人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌药物研发中的应用的制作方法

人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌药物研发中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了人源蛋白hCINAP及其基因在抗癌药物研发中的应用。本发明的研究成果揭示了hCINAP在核糖体18S?rRNA加工中的重要作用，同时在个体水平上发现hCINAP参与肿瘤的形成，降低该基因的表达将抑制肿瘤的生长，因此，hCINAP蛋白及其基因可以作为筛选抗癌药物的靶标，以hCINAP为药物靶标，通过靶向性治疗的手段可以抑制癌细胞的生长和增殖，从而延长癌症患者的寿命。
【专利说明】人源蛋白hC I NAP及其基因在抗癌药物研发中的应用

【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体来说是人源蛋白hCINAP(全称human coilininteracting nuclear ATPase protein)在抗癌药物研发中的应用。

【背景技术】
[0002]癌症是威胁人类健康的一大杀手。目前，由于生活习惯、饮食和生存环境等诸多因素的影响，人类癌症发病率和死亡率仍成上升趋势。很多患者因得不到有效的救治而死亡。因此，开展对癌症的科学研究，寻找靶向性药物，已成为关系国计民生的重大问题，刻不容缓！
[0003]癌症研究一直是生命科学研究领域的重点和热点。而对抑癌基因p53的研究更是重中之重，原因是该蛋白与细胞周期、细胞凋亡密切相关。而癌细胞多数已失去了正常细胞的特性，能多无限的增值，因此，抑制癌细胞的增值、促进其凋亡已成为抑制肿瘤生长的关键，而P53是实现这一目标的重要靶点。
[0004]寻找能够增强p53稳定性的蛋白是一条有效的途径。目前，大量文献表明，核糖体蛋白不仅能够参与核糖体的组装，某些核糖体亚基蛋白可以通过RP-Mdm2-p53通路来调节P53蛋白的水平和细胞的生长。当细胞受到一定的胁迫刺激时，核糖体的正常组装受阻，某些核糖体亚基蛋白，包括核糖体大亚基蛋白RPL11、RPL5、RPL23、RPL26及核糖体小亚基蛋白RPS7会由核仁进入核质和胞质中，与p53发生泛素化降解的E3HDM2发生相互作用，进而抑制HDM2对p53的泛素化降解，增强p53稳定性和活性，最终阻滞细胞周期进程并促进细胞凋亡。由此可见，核糖体蛋白在增强P53稳定性方面发挥着重要的作用，那么，是否还有更多的核糖体蛋白同样具有此类功能，同时，哪些分子可以调控核糖体蛋白，进而影响P53蛋白的稳定性和活性也是一个极为重要的问题。
[0005]hCINAP，是一个新鉴定的、既具有腺苷酸激酶活性又具有ATPase活性的人源蛋白，它广泛存在于真核生物基因组中，但有关其功能报道的文献却很少。发明人所在实验室在前期工作的基础上，发现该蛋白可以通过调控核糖体蛋白RPS14的亚细胞定位，影响RPS14与HDM2的结合，进而影响p53的稳定性和活性。进一步，发明人发现hCINAP在核糖体18SrRNA的剪接中也发挥着重要作用，降低hCINAP的表达会抑制18S rRNA的剪接和40S小亚基的组装，最终导致80S核糖体和多聚核糖体数目的减少。裸鼠成瘤实验表明，当利用RNAi干涉敲低hCINAP的表达水平时，裸鼠将不再成瘤。
[0006]基于发明人的一系列研究成果，发现hCINAP是一个非常重要的抑癌标靶，在抗癌药物设计上具有较好的应用前景，因此提出申请。


【发明内容】

[0007]本发明的目的在于提供hCINAP (Access1n N0.NP_057367)及其基因在抗癌药物中的应用前景。本发明的前期工作对hCINAP以及它在果蝇、拟南芥、线虫的同源蛋白的腺苷酸激酶的特性、亚细胞定位、生物学功能等进行了初步研究，发现hCINAP在细胞核和细胞质中均有分布。更为重要的是，在酵母中，敲除hCINAP后将导致酵母致死，利用RNAi方法敲低人的hCINAP蛋白和它在线虫中的同源蛋白的表达时，细胞生存率明显降低，并且线虫生长缓慢，表明hCINAP在细胞和线虫的生长中起着重要的作用。
[0008]本发明的前期工作发现，hCINAP的过表达可以降低p53稳定性。首先用hCINAP的抗体在HEK 293T细胞裂解液中进行免疫沉淀，并对特异性条带进行质谱分析，识别了可能与hCINAP相互作用的RPS14等核糖体亚基蛋白，并通过免疫共沉淀和体外pull down实验验证了 hCINAP与RPS14之间的相互作用。同时，发明人还发现RPS14也能够与HDM2相互作用，并抑制HDM2调控的p53的降解，从而增强p53蛋白稳定性。
[0009]目前，已有研究报道类泛素分子NEDD8能够通过调节RPLll的Neddylat1n (类泛素化修饰)水平来影响其定位和稳定性，进而调控P53蛋白的活性。在本发明中，发明人发现RPS14同RPLll —样也可以被多聚NEDD8修饰。RPS14的Neddylat1n对其定位在核仁内是必需的。发明人发现，过表达hCINAP将导致RPS14 Neddylat1n减弱，亚细胞定位实验结果表明，过表达hCINAP将会使RPS14在核仁内的定位消失。该结果说明，hCINAP可以通过影响RPS14 Neddyalat1n来调控RPS14的亚细胞定位和稳定性。
