扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用。首次构建了一种模拟人类扩张型先天性心肌病(Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)的疾病模型，所述的疾病模型可作为筛药模型，应用于筛选可改善CDCM所致心力衰竭症状药物。本发明的方法是一种经济快捷的高内涵筛选方法，得到的化合物具较高的特异性和成药性。
【专利说明】扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于医药【技术领域】，更具体地，本发明涉及一种肌小节缺陷致扩张型心肌 病的斑马鱼模型的建立及其应用。
【背景技术】
[0002] 扩张型先天性心肌病（Congenital Dilated CardioMyopathy，CDCM)是一类主要 的先天心肌病，临床表现为左心室或者双侧心室扩张，伴随正性肌力下降。儿童预后五年内 致死率达80%，幸存者也会患有后遗疾病或需心脏移植。成人中先天性基因变异所致DCM外 显率在40岁后达95%，死亡率仍然很高（发病后平均存活时间男性1. 7年，女性3. 2年）， 其致残致畸率在各种疾病及综合征内也居于首位。
[0003] 心肌细胞肌小节缺陷是⑶CM主要的发病原因之一。Titin(TTN)是组装肌小节和 纹状肌的必要蛋白，提供正性肌力，调节收缩压。TTN蛋白是人类蛋白组中最大的一个，它 含有大约33,000个氨基酸，是含量第三大的纹状肌蛋白。生理状态下，两个TTN分子结合 形成大约2 μ m宽的肌小节，锚定于Z-Iine和M-line。2012年发表于新英格兰医学杂志的 研究报道了在312例扩张型心肌病（Dilated CardioMyopathy，DCM)中发现72例发生TTN 突变，并显示TTN截短型突变是遗传性DCM极其重要的病因，其在家族性扩张型心肌病家族 发病率约占25%，散发病例约为18%。TTN基因在转录过程中可以进行可变剪切，产生不同的 转录本，其中含有N2B结构域的转录本是在心肌细胞中特异表达的，可见N2B结构域在心肌 的正常发育和病理发生发挥一定的作用。明确TTN功能变异有助于提高对DCM病理生理认 识，从而帮助DCM患者能够得到早期诊断、干预和治疗。
[0004] 目前，对于DCM的病理和治疗研究由于缺乏合适的动物模型而进展缓慢。尽管国 际上有部分用于心衰研究的小鼠模型，但主要集中于beta-肾上腺素受体活性调控方面， 无法模拟先天性心肌肌力缺陷这一主要心肌病的表征。
[0005] 因此，本领域亟待开发一种用于DCM研究的动物模型，以便深入探讨新的治疗方 案，在一定程度上替代心脏移植或提高预后生存率。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供扩张型心肌病斑马鱼疾病模型的建立与应用。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物的 方法，所述方法包括：
[0008] (1)提供斑马鱼titin-/-突变型胚胎；
[0009] (2)按照受精后时间计算，从受精后20±2小时开始用候选药物处理（1)的胚胎； [0010] ⑶至胚胎受精后32±2小时，48±2小时，分别观测斑马鱼胚胎的表型；
[0011] 其中，若胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选药物是治 疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；或
[0012] 若胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒张、收缩能力显著 加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治疗扩张型心肌病或 心力衰竭的潜在药物。
[0013] 在一个优选例中，所述的方法中，步骤（2)包括：在测试组中，从受精后20±2小时 开始用候选药物处理（1)的胚胎；和/或
[0014] 步骤（3)包括：观测斑马鱼胚胎的表型，并与对照组比较，其中所述的对照组是不 用所述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼titin-/-突变型胚胎；
[0015] 若与对照组相比，测试组胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述 的候选药物是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；或
[0016] 若与对照组相比，测试组胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早 期舒张、收缩能力显著加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物 是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物。
[0017] 在另一优选例中，所述的心脏博动频率显著增加是：与对照组相比，测试组胚胎心 脏的博动次数显著增加，如增加至每分钟高于140次；较佳地高于150次；或
[0018] 所述的心包肿大程度显著缓解是：与对照组相比，测试组胚胎心外膜扩大程度显 著降低；或
[0019] 所述的血液循环显著改善是：与对照组相比，测试组胚胎有血液循环。
