蛋白酶体抑制剂在制备治疗慢性低度炎症性疾病药物中的用途
【专利摘要】本发明属生物【技术领域】，涉及蛋白酶体抑制剂的新用途。本发明提供了蛋白酶体抑制剂类化合物调控TM4的表达，产生抗炎与调节能量代谢的功能，应用所述蛋白酶体抑制剂MG132、MG341、MG519等，可使TM4上调、过表达USP19或降低期降解亦能上调TM4，从而发挥抗炎、调节代谢的效应；进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物的用途，所述的治疗慢性低度炎症性疾病的药物可用于肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的防治。本发明并从体内、体外，基因剔除、过表达，动物、人群，等诸多方面验证了高脂-TM4-炎症-肥胖这一全新机制，具有较高的临床价值。
【专利说明】
蛋白酶体抑制剂在制备治疗慢性低度炎症性疾病药
物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明属生物【技术领域】,涉及蛋白酶体抑制剂(proteinsome inhibitor)的新用途；具体涉及蛋白酶体抑制剂及USP-19 (ubiquitin specific peptidase 19经四次穿膜蛋白(TM4)途径产生抗炎与调节能量代谢的功能，进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。
【背景技术】
[0002]研究公开了，真核细胞中存在着多种蛋白降解途径，其中最主要的途径有两种:(1)溶酶体途径:主要是降解细胞吞入的胞外蛋白质；(2)泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-proteasome Pathway, UPP):经细胞颗粒中蛋白酶体降解泛素化的细胞内蛋白质，其中，泛素-蛋白酶体途径为近期受到关注的调节蛋白质降解与功能的重要系统。通常情况下，细胞内膜相关蛋白和某些在应激状态下产生的蛋白质以及通过内吞过程从胞外摄取的蛋白质等主要经溶酶体途径降解，其中，泛素-蛋白酶体通路负责降解对体内调控细胞增殖和凋亡信号传导的蛋白，如抑癌因子P53、p21、促凋亡蛋白Bax、细胞周期蛋白、核因子抑制蛋白I_KB、C-Jun氨基端激酶(C-Jun N-terminal kinase, JNK)等；而参与凋亡的重要蛋白酶caspase-3也受到所述UPS调节；因此，泛素-蛋白酶体通路在调控细胞周期和肿瘤生长中发挥极为重要的作用，渐成为肿瘤治疗的新靶点。目前，经美国食品药物管理局(FDA)批准，蛋白酶体抑制剂PS-341已经进入II期临床应用于肿瘤的治疗，并取得了比较理想的治疗效果。此外，利用所述蛋白酶体抑制剂改变蛋白酶体的酶切位点活性正在免疫、炎症等研究领域的关注点。
[0003]肥胖症和糖尿病已经成为全球性的流行病，其发病率仍在不断地增加；据世界卫生组织统计，至2002年全球将有10亿成人处于超重，其中3亿达到肥胖标准；北美、英国、西欧、中东、太平洋群岛及中国等地区1980年以来肥胖患者数量增加了 3倍，其中美国约1/3的人口是肥胖患者，我国肥胖和超重的发病率从1992至2002年由20%增加到29%。最为令人担忧的是，肥胖可诱发和加重多种疾病，如2型糖尿病、心血管系统疾病(高血压、动脉粥样硬化)、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、非酒精性脂肪肝、肾脏损害、关节炎、哮喘以及某些肿瘤。其中，由肥胖引发的直接和间接经济开支亦是惊人，例如，2000年美国由肥胖导致的开支达1170亿美元。肥胖已经成为危害人类健康和增加国家经济负担的一个重要因素；因此，肥胖预防和治疗已经成为新时代医学领域的新的重大课题。
[0004]有研究指出，肥胖的发病机制就是机体能量代谢失衡，即能量摄入大于能量消耗，导致能量以脂肪的形式储存在体内；能量摄入过多，包括食欲增强或亢进、胃肠消化吸收功能改变等；研究显示，食欲的调控中枢位于下丘脑，下丘脑同时接受胃肠道、脂肪、胰腺等组织器官分泌激素的调控，进一步分泌食欲调控激素调节机体摄食活动；下丘脑调控食欲的激素主要包括弓状核分泌的促进食欲的刺鼠相关肽(AgRP)、神经肽Y(NPY)及室旁核分泌的抑制食欲的可卡因-苯丙胺调控转录物(CART)、阿黑皮素(POMC);胃肠道分泌的调控食欲的激素包括:Ghrelin、胆囊收缩素(CCK)、高血糖素样肽I (GLP-1)、多肽YY (PYY)、胃泌酸调节素(Oxm)、胃泌素等，胰腺分泌胰岛素、胰多肽、胰岛淀粉样多肽等，脂肪组织有瘦素(Leptin);当上述激素的分泌出现紊乱或异常时，引起机体食欲的变化，影响机体食物的摄入量；有实验显示，当小鼠剔除Leptin基因时，抑制摄食中枢活动的信号通路受阻，小鼠的食欲明亢进，进食量显著增加，出现明显的肥胖表型；呈现肥胖时，可引起I印tin抵抗，使得脂肪组织分泌Ieptin增加,但进入下丘脑的Ieptin减少，削弱了 Ieptin对食欲的抑制作用；此外，下丘脑分泌的激素还受到记忆、环境因素、情绪、昼夜节律等的影响；而胃肠道能量代谢的调节首先通过分泌激素调控了机体摄食中枢的活性，其次，胃肠道内各种菌群差异也是引起肥胖的一个重要因素，胃肠本身的大小长短亦影响机体对食物的储留和营养的吸收。