专利名称：一种猪脾转移因子注射液的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品的制备方法，特别是涉及一种猪脾转移因子注射液的制备方法。
背景技术：
现代集约化养殖业，常发性、多发性传染病种类繁多，应用疫苗接种免疫预防各种传染病成为养殖业成败的关键。疫苗免疫效果受外因和内因多种因素的影响，外因有疫苗质量、保管和使用方法等，关键是内因，主要是机体抗病力和对疫苗的反应，尤其是机体的免疫系统功能状态。影响机体免疫系统功能状态的因素很多，如某些疾病、应激、抗生素的应用、营养不良等都能使机体的免疫系统功能下降或抑制而影响免疫效果。开发应用动物免疫增强剂改善机体特异性、非特异性免疫系统功能，提高疫苗免疫效果，增强机体抗感染能力已日益引起人们的重视。转移因子(Transfer factor)是动物体内有免疫活性的T淋巴细胞所释放的多种因子中一种能够转移免疫致敏信息的因子，它能够特异性地将供体某一细胞免疫功能转移给受体动物，非特异性地增强受体动物免疫功能，是一种新型的免疫激发剂。传统生产方法生产猪脾转移因子注射液，原料经预处理、绞碎、匀浆、反复冻融、离心、透析、离心、过滤等工艺制成，经传统生产工艺加工会破坏原材料的生物活性成分，有效成分利用率低，且生产周期长，至少需要7天。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪脾转移因子注射液的制备方法，以解决上述工艺生物活性成分被破坏，有效成分利用率低和生产周期长的问题。
技术方案如下:—种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括:将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞I 3遍；将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5 8分钟，制成匀浆；在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活；将灭活的匀浆反复冻融6 10次；将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品；向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。进一步，所述预处理过程中，将猪脾脏解冻融化后，用剪刀剪去脂肪，再用浓度为
0.5 1.5%氯化钠溶液清洗2 3次。进一步，所述精绞过程中，将初绞的猪脾与纯化水按1:1 3的比例混合，置于胶体磨中研磨。进一步，所述灭活过程中，甲醛溶液的加入量占匀浆总量的0.1 0.2%。进一步，所述灭活条件为，37 42°C下灭活18 24小时，中间间隔4 6小时震摇I次。进一步，所述离心分离过程中，将反复冻融的匀浆置管式分离机中，将冻融的匀浆，室温下以16000 20000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。进一步，所述过滤过程中，将离心分离得到的上清液先经0.43 0.46 μ m的微孔滤膜第一次过滤，再用0.20 0.26 μ m的微孔滤膜第二次过滤。进一步，所述超滤使用截留分子量为5000 6000道尔顿超滤膜。 进一步，将检验合格的猪脾脏去除脂肪，用浓度为0.9%氯化钠溶液清洗3次，于绞肉机中初绞I遍；将初绞的猪脾脏与纯化水按1: 1.5的比例混合，于胶体磨中研磨5分钟，制成匀浆；向匀浆中加入匀浆总量0.1%的甲醛溶液，37°C灭活24小时，间隔5小时震摇I次；将灭活的匀浆置于-20°C冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37°C ;将离心分离得到的上清液先用0.45 μ m的微孔滤膜进行过滤，再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤，最后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。进一步， 半成品中加入注射用水后，加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3 7.5之间。本发明的有益效果:(I)本发明生产的猪脾转移因子注射液主要成分为低分子活性多肽和核糖，是一种低分子肽一核苷酸复合物，而不是蛋白质。(2)本发明所用原料、仪器取材容易，工艺简单，成本低，可大大缩短生产周期，周期为4天，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率，为满足工业化大规模生产提供了可行途径。(3)本发明生产的猪脾转移因子注射液应用安全，过量使用也无毒副作用，无药物残留；活性高，临床用量小，见效快，使用后24 36小时就可发挥作用，效果可持续7天以上。(4)本发明生产的猪脾转移因子注射液能增强动物免疫功能，提高机体抗感染能力；不仅可用于预防，也可用于病毒感染引起的疾病的紧急辅助治疗；配合疫苗同时使用，增强疫苗免疫效果，并且可以弥补疫苗接种后，抗体产生的时间空缺。(5)传统工艺中离心分离多采用4°C，6000r/min离心15min，收集上清液。本发明的改进工艺中应用管式分离机，克服了制备过程中原料粘度大，颗粒小，比重差小，絮状物多等问题；且加工材料原有生物活性成分主要为多肽、氨基酸，本发明工艺有效的保护了加工材料原有生物活性成分不被破坏；同时采用室温下16000 20000r/min高速连续离心的方法，极大的节省了人力物力，增加了产量，每天产量可达2吨，约2000L，提高了收益率，Ikg脾脏大约出1.8L半成品，适用于工业化大规模推广应用。
具体实施例方式本实施例中以猪脾脏为原料，经剪摘、称量清洗、初绞、精绞、灭活、冻融、离心分离、澄清过滤与超滤等过程制成转移因子注射液半成品，传统生产方法将原料经预处理、绞碎、匀浆、反复冻融、离心、透析、离心、过滤过程制成，本发明更注重了对离心分离过程、初绞次数、精绞时间、甲醛灭活终浓度、冻融次数的控制。半成品经检验合格后，调整含量、PH值进一步制成转移因子注射液成品。
