Chip蛋白在胰腺癌治疗中的用途

Chip蛋白在胰腺癌治疗中的用途
【专利摘要】本发明涉及CHIP蛋白在胰腺癌治疗中的用途。特别地，本发明涉及CHIP蛋白以及编码其的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。更特别地，本发明涉及一种CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途，以及一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。
【专利说明】CHIP蛋白在胰腺癌治疗中的用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。更特别地，本 发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。

【背景技术】
[0002] 胰腺癌是最难早期发现、恶性程度最高和预后最差的肿瘤之一。美国癌症协会对 美国肿瘤发病率及死亡率的统计结果表明，胰腺癌占全部肿瘤死亡原因的第四位，5年生存 率在5%以下。其死亡的主要原因是超过50%患者在发现时已处于晚期，肿瘤已包绕血管或 发生远处转移，且对传统的放化疗或靶向治疗具有一定耐受性。因此，提高胰腺癌的早期诊 断率，抑制肿瘤的生长和远处转移，提高药物的治疗效果，成为改善胰腺癌患者预后的关键 因素。
[0003] 化疗是目前胰腺癌的主要辅助治疗手段，吉西他滨是治疗局部进展期及转移性胰 腺癌的一线药物。但是吉西他滨存在临床应答率低、固有或获得性耐药等问题，导致吉西他 滨单药化疗疗效并不理想。随着对胰腺癌细胞生物学行为的加深理解及其细胞分子学机制 的掌握，应用分子靶向药物治疗胰腺癌目前已逐渐成为晚期胰腺癌治疗的研究重点。胰腺 癌细胞常伴表皮生长因子受体（EGFR，Herl)及其内源配体的高表达，在胰腺癌的形成、进 展及转移中具有重要作用。因此，目前针对EGFR的靶向治疗在晚期胰腺癌的治疗中得以重 视。
[0004] EGFR为I型受体酪氨酸激酶ErbB家族成员之一，其配体包括EGF、TGF-a等。EGFR 与配体结合后，激活受体中的酪氨酸激酶（TK)活性，导致其酪氨酸激酶残基发生磷酸化，暴 露酪氨酸激酶作用靶蛋白的结合位点，进而激活下游的多条信号通路，最终影响细胞的增 殖和分化。研究表明，EGFR在胰腺癌中高表达，与基因拷贝数的增加及其配体的高表达相 关。同时EGFR在胰腺癌中也高度保守，其酪氨酸激酶区域不易发生突变，这些结果为靶向 治疗的可行性提供了研究基础。目前用于胰腺癌的靶向药物包括单克隆抗体西妥昔单抗， 小分子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI)厄洛替尼、吉非替尼、拉帕替尼等。2007年5月NCIC 研究报告第一次证实厄洛替尼对晚期胰腺癌有确切疗效，研究发现厄洛替尼联合吉西他滨 较吉西他滨单药化疗使病人的死亡风险下降了 18%，中位生存期从5. 91个月延长到6. 37个 月，1年存活率从17%上升到23%。该项研究证实了厄洛替尼联合吉西他滨作为一线药物对 晚期胰腺癌的疗效。但是，与其他肿瘤一样，针对EGFR的多种靶向药物在胰腺癌患者中的 总体应答率仍不高，其机制仍不清楚。如何加强针对EGFR的靶向药物的疗效，成为值得深 入研究的问题。
[0005] 研究发现，在不同的恶性肿瘤中EGFR的表达量并不相同。在乳腺癌、宫颈癌和胰 腺癌中，EGFR通常是高表达的，但在非小细胞肺癌中EGFR表达量却较低甚至不表达。因 此，针对EGFR的调控机制的探索是目前研究的重点之一。EGFR基因CpG岛甲基化的改变， microRNA对EGFR转录水平的调控，以及转录后修饰对EGFR蛋白活性的影响成为EGFR发 挥其稳定性的主要原因。转录后修饰主要包括蛋白的磷酸化、乙酰化、SUM0和泛素化等，其 中泛素-蛋白酶体系统（UPS)是蛋白活性和结构修饰及异常蛋白清除的主要途径。研究表 明，泛素E3连接酶Cbl蛋白是EGFR蛋白发生降解的主要限速酶，当EGFR羧基末端酪氨酸 残基（Tyr) 1045位点磷酸化激活后即与Cbl蛋白结合，后者通过募集泛素激活酶（E1)和泛 素结合酶（E2)进而将泛素小分子传递到EGFR蛋白表面并与之结合，再通过蛋白酶体系统 使得EGFR发生降解。当EGFR的Tyrl045位点发生突变的时候，EGFR即无法与Cbl蛋白结 合导致受体无法正常的泛素化，从而继续接受其配体的刺激而促进下游肿瘤相关信号通路 的持续激活。值得注意的是，Cbl蛋白介导的受体泛素化在EGFR内化过程中并不起主要作 用，Cbl蛋白突变能够阻止EGFR的下调，但并不影响EGF-EGFR复合物的内化。这一结果支 持Cbl介导的泛素化在内化的初始阶段并不起重要作用，而是作用于比较晚的阶段，因此， EGFR泛素化的调控仍需要进一步的研究。