肥胖发病的第二个原因是，机体能量利用或消耗减少:(1)机体活动减少，对能量的需求和消耗均减少，导致能量摄入相对过多，如工作强度和生活习惯的改变；(2)机体参与能量代谢的激素、酶及其他相关蛋白的含量、活性发生改变，如甲状腺激素、儿茶酚胺类、糖皮质激素、胰岛素、脂连素、抵抗素、UCP-1/2, GLUT-4、I印tin及其受体、PPAR-Y、白介素(IL)、肿瘤坏死因子α (TNF-α )等含量或活性异常均能够引起机体能量代谢异常；其中，所述白介素、肿瘤坏死因子等为炎症因子，而所述因子受代谢性因素(糖、脂、糖基化产物等)的刺激，在巨噬细胞和脂肪细胞的表达和分泌均显著增加，可引起明显的胰岛素抵抗，因此慢性炎症与肥胖的关系成为新的研究热点。
[0005]研究表明，肥胖和2型糖尿病是一种慢性低度炎症性疾病。临床流行病学调查显示，肥胖和2型糖尿病患者血中纤维蛋白原、TNF-a、IL-6、C反应蛋白等均显著升高，且TNF-a等可引起机体明显的胰岛素抵抗，表明肥胖的发生发展与炎症的发生有着密不可分的联系。有研究证实，高糖高脂等代谢性因素可通过多种途径激活炎症细胞，释放炎症介质，引起机体胰岛素抵抗等；如高糖提高细胞核内NF-κΒ与DNA的结合，减少IkB的表达，增加IKKa、IKKi3激酶蛋白水平，增强该两种激酶对I K Ba/β的磷酸化，促进I κ Ba/β通过泛素途径进行降解；同时高糖增加促炎症转录因子AP-1和Egr-1蛋白水平；而高脂则直接通过toll样受体4活化PKC，诱导下游IKK和JNK两条炎症相关通路的激活，引起机体胰岛素抵抗，破坏机体能量代谢平衡。研究还显示，在脂肪组织中，脂肪细胞内脂质沉积增加，导致脂肪细胞肥大，分泌多种炎症因子，如TNF-a、白介素6 (IL-6)、单核细胞趋化因子-1 (MCP-1)、纤溶酶原激活物抑制物I等；其中MCP-1的增加进一步促进单核巨噬细胞向脂肪组织侵润、活化、吞噬脂质并释放炎症因子，导致脂肪组织炎症的加剧，改变脂肪组织各类炎症因子及脂肪因子的分泌量，促使机体肥胖加重。有关研究还显示，NF-kB信号通路的两个重要调控分子IKKβ、IKK ε的基因剔除模型证实抑制炎症信号通路可明显改善机体胰岛素抵抗及抑制高热量饮食诱发的肥胖，但肥胖和炎症的关系尚未完全阐明；目前主要认为上述两者通过以下途径发挥相互作用:toll样受体途径、氧化应激途径、内质网应激途径等。本申请的发明人拟应用蛋白酶体抑制剂MG132使TM4上调、过表达USP19上调TM4，提供该蛋白酶体抑制剂的抗炎、调节代谢的新用途，进一步用于制备防治肥胖、糖尿病和动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的药物。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供蛋白酶体抑制剂(proteinsome inhibitor)的新用途；具体涉及蛋白酶体抑制剂及其相互作用蛋白经四次穿膜蛋白(TM4)途径产生抗炎与调节能量代谢的作用，进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。
[0007]本发明运用表达序列标签(EST)及cDNA芯片技术研究证实人下丘脑、脂肪等组织和高糖高脂糖尿病猴主动脉、胰腺等组织中的基因表达谱，克隆得到有关新基因与肥胖及2型糖尿病的发病机制有关，尤其是其中的表达的蛋白含有4个穿膜结构袢的基因，本发明命名为4次穿膜(Transmembrane 4，TM4)蛋白，TM4为跨膜蛋白，存在于细胞膜及核膜，该基因在糖尿病猴组织中下调最为明显。
[0008]本发明所述的蛋白酶体抑制剂包括MG 132、MG341、MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5 和 USP19。
[0009]本发明中，通过酵母双杂交获得TM4相互作用蛋白，包括Nur77、RNF-5 (ringfinger protein-5)、USP-19 (ubiquitin specific peptidase 19)等，并通过 pull down试验证实TM4与Nu77相互作用；
