专利名称：双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
:本发明属于生物医药领域，具体涉及一种使用双启动子同时表达两种shRNA的重组慢病毒载体和穿梭质粒。本发明还涉及所述载体和穿梭质粒在制备防治HIV感染药物中的应用。
背景技术：
:RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。RNA干扰可以通用用化学合成的成熟的小的干扰RNA (small interfering RNAs,siRNA)去瞬时转染细胞，或者是通过将能够表达短发卡RNA (shRNA)的载体整合进入细胞，进行稳定表达。表达出来的shRNA包含两个短的反向重复序列(其中一个与目的基因互补)，中间由一个loop序列分割,组成发夹结构,在体内shRNA可以在Dicer酶的作用下加工成为成熟siRNA，其干扰效果等同于siRNA。体外合成和质粒介导的RNA干扰持续时间较短，不适用于长期抑制基因表达。使用病毒载体来介导shRNA的表达可以达到长期稳定地抑制基因的表达。慢病毒载体是一种新型基因转移载体，具有独特的特点，可高效地感染非分裂期的细胞，特别是造血系统来源细胞，具有稳定整合染色体并能够长期稳定表达、细胞毒性低、免疫反应小等特点，在基因治疗研究中展现出良好的应用的前景。现如今，常规商品化的病毒载体只能单独表达出一种shRNA。单独的shRNA不足以完全干扰目的基因的表达。 如果靶向的基因是RNA病毒基因，由于病毒基因容易发生变异，RNA干扰是序列高度特异性的，即使靶向基因中有一个碱基发生突变，就会严重影响siRNA的干扰效果。譬如，在RNA干扰技术应用于HIV的基因治疗中，由于HIV基因组具有很高的突变率，突变产生的病毒逃逸就成为siRNA治疗的一个潜在问题。因此,如果能够同时表达出两个或者多个siRNA,针对于病毒基因的同一个基因或者不同的基因，将两个siRNA的干扰效果联合作用，不仅可以更加高效的干扰病毒基因和肿瘤癌基因的表达水平，而且可以降低病毒产生病毒逃逸株的出现，就可以解决上述问题
发明内容
:本发明的目的是构建一种慢病毒载体，达到在同一载体中用两种启动子，可同时表达出两种shRNA，更加高效抑制靶向基因的表达，且能够同时靶向于两个不同的基因。本发明选择的两种启动子是U6和Hl启动子，它们都是RNA聚合酶III依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达大小约21ntRNA和50ntRNA茎环结构(stem loop)，且没有物种特异性，在所有的哺乳细胞中都能够启动高效表达。采用两种不同的启动子不仅可以同时高效地表达出两种shRNA，还可以有效地避免在载体整合进入到细胞过程中相同的启动子因为同源匹配引起的丢失交换等，更加稳定和安全。本发明以plvx-shRNA2为骨架构建出同时表达出两种shRNA的慢病毒载体。在构建shRNA双表达系统时，在多克隆位点引入含有BamH1、EcoR1、Xba1、XhoI四个限制性酶切位点的linker序列(
图1)，在限制性酶切位点EcoRI和XbaI之间插入Hl启动子，形成 PU6-BamH1-EcoR1-PHl-Xba1-XhoI (SEQ NO:3)。 在BamHI和EcoRI酶切位点可以插入一种表达shRNA的双链DNA寡核苷酸，(设计要求如oligol,经过退火后可以形成两端带有BamHI和EcoRI粘性末端的双链寡核苷酸)，通过U6启动子进行启动。在XbaI和XhoI酶切位点可以引入表达另外一种shRNA的双链寡核苷酸(设计要求见oligo2，经过退火后可以形成两端带有XbaI和XhoI粘性末端的双链寡核苷酸)，由Hl启动子进行启动。Oligol (+):5’ -gatcccc (siRNA 序列)ttcaagaga (siRNA 序列的反向互补序列)Oligol (-):5’ -aattcaaaaa (siRNA 序列)tctcttgaa (siRNA 序列的反向互补序列)ggg-3’01igos2 (+):5’ -ctagacc (siRNA 序列)ttcaagaga (siRNA 序列的反向互补序列)01igos2 (-):5' -tcgagaaaaa (siRNA 序列)tctcttgaa (siRNA 序列的反向互补序列)ggt-3’其中下划线_部分为限制性酶切位点，可以形成粘性末端，+链中ttcaagaga
