抗hiv药物安瑞那韦在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】抗HIV药物安瑞那韦在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明以FDA认证抗HIV药物安普那韦为材料，采用MTT法检测安普那韦对肿瘤细胞的杀伤效果，实验证明安普那韦对乳腺癌MCF-7细胞、非小细胞肺癌A549细胞、鼠成纤维母细胞瘤L929细胞、结肠癌HT29细胞、脑胶质瘤U87细胞等多种肿瘤细胞增殖具有明显的抑制作用，从而阐明老药的新用途，为新型抗肿瘤药物的开发提供依据。
【专利说明】抗HIV药物安瑞那韦在制备抗肿瘤药物中的应用
【技术领域】[0001]本发明属于医药【技术领域】，特别涉及抗HIV的蛋白酶抑制剂药物安瑞那韦在抗肿瘤中的应用。
【背景技术】
[0002]自20世纪70年代以来，“一药、一靶、一病”的理念是药物发现所遵循的主要原则[1]。虽然这种理念在过去的几十年中加速了药物发现的步伐并取得了突出的成果，但其疗效差和毒副作用高等因素也极大地增加了药物发现过程的损耗率，从而凸显了传统药物研发思想的局限性，加剧了新药研发所面临的困境。越来越多的研究表明，药物可能具有多重作用靶标[2’3]，美国食品药物管理局(FDA)认证药物的新靶标也已被成功地预测出[4]。考虑到新药发现周期长、投入高的特点，从FDA已认证的药物出发，发现老药的新用途，无疑会为当前的医药行业注入新的活力。阿司匹林是老药新用领域的一个成功范例。该药的临床应用已有100余年的历史，近年来有研究结果表明，除了其显著的解热镇痛作用外，长期低剂量的阿司匹林可防治结肠癌['FDA认证的药物其毒理学、药物代谢动力学、生物利用度、临床与安全性等背景均已清晰，在此基础上研究药物的新用途，必将缩短药物研发周期，减少研发投入，从而显示出巨大的应用潜力。
[0003]蛋白酶抑制剂的抗肿瘤作用已有报道，除抑制HIV感染外，一些HIV蛋白酶抑制剂也被报道具有抗肿瘤活性。例如，利托那韦(Ritonavir),茚地那韦(Indinavir)和沙奎那韦(Saquinavir)会抑制卡波济氏肉瘤的生长Μ ;奈非那韦(Nelfinavir)和阿扎那韦(Atazanavir)会引发内质网压力并诱导恶性胶质瘤细胞的死亡[7];奈非那韦可阻断白介素-6 (IL-6)信号转导途径，并抑制前列腺癌动物模型的生长Μ ;利托那韦，沙奎那韦和奈非那韦可诱导多发性骨髓瘤细胞的生长捕获和凋亡[9]。此外，一些HIV蛋白酶也可增强肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性。例如，利托那韦会增强Docetaxel (多西他赛)对前列腺癌的治疗效果[1°];沙奎那韦会增强前列腺癌细胞对放疗的敏感性[η];沙奎那韦，利托那韦和茚地那韦会增强全反式视黄酸对人粒细胞性白血病的疗效[12]。
[0004]安瑞那韦(Amprenavir)是用于治疗HIV (人免疫缺陷病毒)感染的一种蛋白酶抑制剂，其通过与HIV-1蛋白酶活性位点结合，抑制蛋白酶的活性，进而导致非传染性、不成熟的病毒颗粒的形成，从而起到抗HIV感染的作用。该药于1999年4月15日被FDA批准上市,其市售名称为Agenerase?。2007年，其原药形式Fosamprenavir (市售名称为Lexiva?)开始发售，随后其他国家也逐渐开始售出Lexiva?。安瑞那韦通常是以液体或胶囊形式存在，是一种口服药物，也可与其他蛋白酶抑制剂如利托那韦联用从而发挥抗HIV作用。安瑞那韦的抗肿瘤效果也有一些报道，如安瑞那韦可通过降低血管内皮生长因子(VEGF)和缺氧诱导因子(HIF-1a)的表达而抑制肿瘤血管生成，从而抑制黑色素瘤细胞的生长M ;安瑞那韦也可通过抑制基质金属蛋白酶(MMP)活化和抗肿瘤血管生成从而抑制肝癌细胞的侵袭[14]。此外，安瑞那韦也可增强肿瘤动物模型对放疗的敏感性[14]。然而，目前安瑞那韦对乳腺癌、非小细胞肺癌、结肠癌、脑胶质瘤、成纤维母细胞瘤的抑制效果还未见报道。[0005]参考文献:
[1]J.E.R.McDonaghj The Theory and Practice of Chemotherapy, Proc.R.Soc.Med.9 (1916) 165-190.[2]R.M.Rich, P.J.Rosenfeldj C.A.Puliafitoj S.R.Dubovyj J.L Davis,H.W.Flynn Jr., S.Gonzalez, W.J.Feuerj R.C.Linj G.A.Lalwanij J.K.Nguyen,