[0010]在此基础上，发明人进一步研究了 hCINAP是如何影响RPS14 Neddyla1n的。发明人首先推测hCINAP可能是一个去Neddylat1n酶,但将对hCINAP可能的酶活必需的氨基酸进行突变后并没有检测到RPS14 Neddylat1n的改变，说明hCINAP本身不是一个去Neddylat1n酶。基于此，发明人进一步推断hCINAP可能通过招募一个去多聚NEDD8修饰的酶来降低RPS14的Neddylat1n，根据已有文献报道，NEDPl是目前报道最多的去Neddylat1n酶，发明人发现在过表达hCINAP时，可以检测到RPS14与NEDPl的相互作用，而不过表达hCINAP时未检测到两者的相互作用，该结果说明hCINAP可以作为一个中间接头分子介导RPS14与NEDPl的相互作用。这在一定程度上解释了 hCINAP降低RPS14Neddylat1n的分子机制。
[0011]通过上述研究，发明人发现hCINAP可以通过调控RPS14 Neddylat1n改变其亚细胞定位，进而影响RPS14与HDM2的结合，并最终影响p53蛋白的稳定性和活性。
[0012]在上述研究工作基础上，本发明进一步发现，除RPS14外，hCINAP还可以与一些核糖体前体RNA剪接因子相互作用，结合已有文献报道，酵母中hCINAP的同源基因Fap7对20S前体rRNA的切割和40S亚基的装配是必需的。基于此，发明人推断在人类，hCINAP极有可能也是一个参与核糖体RNA剪接的重要因子。为了证明这个推断，发明人通过免疫共沉淀和RT-PCR的实验方法，发现在hCINAP复合体中含有18S和28S rRNA。为了更进一步阐明hCINAP的确参与18S和28S的加工，发明人用[5，6_3H]尿嘧啶标记对照组细胞和RNAihCINAP细胞的RNA，放射自显影后发现在实验组细胞中，将hCINAP的表达降低后，18SrRNA将显著减少，然而，与对照组相比，28S rRNA并无明显变化。同时，为了充分说明hCINAP参与18S rRNA的剪接，发明人还开展了 Northern blot的实验,研究结果进一步肯定了上述结论。基于前期的研究hCINAP可以和RPS14相互作用，而已有研究结果表明，RPS14对18S rRNA的加工是必需的。因此，发明人推断hCINAP可能与RPS14协同参与18SrRNA的加工。对此，发明人利用RNAi的手段，分别降低RPS14和hCINAP的表达，发现当同时降低两者的表达时，与单独降低其中一个蛋白的表达相比，18S rRNA的加工将受到更严重的抑制。该结果表明，hCINAP和RPS14协同参与18S rRNA的加工。通过以上研究，发明人发现了一个未曾报道的参与核糖体RNA剪切的重要调控因子。进一步研究发现hCINAP在核糖体小亚基的生成中具有重要的作用。
[0013]综合以上研究结果，hCINAP不仅可以通过影响RPS14 Neddylat1n调控RPS14的亚细胞定位和稳定性，从而影响RPS14与HDM2的结合，最终影响p53蛋白的稳定性和活性，而且，hCINAP可以与RPS14协同参与核糖体18S rRNA的加工，并因此而影响核糖体小亚基和核糖体的生成，这在一定程度上揭示了未知蛋白hCINAP的功能。
[0014]基于已有的分子机制研究，为了更充分阐明hCINAP的生理功能，发明人进一步在细胞水平上检测了 hCINAP对细胞周期和细胞凋亡的影响。结果发现，当过表达hCINAP时，G2/M期细胞数目增多，细胞凋亡减少，细胞生长加快。而当降低hCINAP的表达时，G2/M期细胞数目减少，细胞凋亡增多，细胞生长减慢，并且hCINAP对细胞周期和凋亡的调控是依赖于P53的。该结果与前期发现hCINAP可以调控p53及参与核糖体18S rRNA的加工是一致的。
[0015]根据目前已有报道，酵母中hCINAP的同源基因Fap7可以拮抗砒霜诱导的白细胞凋亡，发明人推测hCINAP也参与了癌症的发生发展。对此，发明人首先比较了 hCINAP在乳腺癌、结肠癌和癌旁样本中的mRNA的表达，发现在癌组织中hCINAP表达上调，在83.33 %乳腺癌病人和70.00%的结肠癌病人中hCINAP高表达。并且在对80个结肠癌病人的跟踪中发现，hCINAP高表达的病人存活时间缩短。这在一定程度上表明hCINAP在癌症的发生发展过程中具有重要的作用，可以作为一个临床的重要监测指标。
[0016]在此基础上，为了更好地揭示hCINAP在癌症发生发展中的作用，发明人进行了体外成瘤实验和裸鼠成瘤实验。体外成瘤实验结果表明，当hCINAP表达被RNAi敲低时，肿瘤细胞的数量明显减少，而当hCINAP过表达时，与对照相比，肿瘤细胞的数量增多。同样地，裸鼠成瘤实验结果表明，与对照组相比，当利用RNAi方法将hCINAP的表达降低时，裸鼠不再成瘤！这一结果，极有力地说明了 hCINAP是参与肿瘤形成的一个关键因子，它通过影响核糖体小亚基的生成进而影响核糖体的量，并进一步调控包括P53在内的多个肿瘤发生发展相关蛋白的表达，从来调控肿瘤细胞的生长，最终影响肿瘤的发生，因此，hCINAP非常有潜力成为一个抑癌祀点。
