一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法及产品，属于生物制品【技术领域】。本发明提供了一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：1）PK-15细胞的扩增培养；2）接种病毒培养制备病毒液；3）病毒浓缩、灭活及制成疫苗产品。本发明通过使用连续灌流式生物反应器进行扩增PCV-2，具有以下优点：操作空间相对较小、工艺操作简单、劳动力明显降低、可通过级联放大进行大规模生产、维持液中血清含量低、生产成本相对较低、产品质量可控性高。最终所得到的猪圆环病毒2型灭活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等优点。
【专利说明】—种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法及产品，属于生物制品【技术领域】。
【背景技术】
[0002]猪圆环病毒(PCV)于1997年首次在加拿大爆发，随后在全球很多国家相继报道该病的出现。PCV有PCVl和PCV-2两种基因型，Tischer等最早在PK-15细胞中发现PCV-1的存在，该基因型病毒的基因组全长1759bp，与PCV-2的核苷酸相似性在70%左右。猪肾上皮细胞PK-15，来源于猪肾，中文名为猪肾上皮细胞，正常的细胞形态为上皮样，贴壁生长。该细胞对多种病毒比较敏感，如猪圆环病毒(PCV)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)等，可应用于猪圆环病毒疫苗、猪细小病毒疫苗、猪瘟病毒疫苗等的制备。PCVl并不能引起猪只的发病，但PCV-2则是能引发仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)，是仔猪的重要传染病，同时也是育肥猪的皮炎和肾病综合征(PDNS)的主要诱因。据最新研究报道，PCV-2型还能够与其他病毒共感染诱发典型的PMWS症状，例如:猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒。易感猪群的发病率约为5%~25%，但发病后死淘率高达80%左右，该病给全球养猪业造成了重大经济损失。
[0003]目前生产猪圆环病毒2型主要同传统的大方瓶或转瓶进行培养的，这种生产工艺技术含量低，操作简便，便于技术推广；但劳动力投入高、无法级联放大、批次差异明显以及难以标准化质量控制等技术 瓶颈使其无法在短时间内生产出大量的高质量的疫苗产品。另外，PCV-2具有特殊的生物学特性使其在传统的生产工艺下无法达到较高的病毒滴度，同样限制了 PCV-2疫苗的大规模生产。生物反应器是20世纪70年代发展起来的一种新型细胞培养技术，由于其可以装载的载体容量大从而为细胞生长提供更大的贴壁面积，使细胞大规模培养成为了可能。随着生物反应器技术的不断成熟，越来越多的病毒疫苗生产开始转向利用该技术进行连续培养的生产方式。生物反应器具有传统细胞培养所不具备的多种技术优势，这种先进的生产工艺可以很好的解决上述传统细胞培养中的各种技术瓶颈。
[0004]当前使用的PCV-2疫苗均是用矿物油作为佐剂，但这种佐剂具有副作用大、安全性低等缺点。MontanideTM ISA206是一种新型的佐剂，由于独特的分子特点使其与水相的混合乳化时避免添加其他乳化剂。另外，该新型佐剂中使用的油分也有所改进，使用了可代谢的矿物油替换了初期的矿物油，可以进一步提高生物安全性。
[0005]因此，寻找一种更为高效的大规模生产方式制备PCV-2疫苗成为了当前首要的任务。另外，如何提高该疫苗的安全性同样值得我们去探索和研究。
【发明内容】
[0006]为解决现有技术的不足，本发明基于生物反应器制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的方法，为猪圆环病毒2型提供一种安全连续封闭式的培养方法,与传统生产工艺相比具有明显的优势。[0007]一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤:
[0008]I) PK-15细胞的扩增培养