实施例1:猪脾转移因子注射液的制备方法一种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下:S1:猪脾脏的收集与检验；原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数(Most probable number, MPN)检验,霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应< 104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN < 150万/g为合格；霉菌总数< 100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。S2:剪摘:将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:将剪摘后的原料用浓度为0.5%氯化钠溶液清洗2次。S4:初绞:将猪脾原料 置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞2遍，并用洁净物料桶盛装。S5:精绞:将初绞的猪脾与纯化水按1:1的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨1.5分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。S6:灭活:按匀浆总量的0.2%加甲醛溶液，42°C灭活18小时，间隔4小时震摇I次。S7:冻融:将灭活的匀浆，置_18°C冷库反复冻融6次，融化温度不得超过37°C。S8:离心分离:将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以18000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。S9:澄清过滤与超滤:上清液用0.43 μ m的微孔滤膜进行过滤，再用0.20 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为6000道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在_20°C以下，保存期为12个月。SlO:半成品检验:半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。Sll:成品制备:将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml,核糖含量不少于50 μ g/ml,搅拌30分钟后,用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3 7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。实施例2:猪脾转移因子注射液的制备方法
—种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下:S1:猪脾脏的收集与检验；原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数(Most probable number, MPN)检验,霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应< 104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN < 150万/g为合格；霉菌总数< 100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。S2:剪摘:将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:将剪摘后的原料用浓度为0.9%氯化钠溶液清洗3次。S4:初绞:将猪脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞I遍，并用洁净物料桶盛装。S5:精绞:将初绞的猪脾与纯化水按1:1.5的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨5分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗 透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。S6:灭活:按匀浆总量的0.1%加甲醛溶液，37°C灭活24小时，间隔5小时震摇I次。S7:冻融:将灭活的匀浆，置_20°C冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37°C。S8:离心分离:将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以16000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。S9:澄清过滤与超滤:上清液用0.45 μ m的微孔滤膜进行过滤，再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在_20°C以下，保存期为12个月。SlO:半成品检验:半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。Sll:成品制备:将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml,核糖含量不少于50 μ g/ml,搅拌30分钟后,用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3 7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。实施例3:猪脾转移因子注射液的制备方法一种猪脾转移因子注射液的制备方法，具体步骤如下:
S1:猪脾脏的收集与检验；原料选取标准化生猪养殖、屠宰企业收集猪脾脏，标准化生猪养殖、屠宰企业，此屠宰企业应具有《动物防疫合格证》，屠宰场应符合中华人民共和国国家标准GB/T17236-1998《生猪屠宰操作规范》规定，卫生要求应符合《肉类加工卫生规范》GB12649的规定。本实施例所用原料——猪脾脏来自山东得利斯集团，符合猪脾脏原料地及屠宰要求。猪脾脏经外观检验、卫生检验、病原微生物检验，检验合格后方可用作原料。猪脾脏外观检验，健康猪脾脏应呈扁长条形，色泽均匀一致，呈暗红色或棕红色，无充血、结节、出血点及肿胀等病灶，具有一定的弹性和硬度，被膜呈灰白色、浅褐色或微灰红色，切面呈深红色，实质柔软，较脆，无腐败变质等现象，有猪脾脏固有的气味。卫生检验，包括细菌总数检验，大肠杆菌最可能数(Most probable number, MPN)检验,霉菌总数检验。细菌检验中标准细菌总数应< 104/g为合格；大肠杆菌最可能数检验，标准大肠杆菌MPN < 150万/g为合格；霉菌总数< 100个/克为合格。病原微生物检验，包括口蹄疫病毒检验，猪瘟病毒、猪细小病毒检验。口蹄疫病毒检验采用乳鼠检查法；猪瘟病毒、猪细小病毒采用外源病毒检查法。