[0017]根据上述研究成果，本发明提出hCINAP蛋白可以作为抗癌药物的药物靶标，通过靶向性治疗手段抑制癌细胞的生长和增殖。这样的药物例如hCINAP蛋白的特异性抗体，通过特异性抗体中和hCINAP蛋白，降低肿瘤细胞中hCINAP蛋白的量，从而抑制肿瘤细胞的生长。
[0018]hCINAP蛋白还可以作为靶标用以筛选抗癌药物。
[0019]所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQ ID No:1所不(Access1n Number:Q9Y3D8)。
[0020]hCINAP蛋白的基因序列包括其cDNA序列和基因组DNA序列，例如序列表中SEQ IDNO:2 所不的 cDNA 序列(Access1n Number:6880)。
[0021]hCINAP基因也可以作为抗癌药物的靶标，例如可以通过RNAi敲低hCINAP基因的表达，从而抑制癌细胞的生长和增殖。
[0022]综上所述，发明人的研究成果揭示了 hCINAP在调控p53信号通路及核糖体18SrRNA加工中的重要作用，同时在个体水平上发现hCINAP参与肿瘤的形成，降低该基因的表达将抑制肿瘤的生长，因此，结合基因工程手段，例如利用单克隆抗体中和hCINAP蛋白，可以降低肿瘤细胞内hCINAP蛋白的量，从而抑制肿瘤细胞的生长，也就是说，hCINAP可以通过靶向性治疗的手段抑制癌细胞的生长和增殖，延长癌症患者的寿命。

【专利附图】

【附图说明】
[0023]图1A受hCINAP过表达转录调控基因的功能分类；B基因本体论分析显示hCINAP所调控的基因。
[0024]图2显示了 hCINAP与RPS14存在相互作用，其中:A是通过hCINAP抗体与抗原免疫沉淀的方法寻找与hCINAP相互作用蛋白的实验结果，其中箭头所指经质谱经分析为RPS14的特异性条带；B是通过体内的免疫共沉淀验证hCINAP与RPS14存在相互作用的实验结果；C是通过体外的pull-down验证hCINAP与RPS14存在相互作用的实验结果；D是利用hCINAP与RPS14的特异性抗体检测内源hCINAP与RPS14的相互作用的实验结果。
[0025]图3显示了 hCINAP对于18S rRNA剪切是必需的，其中:A.免疫沉淀和RT-PCR分析结果显示hCINAP与含有18S rRNA和28S rRNA的复合物结合在一起；B.用[5,6-?]尿嘧啶分别标记对照组细胞和RNAi干涉的hCINAP细胞的RNA，并进行放射自显影分析的结果，对28S和18S rRNA的溴化乙啶染色在该图底部显示；C.哺乳动物中rRNA前体剪接示意图；
D.通过RNAi干涉hCINAP和/或RPS14的表达并提取总RNA，利用18S探针，通过northernblot分析检测18S rRNA水平的结果。
[0026]图4是利用蔗糖密度梯度离心技术检测hCINAP对核糖体小亚基及核糖体组装的影响的实验结果。
[0027]图5显示RPS14表达的降低抑制了 hCINAP与18S rRNA的作用。
[0028]图6显示hCINAP在人类癌症中高表达，其中:A.利用hCINAP特异性抗体，通过Western blot检测在乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中hCINAP蛋白的表达；B.RT-PCR方法检测hCINAP mRNA在乳腺癌组织和癌旁组织中的表达水平，actin mRNA被用作对照；C.免疫组化实验结果表明，与对照相比，hCINAP在乳腺癌组织中表达量高(DAB染色)；D.为免疫组化实验结果表明，与对照相比，hCINAP在和结肠癌组织中表达量高(DAB染色)(80个结肠癌病人及癌旁组织)；E.根据免疫组化实验，对hCINAP在乳腺癌和结肠癌组织中表达量进行定量分析，显示了 hCINAP高表达(high)和低表达(low)在所检测样品中的百分比，P值(Student’s t-test)**p < 0.01，—p < 0.001 ；F.hCINAP 在结肠癌组织中的高表达与结肠癌病人短存活时间相关。
[0029]图7(A_D)显示了 RNAi hCINAP对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，其中:A.用对照-shRNA 或 hCINAP-shRNA 分别转染 HCTl 16 细胞，通过 RT-PCR 和 western blot 验证hCINAP 的 mRNA和蛋白表达受到抑制；B.通过MTT(3_(4.5-dimethythiazol-2-yl)-2.5-diphenyltetrazolium bromide)分析hCINAP表达的降低抑制HCT116细胞的增殖，该实验独立重复三次(数据显示平均值土SD) ；C.通过流式细胞术分析hCINAP表达的降低对细胞周期的影响，在每个细胞周期不同阶段的细胞的百分比用柱状图表示；D.经PI染色后通过流式细胞术分析hCINAP表达的降低对细胞凋亡的影响，数据为三次独立实验的平均值(P=0.0llvs.对照)ο
