PEG-PLA纳米材料包被的HBV-CpG在乙肝预防和/或治疗中的应用的制作方法

文档序号:1022606阅读:455来源:国知局
专利名称:PEG-PLA纳米材料包被的HBV-CpG在乙肝预防和/或治疗中的应用的制作方法
技术领域
本发明涉及两条来源于HBV基因组的CpG寡核苷酸序列(HBV-CpG),本发明还涉及由纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG制得的纳米颗粒,本发明还涉及纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG运用于乙肝的预防和/或治疗。
背景技术
慢性乙型肝炎病毒感染是危害全球人类健康的难题,目前全球至少有3.6亿乙型肝炎病毒(HBV)携带者,而其中有超过三分之一人群在中国。现有的乙肝表面抗原疫苗(HBsAg)通过诱导体液免疫应答作为预防性疫苗使用,但是仍然有约10%的疫苗接种者不能产生保护性抗体,而且疫苗对慢性乙肝患者是无治疗效果的。现有的抗乙肝药物如干扰素和拉米夫定可以抑制病毒复制和减轻肝脏损伤,但是由于病毒cccDNA(共价互补环状DNA)的持续存在以及免疫应答缺陷导致最终并不能达到彻底清除乙肝病毒的目的,并且一部分患者对于现有的抗病毒药物治疗无应答。因此发展更为有效的抗病毒药物是迫切需要的。HBV是一种善于免疫逃逸的病毒,HBV感染早期不引起包括I型干扰素(IFN)在内的强烈天然免疫应答表达,那么诱导特异性免疫应答来治疗慢性乙型肝炎显得尤为重要。已有大量的文献表明细菌DNA的非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(cytosinephosphate-guanosine, CpG)的序列能够活化免疫应答特别是Thl型免疫应答,CpG DNA能被模式识别受体9 (Toll-like receptor 9,TLR9)识别。TLR9在人体中表达在浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells, pDC)细胞和B细胞中。而pDC是已知的重要的表达IFN的细胞。非甲基化的CpG 序列和TLR9的相互作用必然会诱导免疫级联反应包括增强抗原呈递以及诱导I型干扰素等细胞因子。以往的研究结果表明CpG ODN广泛应用于肿瘤、传染性疾病和过敏性疾病的免疫治疗。一些研究显示CpG ODN作为佐剂可以应用于乙肝的预防和治疗,但是已有的CpG ODN治疗乙肝的研究并都未能达到彻底地清除乙肝的效果,同时过强的毒副效应限制了其应用。聚乳酸(PLA)是一类合成的可生物降解的聚合物,已被美国FDA批准用于组织工程、医用材料、药物载体等,但是由于PLA因疏水性较强而不利于难溶性药物的释放,对极性药物的载药率低,因而其应用受到限制。研究者利用聚乙二醇(PEG)对PLA化学结构进行修饰,形成PEG-PLA嵌段共聚物。已有的研究显示(PEG-PLA)纳米颗粒具有可生物降解性、良好的生物相容性以及两亲性的特点,作为微粒给药系统的载体材料可以增强载药量、靶向给药系统、降低突释效应、提高药物在血液中的循环时间、提高生物利用度等优势。因此PEG-PLA微球纳米粒作为新型微粒给药系统有着广阔的发展和应用前景
发明内容
本发明的一个目的是提供来源于HBV基因组的CpG寡核苷酸序列,即HBV-CpG,所述寡核苷酸序列如SEQ ID NO:1或2所示。本发明的再一个目的是提供由纳米材料(PEG-PLA)包被的HBV-CpG,即形成一种纳米颗粒,表示为NP (HBV-CpG)。本发明的又一个目的是提供纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG在乙肝预防和/或治疗中的应用。本发明的又一个目的是提供纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒中的应用。本发明的又一个目的是提供一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒,所述试剂盒包含乙型肝炎疫苗和本发明的由纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG ( S卩,本发明的纳米颗粒(NP(HBV-CpG)))。