G.Kumar, Short-term safety and efficacy of intravitreal bevacizumab (Avastin)for neovascular age-related macular degeneration, Retina 26 (2006) 495-511.[3]A.L.Hopkins, Network pharmacology: the next paradigm in drugdiscovery, Nat.Chem.Biol.4 (2008) 682-690.[4]M.J.Keiserj V.Setolaj J.J.1rwin, C.Laggnerj A.1.Abbas, S.J.Hufeisenj N.H.Jensen, M.B.Kuijerj R.C.Matos, T.B.Tran, R.Whaley, R.A.Glennonj J.Hertj K.L.Thomas, D.D.Edwards, B.K.Shoichetj B.L.Roth,Predicting new molecular targets for known drugs, Nature 462 (2009) 175-181.[5]P.Moayyedij J.A.Jankowski, Does long term aspirin prevent cancer?，BMJ 341 (2010) c7326.[6]C.Sgadarij P.Moninij G.Barillarij D.B.Ensolij Use of HIV proteaseinhibitors to block Kaposi’s sarcoma and tumour growth, Lancet Oncol.4 (2003)537-547.[7]P.Pyrkoj A.Kardoshj W.Wang, W.Xiong, A.H.Schonthalj T.C.Chen,HIV-1 protease inhibitors nelfinavir and atazanavir induce malignant gliomadeath by triggering endoplasmic reticulum stress, Cancer Res.67 (2007)10920-10928.[8]Y.Yang, T.1kezoej T.Takeuchij Y.Adachij Y.0htsukij S.Takeuchij
H.P.Koeffler，H.Taguchij HIV-1 protease inhibitor induces growth arrestand apoptosis of human prostate cancer LNCaP cells in vitro and in vivo inconjunction with blockade of androgen receptor STAT3 and AKT signaling, CancerSci 96 (2005) 425 - 433.[9]T.1kezoej T.Saitoj K.Bandobashij Y.Yang, H.P.Koefflerj H.Taguchij HIV-1 protease inhibitor induces growth arrest and apoptosis of humanmultiple myeloma cells via inactivation of signal transducer and activator oftranscription 3 and extracellular signal-regulated kinase 1/2， Mo1.CancerTher.3 (2004) 473-479.[10]T.1kezoej Y.Hisatakej T.Takeuchij Y.0htsukij Y.Yang, J.W.Said, H.Taguchij H.P.Koefflerj HIV-1 protease inhibitor, ritonavir: a potent inhibitorof CYP3A4， enhanced the anticancer effects of docetaxel in androgen-1ndependentprostate cancer cells in vitro and in vivo, Cancer Res.64 (2004) 7426-7431.