[0030]图7 (E-G)显示了过表达hCINAP对细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响，其中:E.用Flag-hCINAP和空载体转染HCT116细胞，然后通过MTT实验检测hCINAP的过表达对细胞增殖的影响，该实验独立重复三次(数据显示mean土SD)，结果显示hCINAP的过表达促进了细胞增殖；F.通过流式细胞术分析hCINAP的过表达对细胞周期的影响，在每个细胞周期不同阶段的细胞的百分比用柱状图表示；G.经PI染色后通过流式细胞术分析hCINAP的过表达对细胞凋亡的影响，数据为三次独立实验的平均值(P = 0.012vs.对照)。
[0031]图8显示了 hCINAP在体外细胞成瘤中的作用，其中:A.稳定表达hCINAP-shRNA或对照-shRNA的HCT116肿瘤细胞克隆的软琼脂集落形成实验结果，显示hCINAP表达的降低抑制体外细胞成瘤，右图数据显示的是三次独立实验的平均(平均值土SD) (*p < 0.05vs.对照)稳定过表达Flag-hCINAP或GFP空载体的HCTl 16细胞接种到软琼脂中，7天后观察到的克隆形成情况，显示hCINAP的过表达促进体外细胞成瘤，数据显示的是三次独立实验的平均(平均值土 SD) (*p < 0.05vs.对照)。
[0032]图9显示了 hCINAP对裸鼠成瘤的影响，其中:A.验证shRNA_l干涉hCINAP表达的效果的Western blot实验结果图；B.裸鼠成瘤实验结果,利用稳定表达hCINAP-shRNA的HCT116细胞(2X106)分别注射10只裸鼠，与对照组(10只)相比，裸鼠不再成瘤。

【具体实施方式】
[0033]以下实施方案进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
[0034]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0035]实施例1 hCINAP所调控的基因
[0036]为了研究hCINAP的调控作用，我们筛选获得hCINAP稳定表达的HCTl 16细胞(见实验具体方法)，提取 mRNA,通过 Illumina Solexa ultrasequencing 进行 RNA-seq 分析。最终发现与对照相比，在hCINAP过表达细胞中，有11，329种mRNA的表达变化明显。进一步通过基因本体论分析发现发生明显变化的基因主要参与以下生理过程:RNA代谢过程，翻译调控，细胞成分的组成和生物合成，以及基因表达(图1A)。而且，基因本体论分析显示hCINAP的高表达引起基因表达的变化大多与RNA代谢和翻译相关，这些基因与细胞的转化和肿瘤生成密切相关(图1B)。
[0037]实施例2 hCINAP与rRNA剪切因子RPS14相互作用
[0038]我们利用hCINAP的抗体(制备方法见实验具体方法)在人类细胞系HEK 293T细胞裂解液中进行免疫沉淀，然后将免疫沉淀复合物进行SDS-PAGE电泳分析来寻找能与hCINAP发生相互作用的蛋白。结果如图2A所示，和对照IgG相比，在hCINAP抗体免疫沉淀复合物内能检测到一些特异性条带，我们分别切下特异性条带进行质谱分析，找到一些可能与hCINAP相互作用的靶蛋白，包括核糖体亚基蛋白如RPS14、RPL6等，核糖体RNA结合蛋白或到接因子，或是癌症相关蛋白。
[0039]由于RPS14最近被证明是人类第五条染色体长臂末端缺失综合症(5qiyndrome)的一个关键基因，核糖体亚基蛋白参与P53活性的调节，而且相关研究证明p53通路与5q-Syndr0me疾病也有很大的关联。三是RPS14在核糖体RNA的剪接中具有重要作用，并且，越来越多的文献报道核糖体亚基蛋白也与细胞凋亡以及癌症密切相关。所以我们选择RPS14进行深入研究。
[0040]为了进一步验证hCINAP与RPS14存在相互作用，我们首先通过免疫共沉淀的方法进行验证。Flag-hCINAP和HA-RPS14共转染HEK 293T细胞，48小时后，收获细胞并裂解，然后分别用Control IgG、Flag和HA抗体进行免疫沉淀，将免疫沉淀复合物进行蛋白质印记分析。在过表达Flag-hCINAP和HA-RPS14的HEK 293T细胞裂解液中，无论是用hCINAP的标签抗体Flag还是用RPS14的标签抗体HA进行免疫沉淀,在免疫沉淀复合物内都能检测到另外一个蛋白的存在，这说明两者确实存在相互作用(图2B)。
[0041]接着，通过体外pull-down的方法，进一步研究两者是否是直接的相互作用。我们首先通过大肠杆菌表达、超声波裂解、亲和纯化和分子筛的方法，得到纯度很高的、带有His标签的hCINAP、GST标签的RPS14和GST标签蛋白。通过结合GST柱料，能检测到GST-RPS14与His-hCINAP的相互作用，而不能检测到对照GST标签蛋白与His-hCINAP的相互作用。反之，通过结合His的柱料，也能检测到His-hCINAP与GST-RPS14存在相互作用(图2C)。
[0042]我们还利用hCINAP与RPS14的抗体对两个蛋白的内源相互作用进行了检测，进一步证明两个蛋白在生理条件下在细胞内具有相互作用(图2D)。
[0043]上述实验结果可以说明hCINAP与RPS14在体内和体外都存在特异性的相互作用，而且两者之间的相互作用直接的。这些研究结果表明RPS14是hCINAP的相互作用蛋白。