本发明中，实验证实了蛋白酶体抑制剂与相互作用蛋白USP 19能够增加TM4的量； 本发明所述的USP19可增加TM4含量，USP19降解抑制剂可作为治疗慢性炎症。
[0010]本发明中，制备了 TM4基因剔除小鼠，并从基因组水平和蛋白水平鉴定模型构建成功；通过TM4基因剔除小鼠模型，证实在高脂饮食诱导下TM4基因剔除小鼠呈现显肥胖表型，肥胖鼠脂肪、体重比明显增加，且摄食量显著增加，糖耐量减退；TM4基因剔除的肥胖小鼠脂肪和肝脏micro-array结果显示Nur77和NF κ B表达明显增高,糖耐量减退；
本发明中，高脂诱导条件下，可以显著下调ΤΜ4蛋白表达水平，通过构建慢病毒干扰ΤΜ4后，可引起Nur77蛋白水平上调，且该调控作用不在转录水平，进而导致IKK β和IKK ε的表达增强，从而调节NF-κ B炎症通路的信号转导，使得各类炎症因子分泌增加，其中，IKK ε还可抑制UCP-1表达，使得脂肪组织通过UCP表达减少，抑制脂肪的分解，诱发或加重肥胖；本发明的实际临床标本中，验证ΤΜ4在糖尿病病人中显著下调；
本发明中，经试验证实，Nur77的上调使得IKK-b表达增强；过表达TM4可引起Nur77蛋白水平下调，IKK-b表达降低；
本发明中，经试验证实TM4基因剔除小鼠模型血压高于正常对照组小鼠，血管张力实验证实基因剔除后小鼠舒张功能受限；.db/db小鼠过表达TM4基因后，肥胖、高血压、高血糖得到明显缓解；本发明的临床实验中，96个肥胖患者观察到4例病人TM4外显子杂合突变(L26F、S128P、P227S)，进一步家系筛查发现这些突变和肥胖共分离。
[0011]本发明中，实验显示，在下丘脑-垂体轴中，Nur77调控食欲的关键激素a-MSH前体物POMC的表达，Nur77通过结合POMC上游抑制性调控元件抑制PMOC的转录，减少POMC的产生；机体能量过剩可以引起下丘脑内质网应，导致IKKb-NF-kB通路的激活，继而改变下丘脑内AGRP神经元活性，导摄食改变，并引起机体胰岛素抵抗、I印tin抵抗和糖代谢紊舌L研究发现，乙酰化可以调节糖脂代谢酶类的活性，从而改变能量代谢。
[0012]本发明的实验结果显示，蛋白酶体抑制剂不仅通过抑制蛋白酶体活性进而干扰和影响细胞原有的功能，对肿瘤细胞生长有明显的抑制作用；实验结果表明，TM4在代谢性因素所致代谢性炎症过程中尤其在肥胖和2型糖尿病发生发展过程中具有关键作用；所述的TM4可进一步作为肥胖和2型糖尿病的预防和治疗的治疗靶点。
[0013]本发明提供了蛋白酶体抑制剂类化合物调控TM4的表达，产生抗炎与调节能量代谢的功能，应用所述蛋白酶体抑制剂MG132可使TM4上调、过表达USP19或抑制其降解能上调TM4，从而发挥抗炎、调节代谢的效应；进一步用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物的用途，所述的治疗慢性低度炎症性疾病的药物可用于肥胖、2型糖尿病、动脉粥样硬化等慢性代谢性炎症的防治。本发明并从体内、体外，基因剔除、过表达，动物、人群，等诸多方面验证了高脂-TM4-炎症-肥胖这一全新机制，具有较高的临床价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1蛋白酶体抑制剂MG132上调TM4表达。
[0015]图2a干扰USP 19后TM4下调，图2b过表达USP 19后TM4上调。
[0016]图3 TM4基因剔除小鼠模型及其鉴定(211、221为野生型，219、222为纯合子)。
[0017]图4左侧为TM剔除小鼠、右侧为野生型。
[0018]图5左侧为TM4剔除小鼠、右侧为野生型。
[0019]图6左侧为TM4剔除小鼠、右侧为野生型。
[0020]图7小鼠体重比较。
[0021]图8小鼠摄食量比较。
[0022]图9 口服糖耐量实验检测小鼠血糖。
[0023]图10酵母双杂交筛选相互作用蛋白及部分测序结果。
[0024]图11 Nur77蛋白表达纯化。
[0025]图12 pull down。
[0026]图13 siRNA干扰序列的筛选。
[0027]图14慢病毒干扰TM4表达及对下游靶蛋白的影响。
[0028]图15干扰TM4对下游TM4的影响。
[0029]图16 TM4 对 ΙΚΚ-b 的影响。
[0030]图17 RT-PCR 检测 ΙΚΚ-b。
[0031]图18过表达TM4可以下调Nur77及下游的IKK_b、NF_kB。
[0032]图19小鼠血压，
WT:wild typeKO:knock out 。
[0033]图20血管张力测定。
[0034]图21 TM4过表达使db/db小鼠的肥胖缓解。
