一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、用于连接单链可变区片段到细胞膜上的CD8α跨膜区、CD3ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3ζ胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有2A短肽。本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。
【专利说明】一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其涉及一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用。
【背景技术】
[0002]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR)由单克隆抗体的单链可变区片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv)和T细胞的信号区连接组成。嵌合抗原受体根据胞内的信号区数量可分为三代。第一代嵌合抗原受体胞内部分只含有一个CD3 ζ胞内信号区，因此，所修饰的免疫细胞不能有效激活而且作用时间较短。第二代嵌合抗原受体在CD3 ζ胞内信号区前增加了一个共刺激分子受体信号区，如CD28、4-1BB、0X40等，虽然临床表现比第一代嵌合抗原受体无论杀伤活性还是作用时间都有显著的改进，但仍不能满足临床的需要。在此基础上，胞内部分又增加一个共刺激分子信号区，即形成第三代嵌合抗原受体。但第三代嵌合抗原受体由于将三个信号分子线性串联起来，容易被低亲和力的非特异性抗原激活，甚至出现自我激活，从而发生非抗原特异性的激活而导致细胞毒副作用并引起机体的免疫排斥反应。
[0003]因此，现有技术还有待于改进和发展。
【发明内容】
[0004]鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，旨在解决现有嵌合抗原受体所存在的问题。
[0005]本发明的技术方案如下:
一种嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、来源于CDSa的跨膜区、CD3(胞内信号区，第一共刺激分子配体(CML-1)和第二共刺激分子配体(CML-2);所述CD3(胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一 2A短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二 2A短肽。
[0006]所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、Ig超家族分子或者细胞因子中的一种；
所述TNF类配体包括4_1BBL、0X40L、CD70、LIGHT和CD30L ;所述Ig超家族分子为CD80和 CD86 ;所述细胞因子包括 IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21 或 GM-CSF。
[0007]所述的嵌合抗原受体，其中，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为4-1BBL。
[0008]所述的嵌合抗原受体，其中，所述第一 2A短肽的氨基酸序列为EGRGSLLTCGDVEENPGP ;第二 2A 短肽的氨基酸序列为 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。
[0009]一种编码基因，其中，所述编码基因用于表达如上所述的嵌合抗原受体。
[0010]所述的编码基因，其中，用于编码第一 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.7所示；用于编码第二 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.8所示.一种如上所述编码基因的应用，其中，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。
[0011 ] 一种表达载体，其中，所述表达载体中装载有如上所述的编码基因。
[0012]所述的表达载体，其中，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、质粒等表达载体。所述质粒包括普通质粒和微环质粒。
[0013]有益效果:本发明所提供的嵌合抗原受体通过采用2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。因此，采用此嵌合抗原受体编码基因修饰的免疫细胞，在增强杀伤活性的同时也增强了与靶抗原结合的特异性。采用所述编码基因修饰的免疫细胞可用于肿瘤治疗，也可用于乙肝和其他慢性传染病治疗。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为本发明实施例2中构建携带有嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的示意图。
[0015]图2为本发明实施例2中携带嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的单/双酶切鉴定结果图。
[0016]图3为本发明实施例3中瞬时转染慢病毒载体的293T细胞中⑶3 ζ的表达检测结果图。
[0017]图4为本发明实施例4中经嵌合抗原受体基因修饰后的免疫细胞对靶细胞的杀伤活性检测结果图。
【具体实施方式】
[0018]本发明提供一种嵌合抗原受体、编码基因、表达载体及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0019]本发明所提供的一种嵌合抗原受体，携带有两个共刺激分子配体，并分别通过两个不同的2Α短肽将两个共刺激分子配体与所述嵌合抗原受体连接在同一载体上。所述共刺激分子配体可以为 4-1BBL、0X40L、CD70、LIGHT、CD30L、CD80、CD86、IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-11、IL-12、IL-15、IL-21或GM-CSF等。由于通过采用不同的2A短肽将嵌合抗原受体与两个共刺激分子配体连接，使其同时表达于免疫细胞的表面；而一旦与抗原特异性的结合，这两个共刺激分子配体则迅速迁移到细胞结合形成的突触部位，有效增强免疫细胞的活性。
[0020] 本发明中，以CD80和4-1BBL为例，提供一种新型嵌合抗原受体一Super-CAR，其结构为ScFv-⑶8 α -⑶3 ζ -2Α-⑶80-2A_4_lBBL。具体地，所述嵌合抗原受体是由单链可变区片段(Single Chain Variable Fragment, ScFv),用于连接 ScFv 到细胞膜上的 CD8 α 跨膜区，⑶3 ζ胞内信号区，第一共刺激分子配体⑶80和第二共刺激分子配体4-1BBL依次串联组成，其中，所述单链可变区片段主要包括Vh和'片段。其中，ScFv (CEA)的氨基酸序列依次包括信号前导区、CEA的Vh片段、Linker (GGGGS)3和'片段。所述⑶3 ζ胞内信号区与所述⑶80之间串联有第一 2Α短肽，所述⑶80与所述4-1BBL之间串联有第二 2Α短肽。2A-CD80-2A-4-1BBL基因的氨基酸序列依次包括Τ2Α片段(即第一 2Α短肽)、CD80片段、F2A片段(即第二 2A短肽)、4_1BBL片段。其氨基酸序列如下表1所示。
[0021]表1
【权利要求】
1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括依次串联的单链可变区片段、CDSd跨膜区、CD3(胞内信号区，第一共刺激分子配体和第二共刺激分子配体；所述CD3 ζ胞内信号区与所述第一共刺激分子配体之间串联有第一 2Α短肽，所述第一共刺激分子配体与所述第二共刺激分子配体之间串联有第二 2Α短肽。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一和第二共刺激分子配体分别为TNF类配体、Ig超家族分子或者细胞因子中的一种；所述TNF类配体包括4-1BBL、0X40L、CD70、LIGHT和CD30L ;所述Ig超家族分子为CD80和CD86 ;所述细胞因子包括IL-2、IL-3、IL-6、IL-7、IL-1U IL-12、IL-15、IL-21 或 GM-CSF0
3.根据权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，第一共刺激分子配体为CD80，第二共刺激分子配体为4-1BBL。
4.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述第一2A短肽的氨基酸序列为 EGRGSLLTCGDVEENPGP ;第二 2A 短肽的氨基酸序列为 APVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP。
5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因用于表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体。
6.根据权利要求5所述的编码基因，其特征在于，用于编码第一2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.7所示；用于编码第二 2A短肽的核苷酸序列如SEQ N0.8所示。
7.—种如权利要求5所述编码基因的应用，其特征在于，将所述编码基因用于修饰免疫细胞。
8.—种表达载体，其特征在于，所述表达载体中装载有如权利要求5所述的编码基因。
9.根据权利要求8所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒。
【文档编号】A61P35/00GK104177499SQ201310200787
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月27日 优先权日:2013年5月27日
【发明者】张鸿声 申请人:张鸿声