非小细胞肺癌中miR-143基因的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种非小细胞肺癌中miR-143基因的应用。在H1299细胞系中miR-143阻滞细胞G1期到S期的转换，抑制细胞的增殖。MiR-143通过与靶基因mRNA的3′-UTR的相互作用，抑制靶基因mRNA的翻译或者降解靶基因的mRNA，下调靶基因的表达。本发明通过软件预测与载体构建，在HEK293T细胞中使用双荧光素酶报告系统，初步证实了ATG2B，是miR-143的靶基因。靶基因ATG2B是一个与癌症发生相关的基因，在非小细胞肺癌细胞株中显著上调。在H1299细胞株中过表达miR-143，ATG2B的mRNA表达显著下调。首次证实了在非小细胞肺癌细胞中ATG2B是miR-143的靶基因。该发明为利用miRNA在临床诊断与治疗非小细胞肺癌，及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
【专利说明】非小细胞肺癌中miR-143基因的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种非小细胞肺癌中miR-143基因的应用。
【背景技术】
[0002]miRNA是天然存在于体内的21_22nt的非编码RNA分子，是一类通过转录后基因沉默对靶基因表达进行调节的RNA。据估计，生物体内约有1/3的基因受miRNA的调控。MiRNA与RISC的复合体通过碱基配对可与靶基因mRNA 5' -UTR或者3' - UTR中的互补序列相结合，抑制蛋白质翻译，或是引发mRNA降解，从而负调控靶基因的表达。
[0003]肺癌是死亡率最高的癌症，每年死于肺癌的人数超过100万，并且每年新增病例120万。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是最常见的癌症,其中约80%的肺癌是非小细胞肺癌(non small cell lung cancer, NSCLC),其5年存活率仅为15%,缺乏有效的针对肺癌的早期诊断和治疗手段是低5年存活率的主要原因。在癌症的发生中，经常出现miRNA群失调的现象。几种癌症包括胃癌，乳腺癌，肺癌，结肠癌等已经报道多种表达异常的miRNA种类。检测miRNA的表达水平可以为癌症的临床诊断提供参考。而miRNA的异常表达直接导致一些与癌症发生相关基因的表达异常，诱发癌症的发生。已有报道证明miRNA可以通过调控靶基因mRNA的表达，在肺癌发生、发展及转移中发挥重要作用。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的肺癌早期诊断和癌症进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗肺癌等疾病。寻找和鉴定与肺癌发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基 础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一在于提供一种miR-143基因在制备抑制非小细胞肺癌细胞增殖药物中的应用。
[0005]本发明的目的之二在于提供一种miR-143基因在制备阻滞非小细胞肺癌细胞细胞周期转换中药物的应用。
[0006]本发明的目的之三在于提供一种miR-143基因在制备下调JTi1 现表达水平药物中的应用。
[0007]本发明据Solexa测序结果，在小鼠肺癌模型中miR-143显著下调，及利用qRT-PCR技术检测多种非小细胞肺癌系中miR-143的表达量变化，并从中选择一种miR-143表达显著下调的非小细胞肺癌系，在此细胞系中过表达miR-143以检测其功能。
[0008]一采用生工生物公司的Trizol试剂提取的细胞总RNA，进行反转录，检测miR-143在非小细胞肺癌细胞株中的表达。研究发现与正常的肺上皮细胞相比，miR-143在非小细胞肺癌中显著降低。
[0009]二利用CCK8试剂盒检测过表达miR-143后H1299细胞的增殖，结果在用miR-143的mimics转染细胞后，与对照组相比，H1299细胞增殖减缓。
[0010]三过表达miR-143后的H1299细胞用PI染色后，用流式细胞仪进行细胞周期分析。发现与对照相比，miR-143过表达的H1299细胞明显被阻滞在G1/G0期。
[0011]四将从Targetscan软件预测miR-143的靶基因JTi?现的3 ^ -UTR连接至pGL_3载体，然后将miR-143 mimics与重组质粒共转入HEK-293T细胞，48 h后进行双萤光实验。结果,转入miR-143 mimics与重组载体的细胞中的萤火虫萤光素酶的活性比对照组显著下降，表明miR-143 mimic通过47；?现的3' -UTR抑制萤火虫萤光素酶的活性。