其中所述乙型肝炎疫苗即为目前常规应用的乙型肝炎疫苗。本发明的第 一个方面提供具有诱导a干扰素(IFN-α )表达功能的HBV-CpG。本发明人通过基因比对设计了一系列来自HBV基因的CpG序列(HBV-CpG)。通过将这些HBV-CpG候选子分别与人外周血单核细胞(PBMC)共同孵育,ELISA检测上清IFN-a的表达,本发明人最终筛选到两条具有较高活性诱导IFN-a的HBV-CpG(即,下表I中的Al和B3):HBV-CpG(Al)序列为:5,-GGgacgtcctttgtttacgGGG-3’ (SEQ ID NO:1)HBV-CpG(B3)序列为:5,-GGgagtctagactcgGGGGG-3’ (SEQ ID NO:2)(其中,核苷酸大写表示硫代磷酸化修饰)。本发明的第二个方面涉及由纳米材料PEG-PLA包被HBV-CpG制得的纳米颗粒。其中所用的纳米材料PEG-PLA表示聚乙二醇(PEG)与聚乳酸(PLA)形成的嵌段共聚物,其通式为PEGm-PLAn,其中m表示PEG链段的数均分子量,m可以为2000,5000或10000 ;n表示PLA链段的数均分子量,η可以为5000或10000。优选地,m为5000,并且η为10000,即,用纳米材料PEG5_-PLA1Q_包被本发明第一方面的HBV-CpG。所述纳米材料与第一方面的HBV-CpG的质量比例在50: 3-50: I范围内,优选为 50: I。所述纳米材料与第一方面的HBV-CpG包被后得到的纳米颗粒NP (HBV-CpG)的粒度在50 200纳米效果较佳。在一个优选的实施方案中,采用PEG5cicic1-PLAiwcici为主要原纳米材料,辅以阳离子脂质(lmg BHEM-Chol)混合后包被本发明第一方面的HBV-CpG,在探头式超声波破碎仪中超声乳化(超声的条件:输出功率80瓦,采用超声10秒暂停2秒的频率超声2分钟),有机溶剂(氯仿)挥发后收集样品,制备得到的纳米颗粒中包含本发明筛选的HBV-CpG(纳米材料PEG圆-PLA1q_与HBV-CpG的质量比例范围是50: 3-50: 1,优选50: I)。本领域技术人员应该理解,纳米材料PEG-PLA包被本发明的寡核苷酸序列HBV-CpG可以按照常规方法进行。 将纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG命名为NP (HBV-CpG),纳米材料PEG-PLA空载体以NPs命名。本发明的第三个方面涉及纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG协同增强乙肝疫苗抗体应答的应用。将目前所用的乙肝疫苗HBsAg单独使用或分别联合NP(HBV-CpG)或NPs免疫BALB/C小鼠,皮下免疫途径,每周一次,连续免疫三次,免疫后第二和第四周分别尾静脉采血,放免法(RIA)检测血清中抗-HBs IgG的表达水平,间接ELISA法检测血清中抗-HBsIgGl和抗-HBs IgG2a的表达水平。NP(HBV-CpG)在BALB/C小鼠体内具有增强抗-HBs IgG应答的能力,更为重要的是,NP(HBV-CpG)具有更强的诱导Thl依赖的抗体亚型IgG2a的能力。由此可见,NP(HBV-CpG)协同增强乙肝疫苗抗体应答,特别是Thl型抗体
免疫应答。本发明的第四个方面涉及NP (HBV-CpG)联合HBsAg能够治疗HBV的应用。治疗方案如下:HBV携带小鼠连续治疗三周,每周NP(HBV-CpG)连续三天尾静脉给药,第四天NP(HBV-CpG) (lmg NPs:20u g HBV-CpG)联合 2yg HBsAg 皮下给药。治疗第二周开始,NP (HBV-CpG)联合HBsAg治疗组血清中HBsAg开始下调,治疗三周后,联合治疗组约90%HBV携带小鼠HBsAg转阴,血清HBV DNA基本降到阈值以下,组织化学检测显示肝脏中HBcAg表达基本不可见。而HBsAg联合NPs组与不治疗组相比,HBsAg, HBcAg及HBV DNA表达没有明显变化。有此可见NP (HBV-CpG)联合HBsAg治疗组在HBV携带小鼠模型中具有显著的清除HBV的能力。