[0009]将2~3X IO5个/ml的PK-15细胞接入到生物反应器中，加入片状载体补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，搅拌转速为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37°C，进行细胞悬浮培养，24小时后开启进液泵和出液泵进行流加培养，其中:每接入IL所述PK-15细胞，加入片状载体250g，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ;
[0010]2)接种病毒的培养及制备病毒液
[0011]所述PK-15细胞在所述生物反应器培养至72小时后排出细胞生长液，将重量百分含量为1%的血清的维持液接入所述生物反应器内，接入圆环病毒(YZ株)F15代种毒，病毒接种量为400nmL，病毒维持液添加终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，将pH调整为7.4，温度设定为36.5°C，培养至24小时开始收获毒液并同时补充新鲜维持液，继续培养至病毒接种后240小时，其中:所述步骤I)中每接入IL所述PK-15细胞，每天灌注量为15L ；
[0012]3)病毒浓缩、灭活及制成疫苗产品。
[0013]优选的，所述生物反应器为续灌注式生物反应器。
[0014]优选的，在所述步骤I)之前先确定PK-15细胞培养圆环病毒的生物反应器培养条件，其中所述生物反应器为连续灌注式生物反应器。
[0015]更优选的，所述确定PK-15细胞培养圆环病毒生物反应器培养的条件为:将2~3 X IO5个/ml的PK-15细胞接入到所述生物反应器内，选用片状载体，搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.2，温度为37°C，进行细胞悬浮培养，24小时后开始流加灌注培养，至312小时培养结束。 [0016]优选的，所述步骤3)包括乳化，乳化后制得PCV-2 (YZ株)水包油包水剂型灭活疫苗。
[0017]更优选的，所述乳化的方法为:将佐剂与合格的灭活抗原等量混合于乳化缸内，低速搅拌乳化30分钟。
[0018]更优选的，取乳化后的试剂5~IOmL,以3000r/min离心15分钟，如有分层现象，
重复乳化。
[0019]本发明还提供给了所述猪圆环2型灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
[0020]其中，所述的生物反应器可选用NBS公司连续灌注式生物反应器，涉及的载体为片状载体，片状载体装载量为250g，约合50g/L。灌流培养过程中可以保持细胞生长液或病毒维持液体积不变。疫苗制备时所用的佐剂为双相油乳剂，例如法国赛比克公司的MontanideTM ISA206。
[0021]本发明通过使用连续灌流式生物反应器进行扩增PCV-2，具有以下优点:操作空间相对较小、工艺操作简单、劳动力明显降低、可通过级联放大进行大规模生产、维持液中血清含量低、生产成本相对较低、产品质量可控性高。最终所得到的猪圆环病毒2型灭活疫苗具有安全性高、免疫效果好，副作用小等优点。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为本发明中使用的连续灌流式生物反应器示意图。
[0023]图中，I为培养基加流袋，2为生物反应器主体，3为培养物接收装置。【具体实施方式】
[0024]以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0025]实施例1
[0026]本实例说明PK-15细胞培养圆环病毒生物反应器培养条件以及PCV-2增殖条件的确定。
[0027](I)将2X IO5个/ml左右的PK-15细胞接入到反应器中，补充含5%牛血清的DMEM培养基至5L，设定搅拌转速为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37°C，进行细胞悬浮培养，24小时后开启进液泵和出液泵进行流加培养，每天定时取样检测葡萄糖的消耗量并记录碱液(l%NaOH)的消耗量，连续培养至13天，打开罐体，消化细胞并计数。最终确定培养条件为:为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37°C。
