一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法
【专利摘要】一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。本发明的技术方案要点是，一种治疗猪脾胃虚寒型腹泻的兽药，选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用。本发明所述的制备方法简单易行，成本低廉，经济实用，可广泛用于犬主要疫病的紧急预防和治疗。
【专利说明】一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法
[0001]【技术领域】:
本发明涉及犬用多联高免血清的制备，特别是一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。
[0002]【背景技术】:
随着人民生活水平的提高，人们饲养犬的数量与日俱增，相应的犬病大量增加，如犬瘟热、犬细小病毒病、犬传染性肝炎、犬传染性喉气管炎、犬流感、犬副流感等严重影响犬的健康，一些人兽共患的疾病如狂犬病直接威胁人类健康。
[0003]目前，国内外已有多种抗病毒血清、抗细菌毒素或免疫球蛋白制剂应用于临诊实践，用于疾病的紧急预防与治疗，如抗狂犬病血清、破伤风抗毒素血清等，这些抗血清多数是使用马属动物或犬制备的，这些生物制品一方面工艺复杂，成本很高，另一方面用犬生产的抗血清由于来自于本种动物，不可避免会导致垂直传播或水平传播某种传染病的可能。 [0004]
【发明内容】
:
本发明的是设计一种生产工艺简单、产品效果好的利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法。
[0005]本发明的技术方案是，一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于:选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的
3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用。所述的血清灭活除菌步骤为:收集的血清混合均匀，加入终浓度为 0.3%-0.5% 的 TNBP (磷酸三丁脂)和 1%-3% 的吐温-80 或 l%-3%Triton-100, 24°C 6_8h ；再经6tlCo-Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。所述的含有黄芪多糖的犬五联活疫苗，其黄芪多糖含量为80-320ug/ml。
[0006]本发明所述的制备方法简单易行，成本低廉，经济实用，可广泛用于犬主要疫病的紧急预防和治疗。
[0007]本发明的技术方案由如下过程组成:
1.免疫原:市售的犬五联活疫苗；①美国辉瑞生产，预防犬瘟热、犬腺病毒I型引起的传染性肝炎、犬腺病毒2型引起的呼吸道病、犬副流感和犬细小病毒肠炎；②吉林五星药厂生产，用于预防狂犬病、犬瘟热、犬副流感、腺病毒感染及犬细小病毒感染。
[0008]2.动物免疫:
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养，对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为80-320ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧。
[0009]接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份。每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，检测抗体效价。依据抗体效价确定强化免疫时间及采血时间。
[0010]3.血液采集及血清分离:
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管(一端尖、一端平，长40cm、直径约Icm)平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏(不宜深入太长防止完全穿透心脏)，将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置，待血块收缩完全后置4°C过夜，4000rpm离心20min收集血清。
[0011]4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐温-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再经60Co- Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
[0012]5.效价测定
犬瘟热及狂犬病病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0013]6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板，37°C培养48-72h看是否有菌落生长。
[0014]7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头(5日龄-10日龄)(腹腔注射)5-10ml/头，观察一周(每日量体温，观察是否发病)，一切正常者为合格。
[0015]其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001年版)中抗血清成品有关规定进行。
[0016]将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18°C以下冷冻保存。
[0017]所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g/10ml。
[0018]【具体实施方式】:
详细描述实施例，
实施例1
1.免疫原:由美国辉瑞生产的犬五联活疫苗。
[0019]2.动物免疫:
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖含量为80ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0020]3.血液采集及血清分离:
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管(一端尖、一端平，长40cm、直径约Icm)平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏(不宜深入太长防止完全穿透心脏)，将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置，待血块收缩完全后置4°C过夜，4000rpm离心20min收集血清。
[0021]4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.5%的TNBP和1%的吐温-80，240C 6h ；再经6tlCo-Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
[0022]5.效价测定
犬瘟热病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0023]6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板,37°C培 养48h无菌落生长为合格。
[0024]7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头(5日龄-10日龄)(腹腔注射)5-10ml/头，观察一周(每日量体温，观察是否发病)，一切正常者为合格。