[0044]实施例3 hCINAP是18S rRNA剪切所必需的
[0045]由于RPS14是rRNA的剪接因子，它与hCINAP具有相互作用。为了研究hCINAP在rRNA剪接和核糖体组装中的作用，我们首先通过免疫沉淀和RT-PCR分析检测了 hCINAP是否与rRNAs相互作用。如图3A所示，用图中所示不同质粒的HEK 293T转染细胞，利用对照IgG、ant1-hCINAP或anti_RPS14对细胞裂解液进行免疫沉淀分析，并提取RNA，利用18SrRNA或28S rRNA的特异性引物进行RT-PCR分析，结果发现，与RPS14相类似，hCINAP与含有18SrRNA和28S rRNA的复合物相互作用，表明hCINAP很可能参与18S或28S rRNA的剪接。
[0046]为了进一步阐明hCINAP在18S rRNA或28S rRNA成熟中的作用，我们用[5，6-?]尿嘧啶标记对照组细胞和RNAi干涉的hCINAP细胞的RNA，具体是用对照shRNA(5’-UUCUCCGAACGU(；UCACGU-3’，SEQ ID No:3)和 hCINAP-shRNA-l(5，-CAGAGUAGUUGAUGAGUUA-3’，SEQ ID No:4)转染HeLa细胞72小时，然后用[5,6-?]尿嘧啶脉冲标记对照组细胞和RNAi干涉的hCINAP细胞的RNA，提取细胞总RNA，放射自显影后发现:在实验组细胞中，降低hCINAP的表达后，18S rRNA将显著减少，一致地，30S rRNA的积累明显增多。然而，与对照组相比，28S rRNA并无明显变化(图3B)。这些结果说明hCINAP在18S rRNA的剪接成熟中，而不是在28S rRNA的剪接中发挥作用。
[0047]为了充分说明hCINAP对于18S rRNA的剪接是必需的，发明人通过RNAi干涉hCINAP和/或RPS14的表达，然后提取总RNA，利用地高辛DIG标记能够特异性地与18SrRNA序列互补的探针进行了 Northern blot实验,检测18S rRNA的水平。研究结果进一步证明了上述结论，如图3D所示，hCINAP表达的降低导致18S rRNA明显减少，同时用RNAi干涉hCINAP和RPS14的表达时，18S rRNA的减少更为明显。这些数据证明hCINAP是一个新的rRNA剪接因子，对于人类细胞18S rRNA的加工是必需的。
[0048]实施例4 hCINAP对核糖体40S小亚基的生成至关重要
[0049]由于hCINAP在18S rRNA剪接中发挥重要的作用，所以发明人通过蔗糖密度梯度离心技术进一步检测了 hCINAP对核糖体小亚基及核糖体组装的影响(图4)。利用hCINAP-shRNA和?011廿01-8111?嫩分别转染!1(:1'116细胞，获得稳定细胞株，对细胞进行裂解，提取细胞质组分，然后通过蔗糖密度梯度离心以及在A254nm下分析检测核糖体小亚基、大亚基以及核糖体等不同大小的组分，结果如图4所示。结果发现hCINAP表达的缺失严重抑制40S核糖体小亚基的生成，并且80S核糖体以及多聚核糖体的量也明显下降(图4A)。利用ant1-hCINAP抗体,通过Western blot对不同组分中hCINAP的水平进行了检测,发现hCINAP主要存在于核糖体小亚基中，在完整核糖体以及多聚核糖体中没有检测到该蛋白，说明hCINAP并不是核糖体的组分，只是在核糖体亚基的生成中发挥重要的作用。同样地，在细胞中过表达hCINAP或空载体，然后通过蔗糖密度梯度离心分析过表达hCINAP对核糖体生成的影响，结果发现过表达hCINAP促进了核糖体的生成(图4B)。
[0050]实施例5 hCINAP通过与RPS14结合作用到18S rRNA上
[0051]在实施例3中，发明人发现hCINAP与RPS14的表达被同时降低时，与单独降低hCINAP表达相比，其所引起的18S rRNA的降低更为明显。为了进一步研究hCINAP与RPS14在18SrRNA剪接中作用关系，发明人利用RPS14_shRNA转染A549细胞96小时，利用ant1-hCINAP抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀分析，然后提取RNA，利用18S rRNA特异性引物进行RT-PCR分析，结果发现RPS14表达的降低导致免疫沉淀物中18S rRNA的量明显减弱(图5)。对hCINAP晶体结构的分析发现，该蛋白的表面富含负电荷，不可能与RNA直接结合。这些结果表明hCINAP通过与RPS14结合作用到18S rRNA上。
[0052]实施例6 hCINAP在癌症组织中高表达