[11]F.Pajonkj J.Himmelsbachj K.Riessj A.Sommer, W.H.McBride,The human immunodeficiency virus (HIV)-1 protease inhibitor saquinavirinhibits proteasome function and causes apoptosis and radiosensitization innon-HIV-associated human cancer cells.Cancer Res.62 (2002) 5230-5235.[12]T.1kezoej E.S.Daarj J.Hisatakej H.Taguchij H.P.Koefflerj HIV-1protease inhibitors decrease proliferation and induce differentiation of humanmyelocytic leukemia cells, Blood 96 (2000) 3553-3559.[13]N.Pore, A.K.Gupta, G.J.Cernigliaj A.Maityj HIV protease inhibitorsdecrease VEGF/HIF-lalpha expression and angiogenesis in glioblastoma cells.Neoplasia 8 (2006) 889-895.Verdinaj L Manentej E.P.Spugninij R.Vigliettij R.Parrellaj P.PaglianojG.Parrellaj R.Galatij A.De Luca, A.Baldij V.Montesarchioj A.ChiriannijAmprenavir inhibits the migration in human hepatocarcinoma cell and the growthof xenografts.J.Cell Physiol.228 (2013) 640-645。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于证明FDA认证抗HIV药物安瑞那韦具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性，从而阐明老药的新用途，为新型抗肿瘤药物的开发提供依据。
[0007]本发明通过实验证明:安瑞那韦具有抑制乳腺癌MCF-7细胞、非小细胞肺癌A549细胞、鼠成纤维母细胞瘤L929细胞、结肠癌HT29细胞、脑胶质瘤U87细胞增殖的作用。实验结果表明:
(1)安瑞那韦对乳腺癌MCF-7细胞的增殖抑制率与浓度和时间呈正相关性，其中，200μ M处理48h时达到最大抑制率96.5%。
[0008](2)安瑞那韦对非小细胞肺癌A549细胞的增殖抑制率与浓度和时间呈正相关性，其中，200 4皿处理4811时达到最大抑制率为73.5%。
[0009](3)安瑞那韦对鼠成纤维母细胞瘤L929细胞的增殖抑制率与浓度和时间呈正相关性，其中，200 4皿处理4811时达到最大抑制率68.5%。
[0010](4)安瑞那韦对结肠癌HT29细胞的增殖抑制率在0-100 μ M浓度范围内与浓度和时间均呈正相关性，在100 μ M时增殖抑制效果达到最大；在100-150 μ M浓度范围内，安瑞那韦对ΗΤ29细胞的增殖抑制率随浓度和时间的增加而降低；在150-200 μ M浓度范围内，安瑞那韦对ΗΤ29细胞的增殖抑制率保持不变。其中，100 μ M处理48h时达到最大抑制
率 38%ο
[0011](5)安瑞那韦对脑胶质瘤U87细胞的增殖抑制率在0-100 μΜ浓度范围内与浓度和时间均呈正相关性，在100 μ M时增殖抑制效果达到最大；安瑞那韦处理48h时，在100-200 μ M浓度范围内对ΗΤ29细胞的增殖抑制率保持不变；安瑞那韦处理24h时，在100-150 μ M浓度范围内，安瑞那韦对HT29细胞的增殖抑制率保持不变，在150-200 μ M浓度范围内，安瑞那韦对ΗΤ29细胞的增殖抑制率随浓度的增加而降低。其中，200 μΜ处理48h时达到最大抑制率30.5%。
[0012]本发明具有以下有益效果:
1、安瑞那韦为已通过FDA认证的药物，其毒理学、药物代谢动力学、生物利用度、临床与安全性等背景均已清晰，在此基础上发现其抗肿瘤的新用途，将缩短药物研发周期，减少研发投入，从而节约成本。[0013]2、本发明首次证明抗HIV药物安瑞那韦具有抑制多种肿瘤细胞增殖的作用，明确了老药的新用途，为新型抗肿瘤药物的开发提供了新的思路。