[0025]其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001年版)中抗血清成品有关规定进行。
[0026]将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18°C以下冷冻保存。
[0027]所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g/10ml。
[0028]实施例2
1.免疫原:由吉林五星药厂生产的犬五联活疫苗。
[0029]2.动物免疫:
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为160ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0030]3.血液采集及血清分离:
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管(一端尖、一端平，长40cm、直径约Icm)平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏(不宜深入太长防止完全穿透心脏)，将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置，待血块收缩完全后置4°C过夜，4000rpm离心20min收集血清。
[0031]4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.4%的TNBP和2%的吐温-80，24°C 6h ；再经6tlCo-Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
[0032]5.效价测定
犬瘟热及狂犬病病毒抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0033]6.无菌检查
血清通过接种琼脂平板,37°C培养48h无菌落生长为合格。
[0034]7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头(5日龄-10日龄)(腹腔注射)5-10ml/头，观察一周(每日量体温，观察是否发病)，一切正常者为合格。
[0035]其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001年版)中抗血清成品有关规定进行。
[0036]将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18°C以下冷冻保存。
[0037]所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g/10ml。
[0038]实施例3
1.免疫原:由美国辉瑞生产的犬五联活疫苗。
[0039]2.动物免疫:
选择体格较大，健康状况良好，产仔6胎以上，繁殖力下降，无种用价值的淘汰母猪。在卫生状况良好，专人管理的条件下饲养。对其使用上述添加黄芪多糖重量份数为320ug/ml的疫苗进行多次强化免疫。接种的方法为肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧。接种剂量首次5头份/头，第二次10头份/头，第三次免疫15头份/头，每次间隔2周，最后一次免疫剂量增加至20头份/头。最后一次免疫后2周，检测抗体效价，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0040]3.血液采集及血清分离:
强化免疫后14-30d之间检测抗体效价，达到规定的效价水平要求后即可采血。采血最好在上午空腹时进行，禁食时间在6h以上，可避免血中乳糜的发生从而获得澄清的血清。将待采血母猪用清水冲洗干净后固定在“X”型的保定架上，使猪仰卧，将猪尾部垫高，将位于胸前口左侧的被毛刮除干净，并用3%碘酒消毒，后用75%酒精脱碘，将事先消毒完好的空心铜管(一端尖、一端平，长40cm、直径约Icm)平头一端套上消毒完好的硅橡胶管，经消毒的胸前口捅入猪的心脏(不宜深入太长防止完全穿透心脏)，将胶管游离端插入预先装有少量灭菌生理盐水的离心管中收集血液，室温放置，待血块收缩完全后置4°C过夜，4000rpm离心20min收集血清。
[0041]4.血清灭活除菌
将上述收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%的TNBP和3%的吐温-80，24°C 6h ；再经6tlCo-Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
[0042]5.效价测定
犬瘟热抗体通过微量中和试验测定，犬副流感、腺病毒I型和2型及犬细小病毒病毒抗体均通过微量血凝抑制病毒试验测定，犬瘟热病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为合格。
[0043]6.无菌检 查
血清通过接种琼脂平板,37°C培养48h无菌落生长为合格。
[0044]7.安全试验
将上述无细菌生长的血清注射犬约10头(5日龄-10日龄)(腹腔注射)5-10ml/头，观察一周(每日量体温，观察是否发病)，一切正常者为合格。
[0045]其它项按照中华人民共和国兽用生物制品质量标准(2001年版)中抗血清成品有关规定进行。
[0046]将合格的血清制品分装，5ml/瓶，-18°C以下冷冻保存。
[0047]所述的黄芪多糖为广西南宁市桃源兽药厂生产的黄芪多糖注射液，含量为0.2g/10ml。
[0048]应用例:
1、新乡市郊区一农户，患犬初期粪便稀薄，体温4 0.5°C，2d后，粪便呈番茄酱色或咖啡色，味腥臭，排便次数不定，有里急后重的症状，连续注射0.5-1.012-3d，K3，3d后症状明显减轻，一周后症状消失，基本康复。
[0049]2.2011年以来，河南科技学院兽医院对前来就诊的表现高烧、下痢、便中带血、咳嗽气喘等症诊断为犬细小病毒病及犬瘟热的患犬376只，肌肉注射或皮下注射本产品
2-5ml/头，同时配合K3及安乃近等进行对症治疗，每天一次，连用2-3天，3天后症状消失，治愈率达85%，有效率达90%，疗效显著。
[0050]本发明的猪源犬用多联高免血清对治疗早期的犬瘟热、犬细小病毒病等疫病效果极好，与其它犬用多联高免血清效果相当，而制备工艺简单，价格低廉，优势明显。
【权利要求】
1.一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于:选择健康状况良好的母猪，对其使用含有黄芪多糖的犬五联活疫苗多次强化免疫，接种的方法为皮下或肌肉多点注射，接种的部位为颈部两侧或臀部两侧，接种剂量从首次的3-5头份逐次递增至15-20头份，最后一次免疫剂量增加至20头份，每次免疫间隔2-4周，最后一次免疫后2-4周，然后进行心脏采血，分离血清，再将血清灭活除菌，然后检测抗体效价，其中犬瘟热及狂犬病病毒中和抗体效价得到1:256以上，其余病毒血凝抑制抗体效价达到1:256以上为适用。
2.如权利要求1所述的一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于:血清灭活除菌步骤为:收集的血清混合均匀，加入终浓度为0.3%-0.5%的TNBP (磷酸三丁脂)和1%_3%的吐温-80或l%-3%Triton-100，24°C 6_8h ;再经60Co- Y射线辐照灭菌，辐照温度为20°C，辐照剂量率为14.0Gy/min，辐照吸收剂量为12kGy。
3.如权利要求1所述的一种利用猪源生产犬用多联高免血清的制备方法，其特征在于:所述的含有黄芪多糖的犬五联活疫苗，其黄芪
多糖320ug/ml。
【文档编号】A61K39/39GK103585627SQ201310550849
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月9日 优先权日:2013年11月9日
【发明者】姚四新, 欧长波, 赵淑秋, 刘兴友, 胡建和 申请人:河南科技学院