[0028](2)在细胞反应器培养至48小时、72小时和96小时时排出细胞生长液，将含1%血清的维持液接入反应器内，接入已准备好的圆环病毒(YZ株)F15代种毒，接毒量分别为200mL、400mL和600mL，病毒维持液中含D-氨基葡萄糖浓度为2mmol/L，设定反应器搅拌转速为90转/分，溶氧50%，PH7.4，温度36.5°C，培养至24小时开始收获毒液并同时补充新鲜维持液，继续培养至240小时，每日取样检测葡萄糖含量同时记录碱液(l%NaOH)的消耗量，从接毒后24小时开始，每天取2个样分别检测毒液的TCID50，并取接毒后24-240小时的混合样检测TCID5tlt5最终确定培养条件为:在细胞增殖72小时后以总体积的8%的量接种病毒液，D-氨基葡萄糖的终浓度为2mmol/L，反应器参数设置为90转/分，溶氧50%，pH7.4，温度 36.5 0C o
[0029]实施例2
[0030]本实施例说明将病毒接种并培养制备病毒液的方法。
[0031]将体积为IL浓度为2~3X IO5个/ml左右的PK-15细胞接入到反应器中，补充含5%牛血清的DMEM培养基至5L，设定搅拌转速为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37 °C，进行细胞悬浮培养，24小时后开启进液泵和出液泵进行流加培养；在细胞反应器培养至72小时后排出细胞生长液，将含1%血清的维持液接入反应器内，接入已准备好的圆环病毒(YZ株)F15代种毒，接毒量为400mL，病毒维持液添加终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，将PH调整为7.4，温度设定为36.5°C，培养至24小时开始收获毒液并同时补充新鲜维持液，继续培养至接毒后240小时，每天灌注量为15L。最终得到的病毒上清液的病毒含量≤IO6-5TCID50/
mLo
[0032]实施例3
[0033]本实施例说明将病毒液灭活及制备成疫苗产品的方法。
[0034]病毒液的灭活:
[0035]收集实施例2中最终得到的病毒液，采用终浓度为1.0%。的环化BEI，中心温度32°C灭活48h，用终浓度为2%的灭菌硫代硫酸钠溶液终止灭活。
[0036]灭活疫苗的制备:
[0037]取法国赛比克公司MontanideTM ISA206VG佐剂1份，检验合格的灭活抗原1份，等量混合于乳化缸内，低速搅拌乳化30分钟，制得PCV-2 (YZ株)水包油包水剂型灭活疫苗。[0038]实施例4
[0039]本实施例说明得到的疫苗产品的效果及安全试验。
[0040]一、免疫效力与持续期试验
[0041]其中，PCV-2抗原、抗体均阴性的断奶仔猪、后备母猪购自镇江市丹徒区云立牧业有限公司；猪圆环病毒2型抗血清购自VMRD公司；羊抗猪突光二抗购自SouthernBiotech公司；Taq酶等分子生物学试剂购自大连TaKaRa生物工程有限公司；其它均为进口或国产分析纯级。
[0042]I试验方法:
[0043]1.1断奶仔猪免疫抗体产生及攻毒保护体免疫试验
[0044]1.1.1断奶仔猪免疫后血清抗体监测
[0045]选择30头3~5周龄断奶仔猪进行试验，将试验动物随机分成5组，前3组分别免疫我公司试制的3批疫苗，采用颈部肌肉注射免疫，分2次免疫，在首免后第3周进行一次加强免疫；免疫剂量为Iml/头/次。另设I组非免疫攻毒对照组，I组非免疫非攻毒对照组。分别于首次免疫后第7天、14天、21天、28天和35天采血并分离血清，进行血清IFA抗体检测。
[0046]1.1.2断奶仔猪免疫攻毒保护试验
[0047]二免后14天各组 猪逐头称重，并用4 X 105_ tlTCID5tl剂量的PCV-2强毒对免疫组和非免疫攻毒组进行攻毒，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分4点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA，0.5mg/ml),4ml/头，腹腔接种巯基乙酸培养基，IOml/头；攻毒后第11、19天腹腔接种相同剂量巯基乙酸培养基，攻毒后I~28d测量体温，观察临床症状。分别于攻毒后7d、14d、21d和28d采血，用PCR方法检测血清中有无PCV-2抗原。死亡猪进行病理解剖，于攻毒后28天时对所有猪称重、剖杀，比较各攻毒组与非免疫非攻毒组间平均相对日增重，用免疫组化染色法检测肺门及肠系膜淋巴结中的PCV-2抗原。
[0048]1.2疫苗免疫断奶仔猪抗体消长规律及免疫持续期攻毒保护试验
[0049]1.2.1抗体持续期检测试验选30头PCV-2抗原、抗体均为阴性的断奶仔猪进行试验，试验随机分为5组，前3组分别免疫我公司生产的3批疫苗(YH001、YH002、YH003)，并设非免疫攻毒对照组I组、非免疫非攻毒对照组I组。采用颈部肌肉注射免疫，分2次免疫，5周龄首免，间隔3周进行一次加强免疫，免疫剂量为Iml/头/次。于免疫后2、3、4、5、6、7、8周及3、4、5、6、7、8个月分别采血并分离血清，运用IFA方法测定血清中抗体水平。