[0006] C末端Hsc70反应蛋白（命名为CHIP)是一个种属间高度保守的胞浆蛋白，在平滑 肌细胞、心肌细胞、骨骼肌和大脑中高度表达。它含有三个功能区，N末端的TPR功能区、 C-末端的U-盒子功能区和中间的正负电荷富集区。CHIP作为一个陪伴蛋白（chaperone) 即可通过TPR基序（motif)与热休克蛋白Hsp70和Hsp90相互作用，辅助新生蛋白折叠，形 成具有正常结构和功能的蛋白，抑制变性蛋白的聚集；又可通过U-盒子功能区作为E3连 接酶，促进蛋白底物的泛素化降解。目前已经发现CHIP在多种肿瘤中发挥重要的作用。可 与CHIP结合并发生降解的蛋白包括突变的p53,雌激素受体，erbB2, SMAD3, HIF-1，SRC-3， NF-κ B，c-Myc，以及磷酸化的AKT等，这些底物都与肿瘤的增殖、侵袭或转移均密切相关。 另一方面，CHIP在乳腺癌、胃癌及脑神经胶质瘤中的表达水平要明显低于癌旁的正常组织， 这些结果均提示CHIP在多种肿瘤中发挥抑癌的作用，但是目前关于CHIP蛋白与胰腺癌的 关系国内外均没有报道。
[0007] 本发明来源于一个惊人的方法，S卩，本发明人发现CHIP蛋白的过度表达可以抑制 胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，而沉默CHIP蛋白胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能 力明显增强。


【发明内容】

[0008] 通过慢病毒载体将CHIP的microRNA (作为RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌细胞株 Panc-l、BxpC-3、SW1990中，建立稳定沉默或稳定过表达CHIP的胰腺癌细胞株，本发明人证 实CHIP蛋白的过度表达可以抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力，而沉默CHIP蛋白胰 腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力明显增强。进一步地，本发明人证实了 CHIP蛋白可以增 强抗肿瘤剂厄洛替尼诱导的细胞凋亡，沉默CHIP蛋白后厄洛替尼诱导细胞凋亡能力明显 减弱。
[0009] 因而，在第一方面，本发明提供了一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中 的用途。
[0010] 进一步地，本发明涉及所述CHIP蛋白在制备用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵袭和 转移药物中的用途。
[0011] 在另一方面，本发明涉及CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中 的用途。
[0012] 进一步地，本发明涉及CHIP蛋白在制备增强厄洛替尼诱导的癌细胞凋亡中的用 途。
[0013] 在另一方面，本发明提供了一种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌 的药物中的用途。进一步地，所述编码CHIP蛋白的DNA序列如SEQ ID N0 :11所示。
[0014] 进一步地，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于抑制胰腺癌细胞的增 殖、侵袭和转移药物中的用途。
[0015] 在另一方面，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强抗肿瘤药物诱导的 癌细胞凋亡中的用途。
[0016] 进一步地，本发明涉及编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强厄洛替尼诱导的癌细 胞凋亡中的用途。

【专利附图】

【附图说明】
[0017] 图1显示为pcDNA6. 2载体的结构。
[0018] 图2显示为pcDNA3. 1 ( + )载体结构。
[0019] 图3显示为pLenti6. 2质粒结构。
[0020] 图4分别显不为pReceiver-MOl质粒结构（图4A)和pReceiver-MOll质粒结构（图 4B)。
[0021] 图5显示了九株胰腺癌细胞CHIP表达水平的差异。