[0012]五在H1299细胞中过表达miR-143，检测JTi?现mRNA水平变化。在H1299细胞中转入真核表达载体PEGFP-Cl构建的miR-143表达载体pEGFP-miR-143，与转入pEGFP-Cl空载的H1299细胞相比，JTi’现的mRNA表达水平下调约30%。
[0013]H1299细胞系中miR-143基因影响细胞的增殖，细胞周期，在非小细胞肺癌的发生起重要的作用。是一个细胞自吞噬相关的蛋白，与癌症的发生密切相关。miR-143通过与其靶基因JTG2B的mRNA的3' -UTR互补，抑制靶基因mRNA的翻译或直接降解靶mRNA。本实验通过软件预测、构建载体，然后在HEK293T细胞中利用荧光素酶报告基因分析验证了是miR-143的靶基因，并在H1299细胞中利用qRT-PCR技术，进一步验证了该发现。所公开的为在H1299细胞系中是miR-143的靶基因的首次报道，该发明在临床上为利用miRNA来诊断和治疗非小细胞肺癌，以及提供药物靶点方面提供了一定的应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1非小细 胞肺癌细胞系中miR-143的相对表达含量；
图2过表达miR-143后抑制H1299细胞的增殖；
图3过表达miR-143后，H1299细胞被阻滞在G1/G0期。
[0015]图4是miR-143的靶基因，其中A为miR-143在不同物种之间的保守结合位点；B为miR-143与靶基因JTiOW的结合位点；C为miR-143与靶基因JTiOW 3' UTG的双荧光酶报告实验分析柱状图。
[0016]图5过表达miR-143后，ATG2B的mRNA水平显著下调。
【具体实施方式】
[0017]下面将结合具体实例进一步阐述本发明。这些实例仅用于阐述本发明，而不用于限制本发明的范围。以下实例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed.)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0018]实施例一:根据Solexa测序结果，确定miR-143在非小细胞肺癌细胞系中低表达 本发明所用到的小鼠良性肺肿瘤模型(L822T1)和k-ras基因突变小鼠肺癌模型
(L930T1)由中科院生化细胞所季宏斌教授课题组提供。
[0019]将小鼠良性肺肿瘤和k-ras基因突变小鼠肺癌的肺组织取样，用TRIZOL法裂解组织，加入氯仿，待蛋白与核酸分层，离心之后吸取上清并加入等体积异丙醇沉淀，再次离心后以70%乙醇洗涤沉淀，晾干，获得总RNA。利用TaKaRa公司的反转录试剂盒构建两种组织的cDNA文库，根据试剂盒的说明进行反转录。
[0020]将反转录后的样品利用Solexa方法测序(Solexa测序由华大基因公司完成)，其中miR-143下调24%。进一步研究发现在非小细胞肺癌细胞系中miR-143的表达显著下调(参见图1)。
[0021]反转录PCR 米用 Takara 公司 One Step PrimeScript miRNA cDNA SynthesisKU。用来检测的仪器为Bio-Rad公司的iQ5系统，试剂为TaKaRa公司的SYBR Green Mix。这种试剂里面含有Taq DNA聚合酶，dNTP mix, SYBR Green dyet)U6用来作为内参基因。本实验所用到的引物为:miR-143 引物 Forward:5' - TGAGATGAAGCACTGTAGCTC-3' ,Reverse:为 Un1-miR qPCR primer ;U6 引物为 Forward:5' -CTCGCTTCGGCAGCACA- 3' , Reverse:5' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。
[0022]实施例二:miR_143对H1299细胞增殖的影响
将RPMI1640培养的H1299细胞均匀地铺在96孔板中。铺板24 h后将miR-143的mimics通过lipo2000转染试剂转染H1299细胞，转染6 h后更换新鲜的培养液，并立即加入CCK8试剂，在培养箱里培养2.5 h，再将溶液转移至酶标板，检测450 nm的吸光度值。之后，每隔24 h测量一次。
[0023]检测发现,转染miR-143的mimics组与对照组(转入购自锐博公司的NC, negativecontrol)相比较，其吸光度有显著的下降，也即转染了 miR-143的细胞的增殖速度显著低于对照组，说明miR-143具有抑制H1299细胞增殖的作用(参见图2)。