S2:剪摘:将解冻融化的猪脾脏去掉装袋，按猪脾脏原料标准中外观项要求，严格挑选，并用镊子夹住脂肪，用剪刀剪去。S3:清洗:将剪摘后的原料用浓度为1.5%氯化钠溶液清洗3次。S4:初绞:将猪脾原料置于绞肉机装料斗内，按绞肉机操作规程进行操作，初绞3遍，并用洁净物料桶盛装。S5:精绞:将初绞的猪脾与纯化水按1: 3的比例混合，置于胶体磨装料斗中，按胶体磨操作规程将其研磨8分钟，制成匀浆，并用洁净物料桶盛接。所用纯化水为原水经蒸馏法、离子交换法、反渗透法或其适宜方法制得的供药用的水，不含任何添加剂。S6:灭活:按匀浆总量的0.15%加甲醛溶液，40°C灭活20小时，间隔6小时震摇I次。S7:冻融:将灭活的匀浆，置_19°C冷库反复冻融10次，融化温度不得超过37°C。S8:离心分离:将冻融的匀浆置管式分离机中，室温以20000r/min连续离心，去沉淀，取上清液备用。S9:澄清过滤与超滤:上清液用0.46 μ m的微孔滤膜进行过滤，再用0.23 μ m的微孔滤膜进行过滤除菌，然后用截留分子量为5500道尔顿超滤膜进行超滤，即得转移因子注射液半成品。超滤液在_20°C以下，保存期为12个月。SlO:半成品检验:半成品经pH值、无菌检验、含量测定、鉴别检验、高分子量物质检验等检验项目合格后，_20°C保存备用。Sll:成品制备:将半成品溶液移入配液罐中，根据半成品含量测定结果，加入注射用水，使多肽含量不少于1.5mg/ml,核糖含量不少于50 μ g/ml,搅拌30分钟后,用盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3 7.5之间，混匀，即得成品。所用注射用水是普通注射用水，由纯化水经蒸馏所得。实施例4:初绞次数对半成品的影响传统工艺中初绞次数一般为3次，经反复研究确定初绞次数为I次，极大的节省了人力物力。
本实施例中，将猪脾脏使用绞肉机进行不同次数的重复绞碎，每组绞碎的脾脏样品设置3个平行样，其他生产工艺按照实施例2的步骤执行，不同绞碎次数生产出的半成品含量检测结果见表I。表I
权利要求
1.一种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括: 将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞I 3遍； 将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5 8分钟，制成匀浆； 在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活； 将灭活的匀浆反复冻融6 10次； 将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品； 向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。
2.如权利要求1所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述预处理过程中，将猪脾脏解冻融化后，用剪刀剪去脂肪，再用浓度为0.5 1.5%氯化钠溶液清洗2 3次。
3.如权利要求2所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述精绞过程中，将初绞的猪脾与纯化水按1:1 3的比例混合，置于胶体磨中研磨。
4.如权利要求3所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述灭活过程中，甲醛溶液的加入量占匀浆总量的0.1 0.2%。
5.如权利要求4所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述灭活条件为，37 42°C下灭活18 24小时，中间间隔4 6小时震摇I次。
6.如权利要求5所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述离心分离过程中，将反复冻融的匀浆置 管式分离机中，将冻融的匀浆，室温下以16000 20000r/min的转速连续离心，去沉淀，取上清液备用。
7.如权利要求6所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述过滤过程中，将离心分离得到的上清液先经0.43 0.46 μ m的微孔滤膜第一次过滤，再用0.20 0.26 μ m的微孔滤膜第二次过滤。
8.如权利要求7所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:所述超滤使用截留分子量为5000 6000道尔顿超滤膜。
9.如权利要求8所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:将检验合格的猪脾脏去除脂肪，用浓度为0.9%氯化钠溶液清洗3次，于绞肉机中初绞I遍；将初绞的猪脾脏与纯化水按1: 1.5的比例混合，于胶体磨中研磨5分钟，制成匀浆；向匀浆中加入匀浆总量0.1%的甲醛溶液，37°C灭活24小时，间隔5小时震摇I次；将灭活的匀浆置于_20°C冷库反复冻融8次，融化温度不得超过37°C ;将离心分离得到的上清液先用0.45 μ m的微孔滤膜进行过滤，再用0.22 μ m的微孔滤膜进行过滤，最后用截留分子量为5000道尔顿超滤膜进行超滤。
10.如权利要求1所述的猪脾转移因子注射液的制备方法，其特征在于:半成品中加入注射用水后，加入盐酸或氢氧化钠溶液调pH至6.3 7.5之间。
全文摘要
一种猪脾转移因子注射液的制备方法，包括将检验合格的猪脾脏预处理后，初绞1～3遍；将初绞的猪脾脏精绞研磨1.5～8分钟，制成匀浆；在所述匀浆中加入甲醛溶液灭活；将灭活的匀浆反复冻融6～10次；将反复冻融的匀浆经离心分离、过滤与超滤，得到半成品；向检验合格的半成品中加入注射用水，得到成品。本发明工艺简单，成本低，可大大缩短生产周期，周期为4天，节省了大量的人力物力，提高了转移因子的生产效率。
文档编号A61K38/19GK103212062SQ20131013647
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月18日 优先权日2013年4月18日
发明者李朝阳, 乔彦良 申请人:山东信得科技股份有限公司