[0050]1.2.2免疫持续期攻毒保护试验分别在免疫后第8个月，各组取5头猪逐头称重，并用4X 105_ tlTCID5tl剂量的PCV-2强毒对免疫组和非免疫攻毒组猪进行攻毒，攻毒后第4、7天分别在猪的两腋下及两臀部分4点接种用弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(KLH/ICFA,0.5mg/ml)，4ml/头，同时腹腔接种巯基乙酸培养基，IOml/头；攻毒后第14、21天分别按相同剂量(IOml/头)腹腔接种巯基乙酸培养基，每组隔离观察28天。攻毒后I~28d测量体温，观察临床症状。于攻毒后28天时对所有猪采血、称重、扑杀，PCR法检测血清病毒血症，比较各攻毒组与非免疫非攻毒组间平均相对日增重，免疫组化染色法检测肺门及肠系膜淋巴结中的PCV-2抗原。根据体温变化、平均相对日增重、血清病毒血症、淋巴结免疫组化，评价疫苗持续期保护效果。[0051]2实验结果:
[0052]2.1断奶仔猪免疫抗体产生及攻毒保护体免疫试验结果
[0053]2.1.1断奶仔猪免疫抗体产生检测结果
[0054]疫苗免疫前所有仔猪的血清抗体效价均低于1:50,于首免后第2周免疫猪血清中即可检测到特异性抗PCV-2抗体，抗体效价约为1:100~200，随后抗体效价逐渐攀升，首免后第3周血清抗体效价介于1:200~400 ;此时加强免疫一次，之后血清抗体效价迅速升高，在二免后7天抗体效价约为1:400~700，到二免后2周左右血清抗体效价达1:600~900，结果见下表1。
[0055]表1断奶仔猪免疫后抗体产生试验结果
[0056]
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤: 1)PK-15细胞的扩增培养 将2~3X IO5个/ml的PK-15细胞接入到生物反应器中，加入片状载体，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基，搅拌转速为90转/分，溶氧50%，pH7.2，温度37°C，进行细胞悬浮培养，24小时后开启进液泵和出液泵进行流加培养，其中:每接入IL所述PK-15细胞，加入片状载体250g，补充体积百分比为5%的牛血清的DMEM培养基至4~5L ; 2)接种病毒的培养及制备病毒液 所述PK-15细胞在所述生物反应器培养至72小时后排出细胞生长液，将重量百分含量为1%的血清的维持液接入所述生物反应器内，接入圆环病毒(YZ株)F15代种毒，病毒接种量为400nmL，病毒维持液添加终浓度为2mmol/L的D-氨基葡萄糖，将pH调整为7.4，温度设定为36.5°C，培养至24小时开始收获毒液并同时补充新鲜维持液，继续培养至病毒接种后240小时，其中:所述步骤I)中每接入IL所述PK-15细胞，每天灌注量为15L ； 3)病毒浓缩、灭活及制成疫苗产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于:所述生物反应器为续灌注式生物反应器。
3.根据权利要求1所述的制备方法，在所述步骤I)之前确定的PK-15细胞培养圆环病毒的生物反应器培养条件为:将2 ~3X IO5个/ml的PK-15细胞接入到所述生物反应器内，选用片状载体，搅拌转速为90转/分，溶氧为50%，pH为7.2，温度为37°C，进行细胞悬浮培养，24小时后开始流加灌注培养，至312小时培养结束，其中所述生物反应器为连续灌注式生物反应器。
4.根据权利要求1所述的制备方法，所述步骤3)包括乳化，乳化后制得PCV-2(YZ株)水包油包水剂型灭活疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，所述乳化的方法为:将佐剂与合格的灭活抗原等量混合于乳化缸内，低速搅拌乳化30分钟。
6.根据权利要求5所述的制备方法,取乳化后的试剂5~IOmL,以3000r/min离心15分钟，如有分层现象，重复乳化。
7.根据权利要求1至6任一所述的猪圆环2型灭活疫苗的制备方法所制得的疫苗产品。
【文档编号】A61K39/12GK103623402SQ201310618744
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】范娟, 李群, 刘俊斌, 钱钟, 宋庆庆 申请人:扬州优邦生物制药有限公司