[0020] 在另一优选例中，所述的候选药物包括（但不限于）：小分子化合物、肽。
[0021] 在另一优选例中，所述对照组仅包括候选药物的溶剂；较佳地，所述的溶剂是 DMSO ;和/或还设置阳性药对照组；较佳地，所述的阳性药对照为药物Digitoxin。
[0022] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在药物进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗扩张型心肌病或心力衰竭有 用的物质。
[0023] 在另一优选例中，所述的扩张型心肌病是扩张型先天性心肌病。
[0024] 在本发明的另一方面，提供一种用于筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药 物的筛选模型，所述的筛选模型是斑马鱼titin-/-突变型胚胎，其是由斑马鱼titin+/-突 变型杂合子交配产生的后代。
[0025] 在本发明的另一方面，提供所述的筛选模型的用途，用于筛选治疗扩张型心肌病 或心力衰竭的潜在药物。
[0026] 在本发明的另一方面，提供化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗扩张型心肌 病或心力衰竭的药物组合物中的用途，所述化合物选自：
[0027]
【权利要求】
1. 一种筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物的方法，其特征在于，所述方法 包括： (1) 提供斑马鱼titin-/-突变型胚胎； (2) 按照受精后时间计算，从受精后20±2小时开始用候选药物处理（1)的胚胎； (3) 至胚胎受精后32±2小时，48±2小时，分别观测斑马鱼胚胎的表型； 其中，若胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候选药物是治疗扩 张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；或 若胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒张、收缩能力显著加强 或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治疗扩张型心肌病或心力 衰竭的潜在药物。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)包括：在测试组中，从受精后20±2 小时开始用候选药物处理（1)的胚胎；和/或 步骤（3)包括：观测斑马鱼胚胎的表型，并与对照组比较，其中所述的对照组是不用所 述候选药物处理的、同步发育的斑马鱼titin-/-突变型胚胎； 若与对照组相比，测试组胚胎受精后48±2小时心脏博动频率显著增加，则所述的候 选药物是治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物；或 若与对照组相比，测试组胚胎受精后32±2小时，心包肿大程度显著缓解，心脏早期舒 张、收缩能力显著加强或心脏缩小程度降低或血液循环显著改善，则所述的候选药物是治 疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的心脏博动频率显著增加是：与对 照组相比，测试组胚胎心脏的博动次数显著增加，如增加至每分钟高于140次；较佳地高于 150次；或 所述的心包肿大程度显著缓解是：与对照组相比，测试组胚胎心外膜扩大程度显著降 低；或 所述的血液循环显著改善是：与对照组相比，测试组胚胎有血液循环。
4. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的候选药物包括（但不限于）：小 分子化合物、肽。
5. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述对照组仅包括候选药物的溶剂；较 佳地，所述的溶剂是DMSO;和/或 还设置阳性药对照组；较佳地，所述的阳性药对照为药物Digitoxin。
6. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括：对获得的潜在药物 进行进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选药物中进一步选择和确定对于治疗扩张 型心肌病或心力衰竭有用的物质。
7. -种用于筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在药物的筛选模型，其特征在于， 所述的筛选模型是斑马鱼titin-/-突变型胚胎，其是由斑马鱼titin+/_突变型杂合子交 配产生的后代。
8. 权利要求7所述的筛选模型的用途，用于筛选治疗扩张型心肌病或心力衰竭的潜在 药物。
9. 化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗扩张型心肌病或心力衰竭的药物组合物 中的用途，所述化合物选自：
【文档编号】A61K31/519GK104274464SQ201310294525
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年7月12日 优先权日:2013年7月12日
【发明者】周勇, 高磊, 邓敏, 陈漪 申请人:中国科学院上海生命科学研究院