[0014]3、安瑞那韦的广谱抗肿瘤活性也必将具有广阔的市场应用前景。
[0015]附表和【专利附图】
【附图说明】
表1是本发明所述安瑞那韦对乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制效果。
[0016]表2是本发明所述安瑞那韦对非小细胞肺癌A549细胞生长的抑制效果。
[0017]表3是本发明所述安瑞那 韦对鼠成纤维母细胞瘤L929细胞生长的抑制效果。
[0018]表4是本发明所述安瑞那韦对结肠癌HT29细胞生长的抑制效果。
[0019]表5是本发明所述安瑞那韦对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制效果。
[0020]图1是本发明所述安瑞那韦对乳腺癌MCF-7细胞生长的抑制效果。
[0021]图2是本发明所述安瑞那韦对非小细胞肺癌A549细胞生长的抑制效果。
[0022]图3是本发明所述安瑞那韦对鼠成纤维母细胞瘤L929细胞生长的抑制效果。
[0023]图4是本发明所述安瑞那韦对结肠癌HT29细胞生长的抑制效果。
[0024]图5是本发明所述安瑞那韦对脑胶质瘤U87细胞生长的抑制效果。
【具体实施方式】
[0025]实施例1:安瑞那韦原液的制备
安瑞那韦(CAS N0.161814-49-9，纯度>98%)购自上海瀚香生物科技有限公司。药品先溶解在DMSO中配成浓度为KT2M的原液，分装，_80°C储存实施例2:肿瘤细胞的培养1、材料和方法1.1材料
菌株:乳腺癌MCF-7细胞、非小细胞肺癌A549细胞、鼠成纤维母细胞瘤L929细胞、结肠癌HT29细胞、脑胶质瘤U87细胞(购自上海生命科学研究院细胞库)
培养基:RPM1-1640培养液(100 M/mL青霉素+100 M/mL链霉素)添加10%(v/v)的小牛血清1.2方法
(I)细胞悬浮生长于含10%小牛血清的RPM1-1640培养液(100 M/mL青霉素+100 MZmL链霉素)中，于37 °C、饱和湿度、5% CO2培养箱中培养。
[0026](2)2-3d换I次培养液。
[0027](3)收集对数生长期的细胞用于实验。
[0028]实施例3:安瑞那韦对肿瘤细胞增殖的抑制作用
1、材料和方法
1.1材料
50μΜ,ΙΟΟ μ Μ, 150 μ Μ, 200 μ M安瑞那韦溶液:采用实施例1所获取的安瑞那韦原
液进行稀释。
[0029]处于对数期的乳腺癌MCF-7细胞、非小细胞肺癌Α549细胞、鼠成纤维母细胞瘤L929细胞、结肠癌ΗΤ29细胞、脑胶质瘤U87细胞:采用实施例2所述方法获得。
[0030]1.2 方法(I)以5X104个/ mL细胞浓度，将肿瘤细胞接种于96孔板中，每孔100 μ L细胞悬液(每组设3个复孔)，培养24h。
[0031](2)以不含细胞的RPM1-1640培养液为空白对照组，向培养的细胞中加入终浓度分别为50、100、150、200 μ M的安瑞那韦，同时分别培养24h和48h。
[0032](3)每组加入10yL、5 mg/mL MTT于每孔后，继续培养4h后，吸除上清液，加入100 μ L的DMS0，轻轻震荡促进结晶的溶解。
[0033](4)酶标仪(于492nm波长下)测定吸光度值(A )，重复测定3次。观察结果。
[0034]细胞增殖抑制率=
【权利要求】
1.FAD认证抗HIV药物安普那韦在治疗肿瘤的药中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为乳腺癌细胞。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为非小细胞肺癌细胞。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为鼠成纤维母细胞瘤细胞。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为结肠癌细胞。
6.根据权利要求1所 述的应用，其特征在于所述肿瘤细胞为脑胶质瘤细胞。
【文档编号】A61P35/00GK103536605SQ201310532562
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】鲍锦库, 李鑫, 吴传芳, 李春漾, 孙荣, 王海莲, 卢帮敏, 李晓雨, 张彬 申请人:四川大学