[0024]本实验采用D0J IND0公司的CCK8 (Cell Counting Kit_8)试剂盒。该试剂盒利用了水溶性四锉盐-WST-8 (2- (2-甲氧基-4-硝苯基)-3- (4-硝苯基)-5- (2，4_ 二磺基苯)-2H-四锉单钠盐)。
[0025]实施例三:miR-143对H1299细胞周期的影响
将H1299细胞均匀地铺在6孔板中，24 h后将miR-143的mimics通过lipo2000与无血清培养液RPMI1640共孵育后转入H1299细胞中，转染6 h后将细胞培养液换为新鲜培养液。转染48 h后，将收集到的细胞用70%乙醇固定，-20°C过夜。用核酸染料荧光染料碘化丙啶(PI)将固定好的细胞染色后采用流式细胞技术检测H1299细胞的细胞周期。结果表明，转染了 miR-143的H1299细胞G1/G0期的细胞数量显著比对照组多(参见图3)。
[0026]实施例四:双荧光素酶报告基因分析
将现的 3' -UTR 用引物 5' CGG AAT TCTGGCTTGGAACTGACAGTGT3' (forward)与5' AAA CTG CAGCACATTCCTAACAAGCCTGC3' (reverse)扩增后，通过酶切位点 EcoRI 与 PstI连接入pGL-3质粒，在一个萤火虫荧光素报告基因的3' -UTR区域，该质粒上含有SV40的启动子，连接上的3' -UTR包含了 miR-143与ATG2B的结合位点。用lipo2000转染试剂把miR-143的mimics与构建好的质粒共转入HEK-293T细胞中，并同时转入表达内参照报告基因海肾萤光素酶基因的PRL质粒，在转染6 h后将培养液换为新鲜培养液。转染48 h后，用PiOmega公司的双萤光素酶报告基因分析试剂盒检测pGL_3和pRL的荧光表达。转染pGL_3质粒的终浓度为200nmol/L ；pRL的终浓度为10nmol/L ；mimics的终浓度为50 nmol/L。结果发现，转染了 miR-143的HEK-293T细胞中萤火虫萤光素酶活性/海肾萤光素酶活性的值显著低于对照组，说明J/^现是miR-143的靶基因(参见图4)。
[0027]实施例五:qRT_PCR验证miR-143对H1299细胞内源基因的抑制作用
该实验通过构建miR-143的表达载体过表达miR-143。在pEGFP-Cl的EGFP基因序列后面接入表达miR-143前体的序列，为了 EGFP基因与miR-143表达的独立性，在表达miR-143前体的DNA序列前加入一个终止密码子TAA，实现在同一个启动子的驱动下独立表达。用引物 Forward pEGFP-miR-143:5' CCCTCGAGTCTAAGTTGGAGTCCCGCCACA3' ；ReversepEGFP-miR-143:5/ CGGAATTCACGCCTCATGCTAAGATGG3'扩增的片段用限制性内切酶 XhoI与EcoRI连接入pEGFP载体。
[0028] 将H1299细胞均匀地铺在6孔板中，24 h后将pEGFP、pEGFP-miR-143通过lipo2000与无血清培养液1640共孵育后转入H1299细胞中，转染6 h后将细胞培养液换为新鲜培养液。转染48 h后，收集细胞，提取RNA，利用Takara公司试剂盒反转录为cDNA，之后进行qRT-PCR检测。转染pEGFP-miR-143的细胞的miR-143的表达比对照高约50倍。用引物 5’ GGCAGTAGCTTTCTTTACTTGTATA3’ (forward)与 5’ GTACCTATAAATCTAAGGTGATCGT3’(reverse)检测kTG2B的表达，结果表明，miR-143对ATG2B具有抑制作用(参见图5)。
尽管本发明描述了具体的 例子，但是有一点对于本领域技术人员来说是明显的，即在不脱离本发明的精神和范围的前提下可对本发明作各种变化和改动。因此，所附权利要求覆盖了所有这些在本发明范围内的变动。
【权利要求】
1.一种miR-143基因在制备抑制非小细胞肺癌细胞增殖药物中的应用。
2.—种miR-143基因在制备阻滞非小细胞肺癌细胞细胞周期转换中药物的应用。
3.一种miR-143基因在制备下调471029表达水平药物中的应用。
【文档编号】A61K48/00GK103751801SQ201310407301
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年9月10日 优先权日:2013年9月10日
【发明者】金由辛, 韦嘉励, 马中良, 李艳利, 赵波涛 申请人:上海大学