这些结果表明本发明筛选得到的HBV-CpG首先可以强烈诱导IFN- a的表达,当以PEG-PLA纳米材料作为给药载体系统,应用于HBsAg疫苗佐剂时显著提高了抗体应答水平,包括Thl型抗体亚型IgG2a水平;当应用于乙肝治疗时,HBV携带鼠HBsAg、HBcAg以及HBVDNA均明显下降。因此以PEG-PLA纳米材料包被的HBV-CpG作为乙肝的预防和治疗性新型药物具有潜在的巨大应用前景。本发明的第五个方面涉及本发明第二个方面所述的纳米颗粒(即,纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG)在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒中的应用。本发明的第六个方面涉及一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒,所述试剂盒包含乙型肝炎疫苗和本发明第二个方面所述的纳米颗粒(即,纳米材料PEG-PLA包被的HBV-CpG)。其中所述乙型肝炎疫苗为目前所用的乙肝疫苗(HBsAg)。其中所述乙肝疫苗和所述纳米颗粒混合后通过注射途径(例如,皮下注射)施用给受试者。因此,本发明提供下列各项:1.能够诱导a干扰素表达的HBV-CpG寡核苷酸序列,所述寡核苷酸序列如SEQ IDNO:1或2所示。2.一种纳米颗粒,所述纳米颗粒通过用纳米材料PEG-PLA包被第I项所述的HBV-CpG寡核苷酸序列制得。3.根据第2项所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料PEG-PLA是由聚乙二醇与聚乳酸形成的嵌段共聚物,其通式为PEGm-PLAn,其中m表示PEG链段的数均分子量,并且选自2000,5000或10000 ;n表示PLA链段的数均分子量,并且选自5000或10000。4.根据第3项所述的纳米颗粒,其中m为5000,并且n为10000,即,所述纳米材料PEG-PLA 是 PEG5000-PLA10000O5.根据第2项所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料与所述寡核苷酸的质量比例在50: 3-50: I 范围内。6.根据第5项所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料与所述寡核苷酸的质量比例为50:1。7.根据第2项所述的纳米颗粒,其中纳米颗粒的粒度在50_200nm范围内。
8.第2-7项任一项中所述的纳米颗粒在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒中的应用。9.一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒,所述试剂盒包含乙型肝炎疫苗和第2-7项任一项中所述的纳米颗粒,其中所述乙型肝炎疫苗为目前所用的乙肝疫苗(HBsAg)。10.根据第9项所述的试剂盒,其中所述乙肝疫苗(HBsAg)和所述纳米颗粒混合后通过注射途径施用给受试者。术语的定义:本发明中,术语“CpG”C代表胞嘧啶,G代表鸟嘌呤,P代表磷酸二脂键。CpG是由
磷酸二酯键连接成的非甲基化的二核苷酸。术语“HBsAg疫苗”指目前使用的乙肝疫苗,是基因工程疫苗重组酵母乙肝疫苗和重组CHO乙肝疫苗,其主要成分是乙肝病毒的表面抗原,即一种乙肝病毒外衣壳蛋白,不具备感染性和致病性,但保留了免疫原性,即刺激机体产生保护性抗体的能力。术语“HBV携带小鼠”是将含HBV全基因的质粒pAAV/HBVl.2 (L1-Rung Huang,Hu1-Lin Wu, Pe1-Jer Chen,and Ding-Shinn Chen.An immunocompetent mouse modelfor the tolerance of human chronic hepatitis B virus infection.PNAS 2006 ; 103:17862-17867)高压注射到C57BL/6小鼠尾静脉,该HBV携带小鼠模型可以稳定表达HBsAg、HBeAg和HBcAg,且HBV DNA具有较高拷贝数达半年以上。该模型来自台湾大学医学院Ding-Shinn Chen 实验室。本发明的有益效果:本发明提供了来源于HBV基因组的CpG寡核苷酸序列,即SEQ ID NO:1和2所示的HBV-CpG,当HBV-CpG被纳米材料(PEG-PLA)包被后形成(NP(HBV-CpG))。NP(HBV-CpG)联合乙肝疫苗使用时不仅极大提高了疫苗的免疫效果,而且可以有效地清除乙肝病毒。因此,此发明对乙肝的预防及治疗具有重大的临床意义。


