一种斑马鱼体内ros检测模型的建立方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种斑马鱼体内ROS检测模型的建立方法，同时提供一种利用该模型筛选抗氧化药物的方法。模型的构建方法主要包括：斑马鱼的发育阶段的确定，检测用斑马鱼数量的确定，阳性对照化合物GSH的浓度确定微孔板分析，统计学分析几个步骤。应用斑马鱼体内ROS检测模型进行抗氧化药物的筛选具有可靠、快速、高效、经济、高通量等优点，可实现体内高通量筛选抗氧化药物。本发明对抗氧化药物的开发有着重要的意义。
【专利说明】一种斑马鱼体内ROS检测模型的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种药物筛选模型，具体的说，涉及一种简单、快速和高效的抗氧化药物筛选的斑马鱼体内ROS检测模型的建立方法及其应用。
【背景技术】
[0002]活性氧簇(reactive oxygen species, R0S)是生物体内影响信号传导的重要物质，包括:02_.,H2O2及HO2.、.0H等，与许多衰老相关疾病的发生、发展预防和治疗相关，如心血管疾病、老年痴呆、肿瘤、糖尿病等。大量人群和实验研究表明，采用有效的预防手段，特别是合理服用抗氧化剂或自由基清除剂，均可有效控制这些疾病的发生，发挥良好的预防作用[1]。
[0003]目前，抗氧化药物筛选模型常为分子与细胞水平的筛选模型，这些体外抗氧化药物筛选模型，都不涉及 药物在生物体内的吸收分布代谢情况，所以都不能准确地预测药物的体内抗氧化能力[2_3]。此外，一些体内的抗氧化筛选模型，由于检测方法复杂，检测指标较多，实验费用高等不利因素，未能广泛应用于抗氧化药物的筛选[4_5]。所以，开发一种简单、快速的体内抗氧化药物筛选模型意义重大。
[0004]斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[6]。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点[6_7]:①饲养成本低，性成熟周期短繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200?300枚卵；③生长发育速度快，在受精24h后，斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有1-4 _，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；⑦给药方式简单:溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的疾病模型研究材料。
[0005]5- (and-6)-carboxy-2 ' , I ' -dichiorodihydrofluorescein diacetate(carboxy-H2DCFDA)是一种常用的ROS特异性荧光检测试剂，无荧光Carboxy-H2DCFDA通过与斑马鱼体内的ROS反应，生成荧光活性的2' ,T -dichlorofluorescein (DCF);使用酶标仪定量检测DCF的荧光信号，从而相对定量测定生物体内ROS的量[8]。
[0006]本发明提供的斑马鱼ROS检测模型有利于简单、高效、快速筛选抗氧化药物，对抗衰老和预防衰老相关疾病有着重要意义。与以往的模型相比，本发明具有如下优点:
I)活体内一实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。[0007]2)高通量一斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析和实验周期短，使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物致敏性评价的理想模型。
[0008]3)经济一所需费用低，以猴子为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以小鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于I美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。
[0009]4)化合物用量少一检测化合物用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的化合物。
[0010]5)简便一实验过程操作简单，斑马鱼经化合物处理可定量分析化合物抗氧化活性，而传统动物实验操作过程复杂，判断指标主观，容易产生假阳性结果。
[0011]6)快速一实验周期短，可在I小时内完 成。斑马鱼在第一个72小时以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48小时内快速成型，传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月方可完成胚胎发育。
[0012]7)可靠的预测性一斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85%左右，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好。
[0013]8)敏感性高一Carboxy-H2DCFDA能与ROS特异性的反应，可以快速检测斑马鱼体内的ROS水平。
[0014]9)稳定性高、重复性好一本发明重复实验十几次，所获实验结果基本相同。
[0015]本发明应用价值
应用斑马鱼体内ROS检测模型进行抗氧化药物的筛选具有可靠、快速、高效、经济、高通量等优点，可实现体内高通量筛选抗氧化药物。本发明对抗氧化药物的开发有着重要的意义。
[0016]试剂及仪器
carboxy-H2DCFDA(C400, Invitrogen)、多功能微孔板分析仪(Mithras LB940, BerthoIdTechno1gies)>96 孔板(Nest Biotech)。
【发明内容】
[0017]本发明的目的在于提供一种斑马鱼体内ROS检测模型的建立方法，同时提供一种利用该模型筛选抗氧化药物的方法。本发明提供的方法具有可靠、快速、经济、高效、高通量等优点。
[0018]内容一:本发明提供一种斑马鱼体内ROS检测模型的建立方法，设计方案为:
I斑马鱼选取
取4?5对斑马鱼亲本交配，按照Westerf ield[9]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。
[0019]2斑马鱼体内ROS检测模型建立条件的确定
(I)斑马鱼的发育阶段的确定。
[0020](2)检测用斑马鱼数量的确定。
[0021](3)阳性对照化合物谷胱甘肽(GSH)的浓度确定。[0022]本发明的实施例一中，对上述的建模条件进行确定。其中，斑马鱼的发育阶段为3dpf,检测用斑马鱼数量为I尾，GSH浓度为100 μ M0
[0023]内容二:本发明提供一种利用斑马鱼体内ROS检测模型筛选抗氧化药物的方法，设计方案为:
I斑马鱼选取
取4?5对斑马鱼亲本交配，按照Westerf ield[9]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常的斑马鱼移入6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。
[0024]2化合物处理
化合物初筛浓度为30 μ M ;检测试剂对照组(Control)为不含斑马鱼的反应液；以Carboxy-H2DCFDA处理的斑马鱼作为模型组(Model )，以100 μ M GSH处理模型组斑马鱼作为阳性对照组；实验在96孔板中进行，每孔I尾斑马鱼，100 μ I反应液，每个实验组处理6个孔。
[0025]3酶标仪分析:
各实验组28 V反应I小时，反应结束后，使用多功能微孔分析仪检测各实验组的荧光值。ROS清除率公式如下:
【权利要求】
1.一种斑马鱼体内ROS检测模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:(1)斑马鱼的发育阶段的确定；(2)检测用斑马鱼数量的确定；(3)阳性对照化合物谷胱甘肽(GSH)的浓度确定。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:(4)微孔板分析。
3.如权利要求1所述的建立方法，其特征在于:优选的，步骤(I)中斑马鱼的发育阶段为受精后3天(3 dpf)斑马鱼；优选的，步骤(2)中检测用斑马鱼数量为I尾斑马鱼；优选的，步骤(3)中阳性对照化合物谷胱甘肽(GSH)的浓度为100 μ M ;优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8 mg/L、水温为28°C、pH为7.2-7.6、总硬度为200_250mg/L。
4.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于:优选的，步骤(4)微孔板分析具体步骤为:将斑马鱼放入96孔板，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光值。
5.权利要 求1-4所述构建方法得到的斑马鱼体内ROS检测模型用于抗氧化药物筛选的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于:还包括以下步骤:设置多个实验组:8个化合物处理组，I个对照组，I个模型组，I个阳性对照组；化合物以溶解的方式给药；所有的实验组含有相同的反应液(5 μ g/ml的Carboxy-H2DCFDA);于28<€恒温培养箱中培养I小时；使用多功能酶标仪检测各实验组的荧光值；统计学处理结果以I 土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ S T-检验进行统计学处理，p<0.05为差异性显著。
【文档编号】A61K49/00GK103430890SQ201310398791
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年9月5日 优先权日:2013年9月5日
【发明者】劳乔聪, 李春启, 朱凤, 俞航萍 申请人:杭州环特生物科技有限公司