一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物医用材料制备领域，特别涉及一种鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，经过前处理、酸溶、盐析、透析纯化、超滤膜浓缩、除菌、除热源和冻干得到医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵。本发明使用了成本低廉、且更加安全的鱼皮作为胶原蛋白海绵的来源，不需要经过交联的步骤就能得到高纯度、低灰分的医用胶原蛋白海绵。
【专利说明】一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医用材料制备领域，特别涉及一种鱼皮胶原蛋白海绵的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 胶原蛋白广泛存在于从低等脊椎动物的体表面到哺乳动物机体的一切组织之中。 鱼类的胶原主要存在于鳞和皮之中。胶原是一类特殊的蛋白质，是三螺旋结构，不同的三股 肽链可以组成27种不同的胶原类型。不同的胶原类型具有不同的功能特性。
[0003] 胶原蛋白具有低抗原性、可生物降解性、生物相容性、促进血小板凝聚等生物学特 性，是非常重要的天然生物材料，主要医学应用包括注射型胶原蛋白、胶原蛋白膜、胶原纤 维、胶原蛋白管及各类胶原蛋白复合材料。其中胶原蛋白海绵被应用于外科止血，口腔再吸 收性敷料，组织填充，细胞培养材料，组织工程支架等方面。
[0004] 目前市场上的胶原蛋白海绵多来源于陆生动物的皮、骨等。由于日益严重的安全 问题，如疯牛病、口蹄疫等，威胁着陆生来源产品的安全性。鱼皮中含有大量的胶原蛋白，是 制备胶原蛋白海绵的优质原料，且具有更高的安全性和更低廉的成本。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是：提供一种以鱼皮为原料，制备无菌无热源胶原蛋白 海绵的方法。
[0006] 本发明提供了一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，步骤如下：
[0007] (1)去除鱼皮上的鱼肉及脂肪，用10-50倍鱼皮重量的清水清洗2次，将洗净的鱼 皮剪碎成〇. 5?5cm2的小块；
[0008] (2)用10-50倍鱼皮重量的1%?10%NaCl溶液搅拌下漂洗鱼皮32h?48h，每8h? 12h更换一次NaCl溶液；
[0009] (3)用10-50倍鱼皮重量的去离子水漂洗4次，每次0. 5?Ih ;
[0010] (4)用10-50倍鱼皮重量的0. lmol/L NaOH溶液搅拌下漂洗32h?48h，每8h? 12h换一次NaOH溶液；
[0011] (5)用10-50倍鱼皮重量的去离子水漂洗4次，每次0· 5?lh，至pH6?7 ;
[0012] (6)将经前述步骤（1)- (5)处理后得到的鱼皮置于0· 3?I. Omol/L的稀酸缓冲 液中溶胀，搅拌4h?12h后离心，取上清液，得到鱼皮粗胶原提取液；
[0013] (7)鱼皮粗胶原提取液经5 μ m滤膜过滤，加入饱和NaCl或（NH4)2SO4溶液盐析，蛋 白析出；静置数小时后(TC?KTC离心，转速8000-10000rpm，得到胶原沉淀；
[0014] (8)将胶原沉淀重新溶解于3-5倍鱼皮重量的纯水中，以5-20倍鱼皮重量的纯水 为透析外液，半透膜截流分子量lOOKDa，对胶原蛋白进行透析纯化；
[0015] (9)取纯化胶原液用30KD?50KD分子量的超滤膜浓缩，至胶液中蛋白浓度达到 1% ?4% ;
[0016] (10)浓缩后的胶液用0. 22μπι?0.45μπι板式膜进行除菌，然后加入0. 1%?5% (w/v)药用活性炭搅拌后过滤，以去除热源；
[0017] (11)胶液置于_60°C低温冷冻干燥机冻干，得到胶原蛋白海绵。
[0018] 所述的稀酸可以是盐酸、醋酸或柠檬酸。
[0019] 所述的胶原蛋白海绵制备工艺中，步骤（1)- (10)均在0°C?KTC条件下进行。
[0020] 本发明的有益效果：使用了成本低廉、且更加安全的鱼皮作为胶原蛋白海绵的来 源，经过前处理、酸溶、盐析、透析纯化、超滤膜浓缩、除菌、除热源和冻干，不需要经过交联 的步骤就能得到高质量的医用胶原蛋白海绵。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1
[0022] 称取200g新鲜罗非鱼皮，剪成0. 5cmX0. 5cm小片状，4°C条件下，5%NaCl溶液搅拌 漂洗（l:30w/w)48h，每12h换一次NaCl溶液，过滤去除滤液；去离子水（l:30w/ w)漂洗原 料4次，每次Ih ;4°C条件下，滤干的鱼皮中加入0. IM NaOH溶液搅拌漂洗（l:30w/w)48h，每 12h换一次NaOH溶液，过滤去除滤液；再以去离子水（1:30w/w)漂洗原料4次，每次lh，至 漂洗液pH为6?7 ;
