禽源大肠杆菌疫苗株（nn株）及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于兽医生物医药领域，涉及一株禽源大肠杆菌天然融合株（O1/O2）NN株及该融合株作为疫苗株在防制鸭大肠杆菌病中的应用和应用效果。本发明疫苗株的微生物保藏号是：7670。本发明公开的疫苗株安全性良好、效力稳定，对由血清型O1和O2引起的鸭大肠杆菌病均具有良好的保护效力。该疫苗株可用于制备防治鸭大肠杆菌病的灭活单苗或联苗。
【专利说明】禽源大肠杆菌疫苗株(NN株)及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于兽医生物新医药【技术领域】，涉及一株禽源大肠杆菌疫苗株NN株及其应用。
【背景技术】
[0002]鸭大肠杆菌病是一种急性败血性传染病，主要侵害2-6周龄的雏鸭。不管是原发性或继发性，其主要特征为发生心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎的病变。眼炎型的多见于I心周龄的雏鸭；关节炎型的多于7-10日龄的雏鸭；脑炎型的多见于I周龄雏鸭；浆膜型的多见于2飞周龄雏鸭。随着养鸭业的日益发展和集约化程度的提高及鸭大肠杆菌病的发生日趋严重，鸭大肠杆菌病给养鸭业造成了严重的经济损失，尤其是近年来，在我国种鸭的细菌病中大肠杆菌病显著增多。据调查显示，鸭大肠杆菌病在我国不同类型的养鸭场中普遍存在，流行广泛。
[0003]关于鸡源致病性大肠杆菌的血清型报道较多，而鸭源致病性大肠杆菌血清型的报道较少，由于大肠杆菌的血清型较为复杂，给防治工作带来一定的困难。据有关报道，对鸭有致病性的以01、02、035、036、073、078为主，而且不同地区血清学差别很大。因此，在大肠杆菌的防控上，大家都致力于制备融合株，制备多价疫苗，以此期望用一种疫苗同时对多个血清型的大肠杆菌病能产生保护。关于天然融合株，由刘吉山等首次分离报道，当时就提出这为疫苗制备时涵盖更多细菌血清型提供了方便条件。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题是针对禽源大肠杆菌血清型众多，不同地区甚至不同养殖场的流行菌株都不尽相同，为了满足一种疫苗多种保护的需求，从临床发病鸭群中分离筛选出一株天然融合株，该菌株制备疫苗对大肠杆菌血清型01和02引起的大肠杆菌病均能产生良好的保护。
[0005]本发明所要解决的技术问题是通过如下途径实现的:
本发明提供一种禽源大肠杆菌疫苗株NN株，微生物保藏号是:CGMCC N0.7670，分类命名:大肠埃希氏菌(Escherichia coli);保藏时间2013_5_31 ;保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地点:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0006]本发明提供的万.coli NN疫苗株的来源于:
2009年10月分离于安徽省某大型鸭场，具有典型肝周炎、心包炎、输卵管炎、气囊炎及卵黄性腹膜炎等病变，通过革兰氏染色、菌落形态观察、培养特性试验和生化试验鉴定，确定为大肠杆菌。应用大肠埃希菌O抗原定型血清鉴定为01/02。
[0007]E.coli NN株具有如下特性:
(O培养特性麦康凯培养基上的圆形、湿润、光滑的红色单个菌落；伊红美蓝培养基上生成暗紫红色或紫黑色具有金属光泽的菌落；革兰氏阴性小杆菌。[0008](2)生化特性可发酵碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等；枸橼酸盐利用、V-P试验均为阴性；M-R试验、硝酸盐还原、靛基质氧化酶为阳性
(3)血清型通过玻片凝集试验分离株与单因子血清01和02都发生凝集，鉴定此株细菌为天然融合株01/02株。
[0009](4)毒力攻毒剂量为IX IO9CFU/只时，可致10只21日龄雏鸭全部死亡。