[0022] 图6显示了 mRNA水平和蛋白水平检测Bxpc-3细胞转染后CHIP的沉默情况。上 图为RT-PCR检测CHIP mRNA表达水平。其中1，2,3,4分别代表四个不同的干扰序列，下图 为Western blot法检测CHIP蛋白表达水平，其中2-1，2-2代表第二个干扰序列第一次和 第二次转染细胞对CHIP表达的影响。
[0023] 图7显示了 mRNA水平和蛋白水平检测Bxpc-3细胞转染后CHIP的过表达情况。 CHIP°E代表CHIP过表达组。
[0024] 图8显示了三株细胞稳定沉默或过表达CHIP蛋白。miR代表采用第二个干扰序列 包装的病毒在六孔板中的2个孔中进行感染细胞后获得的两个稳定沉默细胞株。CHIP° eR 表过表达CHIP蛋白，后同。
[0025] 图9显示了 Bxpc-3细胞下调CHIP表达后其他蛋白表达情况。
[0026] 图10显示了沉默CHIP蛋白表达前后胰腺癌细胞株增殖情况。miRl，miR2分别代 表沉默CHIP蛋白的细胞亚克隆，对照代表沉默组的对照，以下同。
[0027] 图11显示了过表达CHIP蛋白前后胰腺癌细胞株增殖情况。CHIP°E代表过表达 CHIP蛋白的细胞组，对照代表过表达组的对照，以下同。
[0028] 图12显示了沉默CHIP蛋白表达前后胰腺癌细胞株处于S期细胞比率。*代表 ρ〈0· 05, ** 代表 ρ〈0· 01，以下同。
[0029] 图13显示了过表达CHIP蛋白前后胰腺癌细胞株处于S期细胞比率。
[0030] 图14显示了厄洛替尼诱导不同细胞的抑制率。
[0031] 图15显示了 CHIP蛋白沉默前后对厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响。
[0032] 图16显示了过表达CHIP蛋白前后对厄洛替尼诱导细胞凋亡的影响。
[0033] 图17显示了 CHIP蛋白沉默前后对厄洛替尼诱导细胞产生活性半胱天冬酶3/7的 影响。
[0034] 图18显示了 CHIP蛋白过表达前后对厄洛替尼诱导细胞产生活性半胱天冬酶3/7 的影响。
[0035] 图19显示了 CHIP沉默前后对胰腺癌细胞侵袭和转移的影响。
[0036] 图20显示了 CHIP过表达前后对胰腺癌细胞侵袭和转移的影响。
[0037] 图21显示了三株胰腺癌细胞沉默或过表达CHIP后EGFR的改变。miRl和miR2分 别代表采用CHIP的microRNA序列沉默CHIP，CHIP° E代表过表达CHIP。
[0038] 图22显示了过表达或沉默CHIP后p-EGFR的表达水平改变。
[0039] 图23显示了稳定沉默CHIP蛋白对三株胰腺癌细胞PI3K/AKT/mT0R通路的影响。 P-AKT代表磷酸化AKT蛋白，t-AKT代表总的AKT蛋白，后同。
[0040] 图24显示了稳定沉默CHIP蛋白对三株胰腺癌细胞Src/FAK通路的影响。
[0041] 图25显示了稳定沉默CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤体积及重量检测（**代表 ρ〈0· 01)。
[0042] 图26显示了稳定过表达CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤体积及重量检测（**代 表 ρ〈0· 01)。
[0043] 图27显示了厄洛替尼干预稳定沉默CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤的体积及重 量检测（*代表P〈〇. 05)。
[0044] 图28显示了厄洛替尼干预稳定过表达CHIP及对照细胞小鼠皮下移植瘤的体积及 重量检测0*代表ρ〈〇· 01)。
[0045] 图29显示了沉默CHIP组及其对照的免疫组化研究和Ki67表达水平（X 400, *代 表 ρ〈0· 05)。
[0046] 图30显示了过表达CHIP组及其对照的免疫组化研究和Ki67表达水平（X 400, * 代表 ρ〈〇· 05)。
[0047] 图31显示了同一组织切片不同蛋白的表达差异检测（Χ400)。
[0048] 图32显示了厄洛替尼诱导稳定沉默CHIP组和对照组切断的半胱天冬酶-3表达 水平检测（X 400)。
[0049] 图33显示了厄洛替尼诱导稳定过表达CHIP组和对照组切断的半胱天冬酶-3表 达检测（X 400)。
[0050] 图34显示了脾脏注射稳定CHIP沉默和对照组细胞后肝转移情况。
[0051] 图35显示了脾脏注射稳定CHIP过表达和对照组细胞后肝转移情况。

【具体实施方式】
