜来观察。根据观察显示该形态 标志着此表皮组织培养物形成黑色素的能力非常高。
[0027] 本发明的表皮组织培养物，以持有完整的皮片状的形态为优。因为，它不仅非常适 用于移植手术，对于大面积治疗也能够作到同一地处置。另外本发明的表皮组织培养物，以 有2层以上的细胞层的构造为优。因为是2层以上的厚度，所以在移植的时候不仅容易操 作，并且术后的生长也非常理想。细胞层的层数虽然没有规定上限，但控制在10层以下比 较好，最好是在8层以下。层数如果超过上述上限的话，培养中的表皮组织培养物的一部分 容易发生坏死现象。
[0028] 表皮组织培养物的制作方法虽然没有特别限制，但按照以下方法能够顺利地制作 出来。
[0029] 从腰部，腹部，背部，臀部等，主要是从能被衣服所遮盖的部位采集表皮组织。采集 的组织片在培养前，以将其浸在含消化酶的培养基中进行处理为佳。作为此类消化酶，胰蛋 白酶（trypsin),胶原酶（collagenase)，分散酶（dispase)等都有效。作为溶解消化酶的 培养基，可以使用用于原代培养的无血清培养基或同类产品。另外，例如Dulbecco's MEM 等也用的很好。
[0030] 表皮组织培养物这项发明虽然使用滋养细胞也能够很好的制作出来。但是为了确 保更高的安全性，更好地提高身体适应性，以不使用小鼠等动物来源的异种滋养细胞的培 养方法为佳。作为无滋养细胞的培养方法，有使用滋养细胞培养悬液或者滋养细胞提取物 的，但是本发明所用的是上面所描述的用特定比率的对黑色素细胞和表皮角质细胞进行共 同培养，可以制作出更合适的表皮组织培养物。
[0031] 作为适用于黑色素细胞以及表皮角质细胞培养用的培养基，从可以培养单一细胞 这点出发，Ca 2+浓度不高于0. 1mm，使用不含ΒΡΕ (牛下垂体提炼物）的无血清培养基，类似 于这样的培养基有：DEFINED KERATINOCYTE-SFM(商品名），由GIBC0公司提供。
[0032] 这类无血清培养基之中也能添加胰岛素，EGF，FGF之类的激素或成长因子。另 夕卜，作为常规的细胞培养用的培养基也是可以使用的，比如说：除上面记载之外，MCDB153、 Mediuml99、DMEM(Dulbecco' s MEM)、RPMI1640、F-10、F-12、MMEM、Keratinocyte SFM ; GIBCO, 17005-042、EpiLife，Cascade 公司提供，M-EPIcf-500、Dulbecco, s MEM+10%FBS 等。 作为添加物，除了上述之外，加入氢化可的松，转铁蛋白，孕酮，乙醇胺等也是可以的。
[0033] 为了更大范围的适用，也能够通过细胞传代培养更多的细胞。但是，传代过多时， 黑色素细胞的黑色素的生成能力就会降低，所以最好是〇?3代之间的细胞。在细胞传代 的时候，使用常规的像胰蛋白酶等的处理方法即可。
[0034] 为了得到较好的有复数细胞层的表皮状的培养混合物，细胞在到达饱和后，需要 使用分化培养用的培养基。在无血清培养基中添加使Ca 2+浓度达到0. 2?2. 2之间的氯化 钙，可以把它作为分化用培养基使用，或者使用比他更合适的KGM培养基。在分化培养基中 经过3?14天，或者5?12天的培养，细胞就能形成多层片状的培养混合物。用于分化诱 导的无血清培养液Ca 2+合适的浓度0. 5?1. 9mM较好，0. 8?1. 6mM更好，1. 0?1. 4mM的 范围更理想。
[0035] 表皮组织培养物根据上述培养方法培养，常规在10?50天之间，最好是控制在 12?35天之间。
[0036] 表皮组织培养物这项发明虽然非常适用于寻常型白癜风的治疗，但也适用于烧 伤，过度晒伤，痣，刺青等各类色素异常的治疗。另外，不仅在医疗方面，也应用于考核美白 效果时对黑色素细胞进行的药效评价。