[0010]本发明提供的禽源大肠杆菌NN株有益效果如下:
分离自自然发病鸭，具有流行血清型，与单因子血清01和02都发生凝集，一株天然融合株，以NN株为疫苗株制成的灭活疫苗对两种血清型菌株引起的大肠杆菌病均有不同程度的保护。
【具体实施方式】[0011]下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明提供的毒株应用领域和形式构成任何限制。
[0012]实施例1禽源大肠杆菌NN株分离鉴定 一、细菌的分离培养
1、病料分离采用无菌操作，取病鸭的心脏、肝脏，用灭菌的接种环将病料接种于营养琼脂平板上，37°c，培养18~24h，观察结果。
[0013]2、纯化培养E.coli分离株接种TSA培养基上，37°C培养箱中培养24 h后长出圆形、光滑、隆起、湿润半透明的近无色的菌落；麦康凯培养基上的圆形、湿润、光滑的红色单个菌落；接种于伊红美蓝培养基上，37°C，培养18~24h生成暗紫红色或紫黑色具有金属光泽的菌落；革兰氏染色观察；将革兰氏染色形态为:两端钝圆、散在或成对、无芽孢的红色小杆菌。
[0014]二、细菌鉴定 1、生化鉴定
E.coli分离株可发酵碳水化合物，如葡萄糖、乳糖、果糖、甘露糖、阿拉伯糖等；枸橼酸盐利用为阴性；尿素利用、H2S、VP等均为阴性。M.R.试验、吲哚试验为阳性。
[0015]2、血清型鉴定
2.1、玻片凝集抗原的制备
用灭菌PBS洗下疋coli分离株的纯培养物，置小圆底试管中，制成浓稠菌悬液，然后与普通肉汤小瓶培养物一起于121°C高压2小时，破坏其“K”抗原，制成高压抗原。
[0016]2.2、玻片凝集试验方法
将5ul已制备好的E.coli分离株玻片凝集抗原和5ul阳性血清分别在玻片上混匀，同时以疋coli标准株玻片凝集抗原设为抗原阳性反应对照，以鸭疫里默氏杆菌、多杀性巴氏杆菌和生理盐水设为抗原阴性反应对照，结果判定:抗原与血清混合后3 min内与单因子血清01和02均出现颗粒状凝集。
[0017]3、毒力测定
3.1、NN株动物回归试验
NN株的纯培养物接种14日龄雏鸭后，结果显示，攻毒剂量为I X IO8CFU/只时，死亡率达到80%。试验鸭病程变化:攻毒后18h开始发病，发病鸭精神沉郁、缩颈、扎堆、不能站立、停止采食和饮水、眼鼻有分泌物、眼眶周围湿润、灰绿色水样腹泻等症状。病程2~4d，死前抽搐，有的鸭子会有神经症状:狂奔。剖检病死鸭，24h内死亡鸭大多心包、肝脏、气囊表面的纤维素性渗出不明显，但败血症严重；72h后死亡鸭心包、肝脏表面、气囊有大量灰白色纤维素性渗出物，部分鸭心包膜与胸内壁粘连，果冻样渗出物，脾肿大。
[0018]3.2、NN株的半数致死量测定
将NN株的18~24 h纯培养物(8.0X IO9~1.0X 101° CFU/mL)用无菌生理盐水作川^川人川气^^倍稀释后’分别取。』mL腿肌接种14日龄樱桃谷鸭。其中试验组雏鸭分4组，每组5只，另5只作为对照，对照鸭以同样方式注射等量灭菌生理盐水。接种后连续观察I周。根据各组死亡情况计算出NN株的半数致死量(LD5tl)。
[0019]根据试验结果，得到NN株对雏鸭的半数致死量为1.7X10TCFU/羽。攻毒结果见表1。
[0020]表1半数致死量的测定结果
【权利要求】
1.一种禽源大肠杆菌(01/02)疫苗株NN株，微生物保藏号CGMCC No是7670。
2.一种疫苗组合物，其特征在于包含灭活的如权利要求1所述的禽源大肠杆菌(01/02)疫苗株NN株和药学上可接受的佐剂。
3.权利要求1所述的疫苗株万.coliNN在制备防制由血清型01和02引起的鸭大肠杆菌病药物中应用。
【文档编号】A61P31/04GK103484411SQ201310468079
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年10月10日 优先权日:2013年10月10日
【发明者】王伟, 许秀梅, 汪爱芬 申请人:南京天邦生物科技有限公司