[0053]核糖体的生物合成对于维持细胞的生长和增殖，对于肿瘤的生成也是至关重要的。由于hCINAP在核糖体的生物合成中具有重要的作用。为了研究hCINAP与肿瘤的相关性，发明人首先在不同的乳腺癌细胞和正常乳腺细胞中检测比较了 hCINAP的表达水平，结果发现，与相比，hCINAP在乳腺癌中表达量明显高于正常乳腺细胞(图6A)。接着，收集了20个乳腺癌病人组织及癌旁对照组织，提取RNA，通过RT-PCR方法检测hCINAP在乳腺癌组织和癌旁组织中mRNA的表达水平，如图6B所示，在大多数乳腺癌组织中hCINAP的mRNA水平都明显高于癌旁组织。进一步，利用hCINAP特异性抗体，通过免疫组化实验，对hCINAP在乳腺癌和结肠癌病人组织中的蛋白表达水平进行了检测。与对照癌旁组织相比，hCINAP在乳腺癌和结肠癌组织中表达量高(图6C-E)。发明人对80个结肠癌病人的生存时间与hCINAP高表达的相关性进行了分析，结果发现hCINAP的高表达(病人癌组织的高阳性染色)与术后病人的较短生存时间有显著的相关性(图6F)，表明hCINAP在临床癌症诊断中可以作为有用的生物标记。这些结果表明hCINAP在癌症组织中高表达，很可能与肿瘤的发生发展密切相关。
[0054]实施例7 hCINAP调控细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡。
[0055]为了研究hCINAP在肿瘤细胞增殖中的调控作用和机制，发明人进一步检测了hCINAP 对细胞增殖的影响。利用表达 hCINAP-shRNA-Ι (5’ -CAGAGUAGUUGAUGAGUUA, SEQ IDNo:4)，或hCINAP-shRNA-2(5’-GAGAGAAGGUGGAGUUAUU，SEQ ID No:5)的慢病毒转染 HCT116细胞，干涉hCINAP的表达，并通过RT-PCR以及Western blot验证了 RNA干涉的效率，表明hCINAP的表达的确受到抑制(图7A)。接着，筛选稳定表达hCINAP-shRNA-Ι的细胞并检测hCINAP表达的降低对细胞增殖的影响。结果显示，与对照相比，hCINAP表达降低的HCT116细胞的生长明显变慢(图7B)。与该结果相一致，过表达hCINAP促进细胞的增殖(图7E)。我们进一步通过FACS实验检测了 hCINAP是否通过影响细胞周期和凋亡的来调节肿瘤细胞的增殖。结果如图7C和7D所示，与对照相比，hCINAP表达的降低使得G2/M期分布的细胞明显减少(图7C)，并且促进细胞凋亡(图7D)。相一致地，hCINAP的过表达能够增加在G2/M期分布的细胞，并明显抑制细胞凋亡(图7F，图7G)。
[0056]实施例8 hCINAP在体外细胞成瘤中的作用
[0057]由于细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡中发挥重要的调控作用，发明人进一步检测了 hCINAP在体外细胞成瘤中的作用。稳定表达hCINAP和hCINAP-shRNA的HCTl 16细胞分别利用软琼脂集落形成(soft agar colony-format1n)实验来检测hCINAP的过表达和表达降低对细胞成瘤的影响。结果如图8所示，与对照相比，在hCINAP表达敲低的HCT116细胞中，形成的细胞克隆数目明显减少(图8A)，而在hCINAP过表达的细胞中，细胞克隆明显增大，数目明显增多(图SB)。这些数据表明hCINAP在体外细胞成瘤中发挥重要的调节作用。
[0058]实施例9 hCINAP在裸鼠体内成瘤中的作用
[0059]为了进一步证明hCINAP在肿瘤形成中的作用，发明人对hCINAP在裸鼠成瘤中的作用进行了研究。首先利用稳定表达hCINAP-shRNA-Ι或对照shRNA慢病毒侵染HCT116细胞，筛选获得稳定表达hCINAP-shRNA的细胞，通过Western blot验证了 hCINAP表达的降低(图9A)。然后将hCINAP低表达的细胞和对照细胞分别各注射10只裸鼠的右侧腹部，3周后比较裸鼠成瘤的情况。结果发现，注射对照shRNA的细胞在7天后就观察到了肿瘤的形成，注射hCINAP-shRNA细胞的小鼠未观察到肿瘤的形成。3周后，对照组小鼠的肿瘤变大至103mm3(图9B，上)；相反地，hCINAP表达被干涉的HCT116细胞没有引起任何肿瘤的形成(图9B，下)。这些结果与【具体实施方式】八中的体外成瘤实验结果一致，表明hCINAP在体内肿瘤形成中是必需的。
[0060]上述实施例中所涉及的各种实验的具体方法如下:
[0061]hCINAP稳定细胞系的筛选
[0062]实验前一天，接种细胞并保持细胞处于良好的生长状态。以小皿为例(1cm2)，在
1.5mlEP管中加入Iml含10%胎牛血清的培养基，向其中加入20 μ I病毒(Μ0Ι = 10)，并加入1μ 1(1000倍稀释)polybrane辅助病毒入侵细胞，用枪头反复吹打几下混匀。将上述含有病毒的培养基加入到培养皿中继续培养。24小时后，更换新鲜的培养基，以保证细胞较好的生长状态。当病毒侵染时间达到72小时时，加入嘌呤霉素(2 μ g/ml),此时,没有被病毒侵染的细胞由于不具有对该抗生素的抵抗能力而被杀死，存活下来的细胞即为被病毒成功侵染的细胞，继续培养，即为hCINAP的稳定表达细胞系。
[0063]hCINAP抗体的制备
[0064]构建带有his标签的hCINAP原核表达载体，转化大肠杆菌DH_5 α，次日挑单克隆摇菌，加入IPTG诱导蛋白表达，裂解菌液，离心收集蛋白上清，将上清过镍柱纯化蛋白，将纯化后的蛋白免疫兔子，一个月后收集兔子的血清，即可得到hCINAP的抗体，为了提高抗体的特异性，将含有抗体的血清进行抗原抗体亲和层析，可进一步获得效价更好，特异性更高的抗体，用作后续Western blot以及免疫组化等实验。