[0023] 4°C下，将经前处理的原料置于0. 5mol/L醋酸溶液（l:30w/W)中溶胀，搅拌4h，在 (TC?KTC下、转速8000?IOOOOrpm离心，取上清液，得到鱼皮粗胶原提取液；
[0024] 4°C条件下，料液经5 μ m膜过滤，再加入饱和NaCl溶液盐析，直至NaCl终浓度4%， 蛋白析出；静置数小时后，在〇°C?KTC下、转速8000?IOOOOrpm离心，获得胶原沉淀；
[0025] 将胶原沉淀重新溶解于纯水中，以纯水（1:20w/w)为透析外液，半透膜截流分子量 lOOKDa，4°C透析72小时，每12小时更换一次透析外液；
[0026] 取纯化胶原液在4°C条件下用50KDa的膜浓缩，至胶液中蛋白浓度达到2% ;
[0027] 浓缩好的胶液经0. 22 μ m板式膜过滤进行除菌；
[0028] 加入1% (w/v)椰壳活性炭搅拌后过滤，去除热源；
[0029] _60°C低温冷冻干燥机冷冻干燥72小时，得到医用胶原海绵。
[0030] 实施例2
[0031] 称取200g新鲜草鱼皮，剪成IcmX Icm小片状，4°C条件下，5%NaCl溶液搅拌漂洗 (l:30w/w)48h，每12h换一次NaCl溶液，过滤去除滤液；去离子水（l:30w/ w)漂洗原料4 次，每次Ih ;
[0032] 4°C条件下，滤干的鱼皮中加入0. IM NaOH溶液搅拌漂洗（l:30w/w)48h，每12h换 一次NaOH溶液，过滤去除滤液；再以去离子水（1:30w/w)漂洗原料4次，每次lh，至漂洗液 pH为6?7 ;
[0033] 4°C下，将经前处理的原料置于0. lmol/L盐酸溶液（l:30w/w)中溶胀，搅拌4h，在 (TC?KTC下、转速8000?IOOOOrpm离心，取上清液，得到鱼皮粗胶原提取液；
[0034] 4°C条件下，料液经5 μ m膜过滤，再加入饱和NaCl溶液盐析，直至NaCl终浓度4%， 蛋白析出；静置数小时后，在〇°C?KTC下、转速8000?IOOOOrpm离心，获得胶原沉淀；
[0035] 将胶原沉淀重新溶解于纯水中，以纯水（1:20w/w)为透析外液，半透膜截流分子量 lOOKDa，4°C透析72小时，每12小时更换一次透析外液；
[0036] 取纯化胶原液在4°C条件下用30KDa的膜浓缩，至胶液中蛋白浓度达到3% ;
[0037] 浓缩好的胶液经0. 22 μ m板式膜过滤进行除菌；
[0038] 加入1% (w/v)椰壳活性炭搅拌后过滤，去除热源；
[0039] _60°C低温冷冻干燥机冷冻干燥72小时，得到医用胶原海绵。
[0040] 实施例3
[0041] 表1 :本发明的胶原蛋白海绵与现有产品质量比较
[0042]
【权利要求】
1. 一种医用无菌无热源鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于步骤如下： (1) 去除鱼皮上的鱼肉及脂肪，用10-50倍鱼皮重量的清水清洗2次，将洗净的鱼皮剪 碎成0. 5?5cm2的小块； (2) 用10-50倍鱼皮重量的1%?10%NaCl溶液搅拌下漂洗鱼皮32h?48h，每8h? 12h更换一次NaCl溶液； (3) 用10-50倍鱼皮重量的去离子水漂洗4次，每次0. 5?lh ; (4) 用10-50倍鱼皮重量的0. lmol/L NaOH溶液搅拌下漂洗32h?48h，每8h?12h 换一次NaOH溶液； (5) 用10-50倍鱼皮重量的去离子水漂洗4次，每次0. 5?lh，至pH6?7 ; (6) 将经前述步骤（1)?（5)处理后得到的鱼皮置于0. 3?1. Omol/L的稀酸缓冲液中 溶胀，搅拌4h?12h后离心，取上清液，得到鱼皮粗胶原提取液； (7 )鱼皮粗胶原提取液经5 y m滤膜过滤，加入饱和NaCl或（NH4) 2S04溶液盐析，蛋白析 出；静置数小时后离心，得到胶原沉淀； (8) 将胶原沉淀重新溶解于3-5倍鱼皮重量的纯水中，以5-20倍鱼皮重量的纯水为透 析外液，半透膜截流分子量l〇〇KDa，对胶原蛋白进行透析纯化； (9) 取纯化胶原液用30KD?50KD分子量的超滤膜浓缩，至胶液中蛋白浓度达到1%? 4% ； (10) 浓缩后的胶液用0. 22 y m?0. 45 y m板式膜进行除菌，然后加入0. 1%?5% (w/ v)药用活性炭搅拌后过滤，以去除热源； (11) 胶液置于_60°C低温冷冻干燥机冻干，得到胶原蛋白海绵。
2. 如权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述稀酸为盐酸、 醋酸或柠檬酸。
3. 如权利要求1所述的鱼皮胶原蛋白海绵的制备方法，其特征在于所述步骤（1)? (10)均在0°C?10°C条件下进行。
【文档编号】A61L27/24GK104338175SQ201310333125
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2013年8月1日 优先权日:2013年8月1日
【发明者】顾其胜, 辛春华, 王南平, 王知华, 金强 申请人:上海华睿生物科技有限公司