[0052] 本发明首先通过构建和CHIP及EGFR相关质粒进行胰腺癌细胞株的转染，观察 CHIP表达水平与胰腺癌细胞株的增殖、侵袭、转移的相关性研究，了解CHIP水平的改变是 否影响胰腺癌细胞的生物学行为；其次观察胰腺癌细胞株中CHIP与其靶蛋白EGFR的相关 性，了解其磷酸化位点与CHIP的相互作用，并观察CHIP对肿瘤相关信号通路激活的影响； 通过小鼠移植瘤模型进一步观察小鼠体内肿瘤的生长和转移情况，并观察CHIP是否对靶 向药物诱导的组织或细胞凋亡的促进作用；最后通过收集组织和血标本和病例资料，观察 CHIP在肿瘤组织和血中的表达水平，观察其对患者预后的影响，为寻找新的早期诊断和治 疗靶点，改善胰腺癌治疗效果提供一个新的思路。
[0053] 本发明通过慢病毒载体将CHIP的microRNA (作为RNAi)或CHIP基因插入胰腺癌 细胞株Panc-l、BxpC-3、SW1990中，建立稳定沉默或稳定过表达CHIP的胰腺癌细胞株。
[0054] 本发明通过CCK-8法观察CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞增殖水平的影响。
[0055] 本发明通过流式细胞术检测CHIP沉默或过表达对靶向药物厄洛替尼诱导细胞凋 亡的影响；通过Transwell小室检测CHIP沉默或过表达对肿瘤细胞侵袭和迁移的影响。
[0056] 本发明通过免疫共沉淀技术寻找CHIP的靶蛋白，通过时间依赖梯度观察CHIP对 革巴蛋白表达水平的影响；通过蛋白电泳和Western blot检测CHIP蛋白对肿瘤相关信号通 路中关键蛋白表达水平的影响。
[0057] 本发明通过建立小鼠皮下移植瘤模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对小鼠成瘤的 影响，观察CHIP蛋白沉默或过表达对厄洛替尼诱导肿瘤组织凋亡的影响；通过胰腺癌细胞 脾脏注射肝转移模型观察CHIP蛋白沉默或过表达对肿瘤细胞转移能力的影响；通过免疫 组化观察肿瘤组织中CHIP蛋白和靶蛋白表达水平的差异。
[0058] 本发明通过免疫组化研究明确CHIP蛋白在胰腺癌患者组织中的表达水平及其对 患者预后的影响，通过ELISA法检测人CHIP蛋白在肿瘤患者血清中的表达水平，评估其作 为鉴别诊断及判断预后的价值。
[0059] 本发明中术语的"细胞凋亡"是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有 序的死亡。它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用。细胞凋亡首先出现的是细 胞体积缩小、连接消失，然后是细胞质密度增加，通透性改变，核质浓缩，核膜核仁破碎，DNA 降解成为约180bp-200bp片段；胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氨酸外翻到膜表面，胞 膜结构仍然完整，最终可将凋亡细胞遗骸分割包裹为多个凋亡小体。Annexin V作为一种磷 脂结合蛋白，可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。由于本实 验所采用的胰腺癌细胞在转染质粒或病毒以后均表达绿色荧光蛋白，因此常用的FITC染 料作为荧光探针可和绿色荧光蛋白互相产生干扰；因此本实验改用PE的Annexin V作为荧 光探针，可以有效避开绿色荧光波长从而检测到早期凋亡事件。7-AAD是一种核酸染料，在 合适的膜通透性情况下，7-AAD可以与细胞核的核酸结合，在合适波长激发光的激发下可发 出明亮的红色荧光，7-AAD可与Annexin V-PE联合使用。
[0060] 本文中的半胱天冬酶是一组天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶，它们在凋亡中发挥 重要作用。一般来说，哺乳动物的半胱天冬酶可根据功能分为三类类：细胞因子激活（包 括半胱天冬酶sl、4、5、13)，凋亡起始（包括半胱天冬酶s2、8、9、10)和凋亡执行（包括半 胱天冬酶s3、6、7)。其中半胱天冬酶-3/7的被剪切形成激活体则代表凋亡已经不可逆转。 本实验采用的半胱天冬酶-3/7凋亡检测方法是一种均质发光检测方法，半胱天冬酶-3/7 在细胞凋亡过程中如果被激活形成剪切体后，即可剪切试剂盒中的底物Z-DEVD-氨基萤光 素，该底物本身并不发光，但是如果被剪切后释放出氨基萤光素，即可产生由重组萤光素酶 生成的辉光型发光信号（Luminescence)。该信号可以被辉光接收仪器检测到，其发光强度 与存在的半胱天冬酶-3/7活性成正比，通过检测辉光强度即可判断半胱天冬酶-3/7激活 成分的含量。