[0065]Western Blo 实验
[0066]蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝纤维膜，常规配置转移缓冲液(5.8g Tris, 2.9gGly,0.375g SDS, 200ml甲醇)，冰浴下150mA转移2h (胶冲阴极，膜冲阳极)；将转移成功的硝纤膜置于TBS T缓冲液(1.21g Tris，4g NaCl，1/1000体积的吐温-20)中冲洗2-3次，转入1ml封闭缓冲液(0.5g脱脂奶粉，Iml 10 X TBS, 10 μ I吐温-20)室温封闭Ih或4°C过夜；加入抗体稀释液(0.5g BSA, Iml 10 X TBS, 10 μ I吐温-20)稀释至工作浓度的一抗溶液，室温孵育2h，TBST洗三次，5min/次；接着加入抗体稀释液稀释至工作浓度的二抗溶液，室温孵育50min，TBST洗2次，5min/次，借助仪器Odyssey扫膜。
[0067]免疫荧光实验
[0068]以检测NEDPl对RPS14亚细胞定位的影响为例，说明具体的实施过程。
[0069]在HeLa中同时转染两种质粒,36h后弃掉培养基,PBS洗三次,每次5min ;加入Iml预冷的无水甲醇，_20°C放置1min (切不可剧烈)冰上操作；预冷的PBS洗3次，每次加2ml,冰上5min,轻摇。
[0070]在载玻片上加一层Parafilm膜，将60 μ I I % BSA点加到上面，然后将盖玻片放到膜上，一定要分清细胞面的方向，37°C放置30min，放在湿盒里。封闭完后，用预冷的PBS洗2次,每次5min,放置于冰上。I % BSA稀释一抗(100 X),方法与封闭一样,放置湿盒子里，37°Clh。PBS洗3次，每次5min，冰上。加二抗，将含有二抗的BSA 60μ1点加到载玻片上，放置湿盒子里，37°C Ih0 二抗结束后，PBS洗3次，每次5min，2ml，洗的过程中注意避光。封片:取20 μ I混合液点加到新的载玻片上，将洗干净的盖玻片盖在上面，放在室温下让盖玻片充分凝固(混合液中含有指甲油、DAPI染料等组分)。
[0071]免疫共沉淀实验
[0072]以鉴定RPS14与HDM2的相互作用为例，说明具体的实施方法。
[0073]在HCT116细胞中同时过表达Pffl-HA-RPS14和Paiy-Myc_HDM2，转染48h后收集细胞，将培养基弃掉，加入8ml预冷的PBS将细胞吹起，转移到15ml的离心管中，4°C，3000rpm离心5min。离心后，将上清去掉，加入Iml PBS将细胞沉淀吹起，转移到1.5ml EP管中，4°C，3000rpm离心5min收集细胞。将上清去除后，加入Iml细胞裂解液，同时加入200X蛋白酶抑制剂。在4°C旋转混合仪上裂解2h。裂解后，4°C，13800rpm离心15min，将上清转移到另一支新的EP管中，加入80 μ I Protein G预清除40min。结束后,4°C, 3000rpm离心5min,取上清转移到另一支新管中，先取25 μ I作为input,其余上清加入相应抗体，4°C旋转混合仪上混合过夜。次日9时,每管加入80μ I Protein G,混匀4h左右。此后,取出EP管,现在冰上静置5min,然后4°C, 3000rpm离心5min,将上清去掉，向沉淀下来的珠子中加入Iml细胞裂解液，并将珠子充分散开，以达到洗涤的目的，4°C，3000rpm离心5min，去掉上清液，如此重复2次。最后一次离心后，将珠子中的液体充分吸净，加入25 μ I loading buffer,96°C煮样 lOmin。准备做 Western Blot。
[0074]从乳腺癌样本中提取hCINAP mRNA进行RT-PCR
[0075]实验中用到的研钵、研钵棒、药匙、镊子都要用自来水及蒸馏水冲洗干净，200°C烘烤2h。样品一般可以保存在_80°C或者液氮中，把所用用品准备好后，取出样品，放在冰上。
[0076]取出研钵(烘烤时用锡箔纸包着)和研钵棒，加入液氮预冷，然后用药匙从样品管中将样品取出，先用研钵棒将大的组织块碾碎，然后将继续将组织颗粒研磨到肉眼不可见即可，待液氮挥发完后，加入Trizol Iml/小皿，然后用研钵棒捻几下，放在冰上。此时研碎后的样品呈固体状，待完全融化为液体后将其转移到1.5ml EP管中。
[0077]加入200 μ I三氯甲烷，上下混匀15s，放置2min，12000g 4°C离心15min。离心后，分为3层,无色水相、中间层和黄色有机相(RNA在水相中)，取约450 μ I上层水相于另一个EP管中，加入等体积的异丙醇,上下混勻10次,室温静置lOmin, 12000rpm 4°C离心lOmin。离心后，将上层清液吸掉，尽量把杂质吸净，RNA沉到管底，很少量呈凝胶状，将其在60°C水浴中溶解再吹打几次。
[0078]加入预冷的Iml 70%的乙醇(用DEPC处理)，此时RNA会被吹起，7500rpm 4°C离心5min，离心后，将上清吸净。将离心管放置在EP管架上静置约2min 30s,加入RNase freewater将沉淀反复吹打几下(约10次)，60°C水浴1min,用枪头反复吹打几下,放在冰上，测定浓度和纯度。做PCR需要的RNA约I μ g，根据所测的浓度，计算加入RNA的体积，进行RT-PCR。
