多糖-蛋白轭合物疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明公开了以高产率合成和制备多糖-蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及一种反应物上的酰肼基团与其他反应物上的醛基或氰酸盐酯基的反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行，因此可以采用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离出所述轭合物。
【专利说明】多糖-蛋白轭合物疫苗
发明领域
[0001]本发明提供了以较高产量合成与制备多糖-蛋白轭合物疫苗的方法。该方法涉及在一种反应物上的酰肼基与另一种反应物上的醛基或氰酸盐酯基反应。所述反应以较高的轭合效率快速进行。可使用简化的纯化方法从未轭合的蛋白和多糖以及其他小分子副产物中分离所述轭合产物。
[0002]发明背景
[0003]细菌多糖(PSs)是在大龄儿童和成人中诱导短期免疫的非T细胞依赖性抗原，但幼小婴儿却常常缺乏。PSs并不能与主要组织相容性复合物结合，所述主要组织相容性复合物是抗原提呈以及刺激T-辅助淋巴细胞所必需的。PSs可以在无需T-辅助细胞淋巴细胞的帮助下刺激B淋巴细胞产生抗体。作为所述B淋巴细胞非T细胞依赖性刺激的结果，在这些抗原的免疫之后依然缺少记忆诱导。
[0004]通过多糖与蛋白分子的共价结合，非T细胞依赖性多糖抗原可转变为T细胞依赖性抗原。结合于所述轭合物疫苗多糖部分的B细胞可由辅助性T细胞来活化，该辅助性T细胞对该轭合载体蛋白部分的多肽具有特异性。对该载体蛋白产生应答的T辅助细胞能增强针对该多糖的抗体产生。多糖轭合疫苗是由蛋白与多糖的共价连接形成的多糖-蛋白杂合体。因为大多数天然细菌多糖在先经受某些化学修饰(“活化”)之前不能与蛋白化学相连，所以通常需要在结合前对所述多糖进行化学修饰。
[0005]对所述蛋白的结合产生了多种T细胞抗原决定簇。这些T细胞抗原决定簇会与CD4辅助性T细胞相互作用，极大地促进对所述结合多糖的抗体应答。甚至在婴儿体内，对轭合物的所述T辅助细胞依赖性应答可产生血清IgG抗体和免疫记忆。而且，与天然多糖相比，所述多糖轭合物的免疫原性对所述轭合多糖的大小的依赖程度有所降低。因此，采用多糖或寡糖制备的轭合物具有类似的免疫原性。
[0006]可采用多种轭合反应将多糖与蛋白共价连接。三种较为常用的方法有:1)还原性氨基化，其中一种反应成分的醛基或酮基与另一种反应成分的氨基或酰肼基反应，所形成的C=N双键随后被还原剂还原成C-N单键；2)氰基化轭合，其中可通过溴化氰(CNBr)或1-氰-4-二甲基氨基吡啶四氟硼酸(CDAP)向该羟基引入一个氰基，在加入蛋白成分后，其与氨基或酰肼基形成共价键；3)碳二亚胺反应，其中碳二亚胺能活化所述轭合反应中一种成份的羧基，所活化的羧基再与另一成分的氨基或酰肼基反应。这些反应经常被用来在所述轭合反应之前对所述轭合物的 成份进行活化。
[0007]b型嗜血流感杆菌(Hib)轭合物疫苗是用于临床的第一种多糖-蛋白轭合物疫苗。Robbins及其同事在1980年运用生物工程技术将糖化学地连接到蛋白载体上，这是50年前就发展出来的概念。参见Avery等人，J.Exp.Med.1929; 50:533-550; Schneerson等人，J.Exp.Medl980; 152:361-376。在美国目前有四种不同的Hib轭合物疫苗获得了许可，每种各不相同，且各自具有其物理，化学和免疫学特征，如表1所总结。在这些疫苗所使用的轭合化学和质量控制的详细论述已经出版。参见Ellis等人在《b型等嗜血杆菌轭合物疫苗的发展与临床应用》(Development and clinical uses of Haemophilus b conjugatevaccines) 一书中由Kniskern等人所著的《轭合物:设计，化学与分析》"Conjugation:design, chemistry, and analysis"章节，纽约，Marcel Dekker 出版社，1994 年，37-69 页。
[0008]表1
[0009]
【权利要求】
1.制备轭合物疫苗的方法，该方法包括: 在pH约为6至约7，存在1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐的条件下，将蛋白与1-氨基_2，3-丙二醇(APDO)反应，由此得到APDO修饰的蛋白溶液； 通过缓冲液更换将所述APDO修饰的蛋白溶液的pH调至约10.0到约11.0; 将所述APDO修饰的蛋白与氧化剂反应，由此得到醛活化的蛋白溶液； 通过缓冲液更换将所述醛活化的蛋白溶液的PH调至约10.0至约11.0 ； 在pH约6至约8的条件下，将酰肼活化的多糖与醛活化的蛋白反应，由此得到含有一或多个C=N双键的轭合物；及 将所述轭合物的基本全部C=N双键还原成C-N单键，由此得到能刺激免疫反应的轭合物疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM197以及脑膜炎球菌蛋白。
4.如权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖: 在溶液中将多糖与氧化剂反应，由此得到醛活化的多糖； 将所述醛活化的多糖与己二酸二酰肼反应，得到含有一或多个C=N双键的中间体；以及 将所述中间体的基本全部C=N双键还原成C-N单键，由此得到酰肼活化的多糖。
5.如权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖: 将多糖与1-氰-4- 二甲基铵吡啶四氟硼酸反应，由此得到氰酸盐活化的多糖； 将所述氰酸盐活化的多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖。
6.如权利要求1所述的方法，其中通过以下步骤来制备酰肼活化的多糖: 在1-[3_( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐存在的条件下，将多糖与己二酸二酰肼反应，由此得到酰肼活化的多糖。
7.轭合物疫苗，所述轭合物疫苗包括至少一种多糖部分和至少一种蛋白部分，其中所述多糖部分与所述蛋白部分通过至少一种式-C(=0)-NH-CH2-CH2-NH-NH-的连接基团相连接。
8.如权利要求7所述的轭合物疫苗，其中所述轭合物疫苗含有通过多个连接基团将多个多糖部分与多个蛋白部分交联形成的晶格结构。
9.如权利要求7所述的轭合物疫苗，其中所述多糖选自脑膜炎球菌多糖，肺炎球菌多糖，b型嗜血流感杆菌多糖，伤寒杆菌Vi多糖，以及B型链球菌多糖。
10.如权利要求7所述的轭合物疫苗，其中所述蛋白选自破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM197以及脑膜炎球菌蛋白。
【文档编号】A61K39/095GK103623405SQ201310439763
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2004年8月6日 优先权日:2003年8月6日
【发明者】车恒·罗伯特·李, 卡尔·E·弗拉施 申请人:美国政府健康及人类服务部