[0037] 附图简述
[0038] 图1显示了根据本发明方法培养得到的表皮组织培养物。
[0039] 图2显示了本发明方法培养得到的表皮组织培养的显微镜观察影像，以及多巴染 色影像。箭头所指的是黑色素细胞。 具体实施方案
[0040] 以下是对于此项发明的表皮组织培养物以及用途和制造方法的实例展示以及具 体说明，但是本发明并不局限于此。
[0041] (1)皮肤样品采集以及表皮组织培养物的制作：
[0042] 在受试者腰部使用70%酒精棉球进行消毒，从患者身体采集组织片。采集的组 织片浸泡在碘液中进行消毒，然后用PBS清洗。将组织片切碎，浸渍到用DMEM5倍稀释的 TryPLE (Gibco公司）中，4°C环境下放置16?24个小时。常温搅拌30分钟，使用cell strainer过滤设备（BD公司）将残渔除去。形成的细胞悬液进行离心处理，回收细胞。然 后关于残渣的处理，使用胶原蛋白酶在37°C环境处理3小时，然后与上述方法同样进行细 胞回收。回收的细胞播种到60mm培养皿中，使用无血清培养液（DK-SFM ;GIBC0公司）放置 于37°C 5%二氧化碳培养箱中培养。培养10?20天，长满后，更换培养液KGM，再培养7? 10天，获得了表皮组织培养物（图1)。
[0043] (2)多巴染色等
[0044] 将表皮组织培养物进行多巴染色，使黑色素细胞着色。使用光学显微镜，观察被 多巴染色的黑色素细胞的形状，黑色素细胞和表皮角质细胞的数量以及堆积成层的细胞数 (图 2)。
[0045] (3)向人体移植
[0046] 对受试者的寻常型白癜风部位使用70%酒精棉球进行充分消毒，打磨掉表皮。将 表皮组织培养物平铺于被打磨的部位。覆盖消毒纱布，缠绷带，固定。3?5个月后目测移 植部位，和非白癜风部位进行比较，无色素斑，判定良好。
[0047] 表 1?
[0048]
【权利要求】
1. 一种表皮组织培养方法，该方法包括将黑色素细胞和表皮角质细胞所组成的培养混 合物在以表皮角质细胞数量为100的情况下，黑色素细胞数量在0. 01?50之间的细胞数 量比进行培养。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法培养10-50天。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，在没有使用小鼠等动物来源的异种滋养细 胞层的情况下进行培养。
4. 如权利要求1所述的方法得到的表皮组织培养物。
5. 如权利要求4所述的表皮组织培养物，其特征在于，所述黑色素细胞和表皮角质细 胞是自体获得的。
6. 如权利要求4所述的表皮组织培养物，其特征在于，所述表皮组织培养物有完整的 成片状的形状。
7. 如权利要求4所述的表皮组织培养物，其特征在于，所述表皮组织培养物累积有2? 10层的细胞层状态。
8. 如权利要求4所述的表皮组织培养物，其特征在于，所述表皮组织培养物中的黑色 素细胞有树枝状结构。
9. 如权利要求4所述的表皮组织培养物在制备皮肤美容产品中的应用。
10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述皮肤美容产品包括：美白产品、白癜风 治疗产品、过度晒伤治疗产品、烧伤治疗产品、大面积黑痣治疗产品、疤痕治疗产品、痤疮治 疗产品和纹身治疗产品。
【文档编号】A61L27/38GK104099289SQ201310119790
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月8日 优先权日:2013年4月8日
【发明者】宇山太郎, 吴复跃, 大槻忠男, 何振东 申请人:瑞田投资有限公司, 上海尚瑞生物医药科技有限公司