[0079]免疫沉淀和免疫印记
[0080]转染前一天将293T或HCT116细胞以合适的密度(一般按1: 4传代)接种于培养皿中，在37°C含有5% CO2的培养箱中培养过夜后，其细胞汇合率达到70-80%左右，用Mega Tranl.0转染试剂共转染所要表达的真核质粒；转染48或72小时后在4°C, 3000rpm离心5分钟收集细胞，并用预冷的PBS洗两次之后，一个培养皿的细胞量加入Iml的NP-40细胞裂解液，并在4°C混合器上裂解2小时；之后，在4°C，13000rpm离心15分钟，取上清，加入60 μ I protein G进行预清除,在4°C混勻器上孵I小时；然后,在4°C, 2000rpm离心5分钟，将上清转移至新的1.5ml离心管中，加入相应的抗体与抗原进行免疫沉淀，其最终浓度到达5 μ g/ml，在另一离心管中加入等量的免疫前IgG作为阴性对照，并在4°C混匀器上孵育过夜；第二天早上每管分别加入75 μ I protein G，在4°C孵育3_5小时；然后，在4°C，2000rpm离心5分钟，弃上清；沉淀用细胞裂解液洗2_3次，并尽可能将上清去除干净,加入30 μ 12 X loading buffer混匀后95°C煮样10-15分钟；在13000rpm离心15分钟之后取上清进行SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后用蛋白质免疫印记实验检测其相互作用情况。
[0081]把SDD-PAGE上的蛋白质通过转膜仪转到硝酸纤维素膜上，首先用5%牛奶进行封闭I小时，然后加入相应的一抗室温反应2小时，用PBST洗两次之后，加入相应的二抗，室温反应I小时之后，再用PBST洗两次之后，用L1-COR Odyssey进行扫描。
[0082]体外的pull-down分析
[0083]为了验证两个蛋白质是否存在直接的相互作用，如hCINAP与RPS14，我们分别用原核表达并纯化了带有His标签的hCINAP蛋白和GST标签的RPS14蛋白，然后用体外pull-down方法验证它们是否存在直接的相互作用。本实验首先以His-hCINAP诱馆蛋白，GST-RPS14为捕获蛋白，两个蛋白都是在E.coli BL21(DE3)表达并纯化，具体的实验步骤如下:首先取100 μ I介质N1-NTA agarose于1.5ml的离心管中，然后用缓冲液(与诱饵蛋白的缓冲液一致)洗3次，500 μ I/次；在4°〇，2000印111离心I分钟，弃上清；加入300 μ I预冷的结合缓冲液PBS，然后加入50 μ g的诱饵蛋白His-hCINAP，并在4°C混匀器上孵育I小时；用缓冲液洗3次，洗去与介质没有结合上去以及结合不牢固的诱饵蛋白，并在4°C，2000rpm离心I分钟，弃上清；并加入300 μ I预冷的结合缓冲液PBS，然后加入50 μ g的捕获蛋白GST-RPS14，在4°C混匀器上孵育3-5小时；用含有30mM咪唑的缓冲液洗3次，洗去没有结合上的或与柱料非特异结合的捕获蛋白质，在4°C，2000rpm离心I分钟，弃上清；用50 μ I含有300mM咪唑的缓冲液洗脱诱饵与捕获蛋白复合物，充分涡旋后，在4°C，2000rpm离心I分钟，将上清分别转移到新的1.5ml离心管中；加入等体积的2X loading buffer,并在95°C煮样10-15分钟；在13000rpm离心15分钟后，取上清进行SDS-PAGE电泳和蛋白质免疫印记的方法分析其相互在作用。
【权利要求】
1.hCINAP蛋白的应用，其特征在于，以hCINAP蛋白作为抗癌药物的靶标。
2.hCINAP蛋白的应用，其特征在于，以hCINAP蛋白作为靶标筛选抗癌药物。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQID No:1 所示。
4.hCINAP蛋白基因的应用，其特征在于，以hCINAP蛋白基因作为抗癌药物的靶标。
5.hCINAP蛋白基因的应用，其特征在于，以hCINAP蛋白基因作为靶标筛选抗癌药物。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述hCINAP蛋白基因的序列如序列表中 SEQ ID No:2 所示。
7.一种抗癌药物，其特征在于，所述药物以hCINAP蛋白或其基因作为药物靶标。
8.如权利要求7所述的抗癌药物，其特征在于，所述药物是hCINAP蛋白的特异性抗体，或者是hCINAP蛋白基因的干扰RNA。
9.如权利要求8所述的抗癌药物，其特征在于，所述干扰RNA的序列如序列表中SEQIDNo:4 或 SEQ ID No:5 所示。
10.如权利要求7所述的抗癌药物，其特征在于，所述hCINAP蛋白的序列如序列表中SEQ ID No:I所不；所述hCINAP蛋白基因的序列如序列表中SEQ ID No:2所不。
【文档编号】A61P35/00GK104174020SQ201310189029
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月21日 优先权日:2013年5月21日
【发明者】郑晓峰, 白冬梅, 张金方 申请人:北京大学