[0035]图22 TM4过表达使db/db小鼠的高血压缓解。
[0036]图23 TM4过表达使db/db小鼠的高血糖缓解。
[0037]图24 TM4过表达使db/db小鼠的糖耐量改善。
[0038]图25 TM4的细胞定位。
[0039]图26 TM4基因在糖尿病猴和糖尿病患者的主动脉中表达下调。
[0040]图27高糖下调血管平滑肌细胞中TM4基因表达的剂量曲线。
[0041]图28 TM4在胰岛中主要表达于胰岛α细胞。
[0042]图29 ΤΜ4在a细胞(G9)高表达，在b细胞(INS-1)低表达。
[0043]图30高糖下调TM4在血管平滑肌细胞中的表达。
[0044]图31肥胖患者中筛查倒的L26F (c.76 C — T)杂合突变测序图。
[0045]图32肥胖患者中筛查倒的S128P (c.382 T — C)杂合突变测序图。
[0046]图33肥胖患者中筛查倒的P227S (c.679 C — T)杂合突变测序图。
[0047]图34是实施例1中的回收产物测序结果。
【具体实施方式】
[0048]实施例1克隆得到跨膜蛋白TM4基因
1.TM4基因的克隆
1)引物设计:
根据 TM4 基因信息(人 NM_001144072.1，小鼠 NM_026861)以及 pcDNA_GFPLentivector (CD511A-1, System B1sciences)载体,使用 01igo6.6 引物设计软件，设计引物如下:
TM4(人)-上游引物:5’ - G(保护碱基)GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACCGG -3’
TM4(人)-下游引物:5’ - CG(保护碱基)GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAG-3’TM4(小鼠)-上游引物:5’ -G(保护碱基)GAATTC (EcoRI) GCCACC(kozak)ATGTTCACCAGCACC-3’
TM4 (小鼠)-下游引物:5 ’ - CG (保护碱基)GGATCC (BamHI) TCAGTGCTGCAGCAGGAA-3，
2)引物合成:
Page级纯化，20D合成量；
2.PCR 扩增 TM4 cDNA
1)反应体系和条件
(1)PCR扩增体系如下表所示:
【权利要求】
1.蛋白酶体抑制剂在制备用于治疗慢性低度炎症性疾病药物中的用途。
2.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂包括MG132、MG341MG519和其相互作用蛋白Nur77、RNF-5和USP19。
3.按权利要求1的用途，其特征在于，所述的慢性低度炎症性疾病包括肥胖、2型糖尿病或动脉粥样硬化。
4.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的USP19降解抑制剂在用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。
5.按权利要求2的用途，其特征在于，所述的蛋白酶体抑制剂及其相互作用蛋白USP-19降解的抑制剂经四次穿膜蛋白(TM4)途径产生抗炎与调节能量代谢作用后，用于制备治疗慢性低度炎症性疾病的药物。
6.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白含有4个穿膜结构袢的基因，命名为4次穿膜(TM4)蛋白，该TM4为跨膜蛋白，定位在细胞膜及核膜上。
7.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4与Nu77相互作用，干扰TM4引起Nur77蛋白水平上调，且该调控作用不在转录水平。
8.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的Nur77上调使IKK_b表达增强。
9.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4过表达引起Nur77蛋白水平下调，IKK-b表达降低。
10.按权利要求5的用途，其特征在于，所述的TM4蛋白在制备筛查肥胖、高血压、高血糖患者制剂中的用途。
【文档编号】A61P3/04GK104174021SQ201310191848
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月22日 优先权日:2013年5月22日
【发明者】胡仁明, 王宣春, 冯哓铖, 陈立立, 黄頴, 李群, 李连喜, 叶魏魏, 叶宽萍, 叶子, 李因涛, 何敏 申请人:复旦大学附属华山医院