[0061] 本发明中涉及的细胞侵袭和转移检测是应用Transwell小室，其是一种可放置在 孔板中的小室，其小室底部底为聚碳酸酯膜，进行侵袭转移实验的膜为含8um小孔的膜，小 室内称上室，培养皿内称下室，通常下室内放入含趋化因子或高浓度营养成分的培养基，而 将细胞接种在上室内。由于聚碳酸酯膜具有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室 内的细胞，肿瘤细胞会向营养成分高的下室移动。对于肿瘤侵袭实验需要预先在小室内膜 铺上一层基质胶以模仿细胞外基质，肿瘤细胞需要把基质消化后才可以从低营养培养基跑 到高营养培养基中，最后通过检测小室膜的外侧面细胞数量即可明确细胞的侵袭和转移能 力。
[0062] 文中的BCA(Bicinchoninic acid)法是近来广为应用的蛋白定量方法。其原理是 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cul+。BCA与Cul+结合形成稳定的紫 蓝色复合物，在562nM处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 BCA蛋白测定方法灵敏度高，操作简单，试剂及其形成的颜色复合物稳定性俱佳，而且不易 受去垢剂的影响。
[0063] 本发明涉及的SDS-PAGE (十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用 的分离蛋白质的电泳技术。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结 构，蛋白质同SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结 合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子 团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合 是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度仅取决于分子大小，因此可 以根据蛋白分子量大小将不同的蛋白拉出不同的梯度进而检测。
[0064] Western blot即蛋白质印迹。被检测物是蛋白质，"探针"是抗体，"显色"用标记 的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如PVDF薄膜)上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与辣根过氧化物酶或同位素标 记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达 的蛋白成分。发光值得高低反映蛋白浓度的高低水平。
[0065] 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，Co-IP)是利用抗原和抗体的特异性结合 以及细菌的Protein A或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。 其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入结合于Agarose珠 上的Protein A或G,抗体的Fc片段即和protein A/G上，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目 的蛋白，就可以形成这样一种复合物："目的蛋白一兴趣蛋白一抗兴趣蛋白抗体一Protein A或G"，经变性聚丙烯凝胶电泳，复合物又被分开。然后经Western blot检测目的蛋白。这 种方法得到的目的蛋白是在细胞内与兴趣蛋白天然结合的，符合体内实际情况，得到的结 果可信度高。应该注意的是，细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋 白质一蛋白质相互作用，一般多采用非离子变性剂（NP40或Triton X-100)，同时应提高相 应的盐浓度以去除较多的非特异杂带。
[0066] 荧光免疫是根据抗原抗体反应，先将已知抗体标记荧光素制成荧光标记物，再用 这种荧光抗体作为分子探针检测细胞或组织内的相应抗原。在细胞或组织中形成抗原抗体 复合物上含有突光素，利用突光显微镜观察标本，突光素受激发光的照射而发出明亮的突 光，从而确定抗原的性质，定位，以及利用定量技术测定抗原在细胞或组织中的含量。
[0067] ELISA检测人血清中的CHIP表达水平是结合在固相载体(如96孔板)表面的抗体 仍保持其免疫活性，受检标本中的抗原可以与固相载体表面的抗体发生抗原抗体反应，用 洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体符合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记 的抗体，使之也通过反应而结合在固体载体上。此时固相上的酶含量即与标本中受监测物 质的量呈正比，通过酶催化的底物颜色即可确定标本中抗原的含量。