从下面结合附图的详细描述中,本发明的上述特征和优点将更明显,其中:图1,HBV-CpG诱导人外周血单核细胞(PBMC)表达IFN- α。图2,NP (HBV-CpG)协同增强HBsAg疫苗抗体应答。Α,抗-HBs IgG表达;Β,抗-HBsIgGl 表达;C,抗-HBs IgG2a 表达。图3,NP (HBV-CpG)联合HBsAg疫苗清除HBV。A,血清HBsAg表达;B,组化鉴定肝组织HBcAg表达;C,血清HBV DNA表达。
具体实施例方式下面参照具体的实施例进一步描述本发明,但是本领域技术人员应该理解,本发明并不限于这些具体的实施例。以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明,但不以任何形式限制本发明。实施例中的实验方法,如无特别说明,均采用本领域常规技术,实验试剂均为市售产品。
实施例1:HBV-CpG的设计与筛选1、HBV-CpG的设计:根据GenBank HBV基因序列特征,设计合成了一系列来源于HBV基因的含CpG的寡核苷酸序列:A1,A2,A3,A5,A6,A7,A8,B1,B2,B3,如表I所示,其中核苷酸大写均为硫代磷酸键修饰。上述序列均由上海生工生物合成公司合成。表1.HBV-CpG 的设计
权利要求
1.能够诱导α干扰素表达的HBV-CpG寡核苷酸序列,所述寡核苷酸序列如SEQID NO:I或2所示。
2.一种纳米颗粒,所述纳米颗粒通过用纳米材料PEG-PLA包被权利要求1所述的HBV-CpG寡核苷酸序列制得。
3.根据权利要求2所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料PEG-PLA是由聚乙二醇与聚乳酸形成的嵌段共聚物,其通式为PEGm-PLAn,其中m表示PEG链段的数均分子量,并且选自2000,5000或10000 ;n表示PLA链段的数均分子量,并且选自5000或10000。
4.根据权利要求3所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料PEG-PLA是PEG.-PLA.。。。
5.根据权利要求2所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料与所述寡核苷酸的质量比例在50: 3-50: I 范围内。
6.根据权利要求5所述的纳米颗粒,其中所述纳米材料与所述寡核苷酸的质量比例为50:1。
7.根据权利要求2所述的纳米颗粒,其中纳米颗粒的粒度在50-200nm范围内。
8.权利要求2-7任一项中所述的纳米颗粒在制备用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒中的应用。
9.一种用于预防和/或治疗乙型肝炎的试剂盒,所述试剂盒包含乙型肝炎疫苗和权利要求2-7任一项中所述的纳米颗粒。
10.根据权利要求9所述的试剂盒,其中所述乙肝疫苗和所述纳米颗粒混合后通过注射途径施用给受试者。
全文摘要
本发明涉及能够诱导α干扰素表达的HBV-CpG寡核苷酸序列,所述寡核苷酸序列如SEQ ID NO1或2所示,还涉及用纳米材料PEG-PLA包被所述的HBV-CpG寡核苷酸序列制得的纳米颗粒,以及所述纳米颗粒在乙型肝炎预防和治疗中的应用,其中纳米材料PEG-PLA是由聚乙二醇与聚乳酸形成的嵌段共聚物,其通式为PEGm-PLAn,其中m表示PEG链段的数均分子量,m可以为2000,5000或10000;n表示PLA链段的数均分子量,n可以为5000或10000。本发明涉及HBV基因来源的CpG(HBV-CpG)在纳米材料PEG-PLA的包被下既可以用于制备乙肝预防性疫苗,也可用于制备乙肝治疗性疫苗。
文档编号A61P1/16GK103233011SQ20131013893
公开日2013年8月7日 申请日期2013年4月22日 优先权日2013年4月22日
发明者魏海明, 吕树娟, 田志刚, 王均, 孙汭 申请人:中国科学技术大学
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