斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用。首次分别通过化学诱导和morpholino敲除两种途径获得了斑马鱼造血干细胞缺陷模型，其可作为筛药模型，应用于筛选可改善造血干细胞缺陷的药物。本发明的方法操作方便，成本低，实验结果可靠准确。
【专利说明】斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种CCCTC结合因子基因功能 缺失斑马鱼在造血缺陷方面的研究模型建立及应用。
【背景技术】
[0002] 斑马鱼作为一个脊椎动物造血模型，既优于其它的动物模型，又与哺乳类造血具 有高度保守性。斑马鱼造血系统的发生分为两波，原始造血和定向造血。原始造血产生一 过性细胞群，主要是红细胞和一些髓系细胞，而定向造血产生能自我更新的造血干细胞，这 些细胞生成所有造血系，包括淋巴细胞。在斑马鱼中，原始造血起源于两个胚外造血位点， 前部侧板中胚层和尾部侧板中胚层，继而形成中间细胞团。前部侧板中胚层是原始巨噬细 胞的初始位点，中间细胞团是多潜力血液祖细胞产生位点，主要产生红细胞和一些粒细胞。 24hpf (受精后时间（小时））循环开始后，一过性的红髓祖细胞在后部血岛形成。定向造血 出现于30hpf，这时造血干细胞在背部动脉内壁形成，这是一个类似于哺乳动物大血管-性 腺-中肾的区域。随后干细胞迁移至尾部造血组织，从那里移于肾脏和胸腺。造血干细胞 是唯一能产生髓红血小板和淋系的细胞，被认为维持成体造血，在成鱼的肾髓中。
[0003] CTCF(CCCTC-binding factor，CCCTC结合因子）是广泛存在于真核生物的多功能 转录因子。其N端11个锌指结构可以形成不同的组合，使CTCF调控多种靶基因的表达。基 于它的能力是结合大范围的不同序列，与特异的共调节蛋白通过不同锌指组合，ctcf起初 被描述为多价因子。这一特异的结构提供了第一个线索，暗示其区别于大部分锌指在基因 组调节中的功能。一系列的证据表明了 ctcf在不同细胞过程的关键作用。Ctcf纯合敲除 小鼠展现了早期胚胎着床前致死表型。母源性敲除卵母细胞中ctcf明显破坏了正常的进 行囊胚阶段。目前的研究谱系绘制了基因组范围的占据，分布谱式在多细胞类型，进一步强 化了概念，即细胞下游的影响是ctcf在基因组调控的结果。使用chip-seq，在人⑶4+T细 胞中发现了 20, 262个ctcf潜在的基因结合位点。然而，其对造血的影响还需要较好的模 型研究予以阐明并应用于医药研究。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供斑马鱼造血干细胞缺陷模型的建立及应用。
[0005] 在本发明的第一方面，提供CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼 造血干细胞缺陷模型的试剂。
[0006] 在一个优选例中，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所 示的寡核苷酸。
[0007] 在本发明的另一方面，提供一种CCCTC结合因子下调剂，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
[0008] 在本发明的另一方面，提供一种制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法，所述方 法包括：在斑马鱼中下调CCCTC结合因子的表达（包括使之不表达），从而获得斑马鱼造血 干细胞缺陷模型；较佳地，通过化学诱变、基因定点突变及morpholine敲除下调CCCTC结合 因子的表达。
[0009] 在一个优选例中，所述的制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法中，应用所述的 CCCTC结合因子下调剂来制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型。
[0010] 在本发明的另一方面，提供一种斑马鱼模型，其中CCCTC结合因子不表达或低表 达；如表达量仅为野生型正常斑马鱼的20%或更低。
[0011] 在本发明的另一方面，提供一种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物的方 法，所述方法包括：
[0012] (1)提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型（纯合体）胚胎；
[0013] ⑵按照受精后时间计算，从受精后5±0. 5小时起，用候选药物处理⑴的胚胎；
[0014] (3)药物处理后（较佳地为处理24-48小时后），检测斑马鱼胚胎中runxl和/或 cmyb的表达和定位；
[0015] 其中，若runxl和/或cmyb表达显著提高（如提高20% ;更佳地提高40% ;更佳地 提高60%)，则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。
[0016] 在一个优选例中，应用原位杂交技术检测runxl和/或cmyb的表达和定位。
[0017] 在另一优选两种，所述的筛选方法中，步骤（2)包括：在测试组中，从受精后 5±0. 5小时起，用候选药物处理（1)的胚胎；和/或
[0018] 步骤⑶包括：检测斑马鱼胚胎中runxl和/或cmyb的表达和定位，并与对照组 比较，其中所述的对照组是不用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼CCCTC结合因子 突变型（纯合体）胚胎；
[0019] 若与对照组相比，测试组runxl和/或cmyb表达显著提高（如提高20% ;更佳地 提高40% ;更佳地提高60%或更高），则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在 药物。
[0020] 在另一优选例中，所述对照组仅包括候选药物的溶剂；较佳地，所述的溶剂是 DMSO。
[0021] 在另一优选例中，所述的筛选方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的细胞 实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗造血干细胞缺陷疾病有 用的物质。
[0022] 在另一优选例中，所述的筛选方法中，所述的候选药物包括（但不限于）：小分子 化合物、肽。
[0023] 在本发明的另一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗造血干细胞 缺陷疾病的药物组合物中的用途，所述化合物选自：
[0024]
【权利要求】
1. CCCTC结合因子下调剂的用途，用于制备构建斑马鱼造血干细胞缺陷模型的试剂。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的CCCTC结合因子下调剂是核苷酸序列 如SEQ ID NO: 1所示的寡核苷酸。
3. -种CCCTC结合因子下调剂，其特征在于，其是核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示的寡 核苷酸。
4. 一种制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型的方法，其特征在于，所述方法包括：在斑马 鱼中下调CCCTC结合因子的表达，从而获得斑马鱼造血干细胞缺陷模型；较佳地，通过化学 诱变、基因定点突变及morpholine敲除下调CCCTC结合因子的表达。
5. 如权利要求4所述的方法，其特征在于，应用权利要求3所述的CCCTC结合因子下调 剂来制备斑马鱼造血干细胞缺陷模型。
6. -种筛选治疗造血干细胞缺陷疾病的潜在药物的方法，其特征在于，所述方法包 括： (1) 提供斑马鱼CCCTC结合因子突变型胚胎； (2) 按照受精后时间计算，从受精后5±0. 5小时起，用候选药物处理（1)的胚胎； (3) 药物处理后，检测斑马鱼胚胎中runxl和/或cmyb的表达和定位； 其中，若runxl和/或cmyb表达显著提高,则所述的候选药物是治疗造血干细胞缺陷 疾病的潜在药物。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（2)包括：在测试组中，从受精后 5±0. 5小时起，用候选药物处理（1)的胚胎；和/或 步骤（3)包括：检测斑马鱼胚胎中runxl和/或cmyb的表达和定位，并与对照组比较， 其中所述的对照组是不用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼CCCTC结合因子突变型 胚胎； 若与对照组相比，测试组runxl和/或cmyb表达显著提高，则所述的候选药物是治疗 造血干细胞缺陷疾病的潜在药物。
8. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行 进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗造血干细 胞缺陷疾病有用的物质。
9. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的候选药物包括：小分子化合物、肽。
10. 化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗造血干细胞缺陷疾病的药物组合物中的 用途，所述化合物选自：
【文档编号】A61P7/06GK104278026SQ201310293787
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】周勇, 井长斌, 邓敏, 陈漪 申请人:中国科学院上海生命科学研究院