[0068] 实施例1 :质粒构建和稳定转染细胞株的建立
[0069] 本实施例涉及构建实验所需质粒，包括CHIP沉默所需microRNA质粒、CHIP过表 达质粒（CHIP° E)、CHIP的截段体质粒（u-box质粒和TPR质粒)、构建CHIP沉默和过表达的 慢病毒载体，以及构建EGFR质粒；将上述质粒转染或感染到胰腺癌细胞中建立瞬时或稳定 表达/沉默细胞株，并对文献报道的一些和CHIP可能的靶蛋白进行初步的筛选和检测。
[0070] 1. 1实验材料
[0071] 细胞株：本实验时所用细胞株为人胰腺癌细胞株Panc-l，BXpc-3和SW1990。均由 德国海德堡大学Freiss. Η教授惠赠，本实验室液氮保存。
[0072] 实验所用载体
[0073] microRNA干扰质粒载体
[0074] 建立CHIP的干扰质粒所需载体使用的是microRNA表达载体pcDNATM6. 2-GW/ EmGFPmiR中（Invitrogen，Catalog no. K4936-00,如图1)，该载体含壮观霉素基因，质粒扩 增过程中可选壮观霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳转细胞的时候，可使用杀稻瘟菌 素作为筛选抗生素。插入序列位于BamH I和Bgl II两个酶切位点之间。
[0075] CHIP过表达或截段体所需质粒载体
[0076] 构建CHIP过表达质粒所需载体使用的是pcDNA3. 1 (+)载体（Invitrogen，V79020， 图2)。该载体具有氨苄抗性，质粒扩增时可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。 筛选稳定细胞株的时候可用新霉素作为筛选抗生素。插入序列位于BamH I和Xho I两个 酶切位点之间。
[0077] 慢病毒所需载体
[0078] 构建慢病毒所需载体为 pLenti6. 2/V5-DEST(Invitrogen，编号 V36820,图 3)。该 载体具有氨苄抗性，质粒扩增时可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳定 细胞株的时候可用杀稻瘟菌素作为筛选抗生素。插入序列位于Nhe I和BamH I两个酶切 位点之间。
[0079] 含标签载体
[0080] 构建含Flag标签的CHIP或构建含His标签的CHIP质粒所需载体使用的是 pReceiver-M01/Mll载体（GeneCopoeia，V79020,图4)。该载体具有氨节抗性，质粒扩增时 可以可用氨苄青霉素作为大肠杆菌筛选抗生素。筛选稳定细胞株的时候可用新霉素作为筛 选抗生素。插入序列位于BamH I和Xho I两个酶切位点之间。（图4)
[0081] 插入序列基因片段
[0082] CHIP的microRNA寡聚单链DNA序列，共4条作为可选microRNA
[0083]

【权利要求】
1. 一种CHIP蛋白在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。
2. 根据权利要求1所述的用途，其中所述的CHIP蛋白用于抑制胰腺癌细胞的增殖、侵 袭和转移。
3. -种CHIP蛋白在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。
4. 根据权利要求3的用途，其中所述的抗肿瘤药物是厄洛替尼。
5. -种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备用于治疗胰腺癌的药物中的用途。
6. 根据权利要求5的用途，其中所述的编码CHIP蛋白的DNA序列如SEQ ID NO :11所 /_J、1 〇
7. 根据权利要求5或6的用途，其中编码CHIP蛋白的DNA序列用于抑制胰腺癌细胞的 增殖、侵袭和转移。
8. -种编码CHIP蛋白的DNA序列在制备增强抗肿瘤药物诱导的癌细胞凋亡中的用途。
9. 根据权利要求8的用途，其中所述的抗肿瘤药物是厄洛替尼。
【文档编号】A61P35/00GK104138593SQ201310170896
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2013年5月10日
【发明者】赵玉沛, 张太平, 王天笑, 由磊, 周立, 廖泉, 戴梦华, 舒红, 徐建威, 李建, 曹喆 申请人:中国医学科学院北京协和医院