和-链tctcttgaa为loop序列。表I
权利要求
1.一种能够同时表达出两种ShRNA的慢病毒载体，其特征为包含核苷酸序列为SEQ IDNO: I的U6启动子和核苷酸序列为SEQ ID NO: 2的Hl启动子。
2.权利要求I所述的慢病毒载体，其特征为包含SEQID NO:3所示核苷酸序列的双启动子区。
3.权利要求I或2所述的慢病毒载体，其特征为 1)U6启动子启动的shRNA引入酶切位点为BamHI和EcoRI，分别位于SEQ ID NO:3中253-258 位和 262-267 位； 2)Hl启动子启动的shRNA引入酶切位点为XbaI和Xhol，分别位于SEQ ID N0:3中483-488 位和 SEQ ID NO:3 中 492-497 位。
4.权利要求3所述的慢病毒载体，其特征为 1)在BamHI和EcoRI酶切位点插入了表达shRNA的双链DNA寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligol (+)和oligol(-)所示,退火后两段形成BamHI和EcoRI酶切粘性末端，通过U6启动子进行启动； 2)在XbaI和XhoI酶切位点插入了表达另外一种shRNA的双链寡核苷酸，其正向序列和反向序列如oligo2(+)和oligo2(_)所示,退火后两段形成XbaI和XhoI酶切粘性末端，由Hl启动子进行启动； 所述 Oligol (+)序列是 5’ -gatcccc一N1一ttcaagaga一M1一tttttg-3’，其中 N1 是长度为19 22bp的siRNA序列，M1是N1的反向互补序列； 所述 Oligol (-) 5’ -aattcaaaaa—N2—tctcttgaa—M2—ggg_3’，其中 N2 是长度为 19 22bp的siRNA序列，M2是N2的反向互补序列； 所述 01igo2 (+) 5’_ctagacc—N3—ttcaagaga—M3—tttttc-3’，其中 N3 是长度为 19 22bp的siRNA序列，M3是N3的反向互补序列； 所述 01igo2 (_) 5’ -tcgagaaaaa—N4—tctcttgaa—M4—ggt_3’，其中 N4 是长度为 19 22bp的siRNA序列，M4是N4的反向互补序列。
5.一种同时表达靶向HIV病毒中vpr基因和tat基因的慢病毒载体，其特征是包含SEQID NO:4 SEQ ID NO:7 所示的 shRNA。
6.权利要求I或5所述慢病毒载体在研制防治HIV感染药物中的应用。
7.权利要求6所述的应用，所述防治HIV感染药物是抑制vpr基因表达和/或下调tat基因的表达水平的药物。
8.—种构建shRNA双表达慢病毒表达质粒的方法，在多克隆位点引入含有BamHl-EcoRI-XbaI-XhoI的寡核苷酸序列；且在限制性酶切位点EcoRI和XbaI之间插入SEQ ID N0:2所示序列的Hl启动子,形成SEQ ID NO :3所示序列的双启动子区； 所述BamHI、EcoRI、XbaI和XhoI如权利要求3所示； 所述 BamHl-EcoRI-XbaI-XhoI 的序列为 5’ -GGATTC GAATTC TCTAGA CTCGAG-3’。
全文摘要
一种双启动子双表达特异性shRNA慢病毒载体，包含核苷酸序列为SEQ ID NO:1的U6启动子和核苷酸序列为SEQ ID NO:2的H1启动子。经实验证实，该慢病毒载体能够同时表达出两种shRNA，可抑制vpr基因表达和/或下调tat基因的表达水平，可用于研制防治HIV感染药物。
文档编号A61K48/00GK103255173SQ201310157030
公开日2013年8月21日 申请日期2013年4月28日 优先权日2013年4月28日
发明者曾毅, 滕智平, 郝彦哲, 杨怡姝 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所, 北京工业大学, 曾毅, 滕智平, 郝彦哲