覆盆子提取物及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药开发利用领域，具体涉及覆盆子开发利用。本发明提取物包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分任一部分；提取物具有预防、治疗抗老年痴呆作用。原料来自绿色植物，具有广阔的开发空间及应用前景。
【专利说明】覆盆子提取物及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药开发利用领域，具体设计覆盆子开发利用。
【背景技术】
[0002]进入21世纪，老龄化社会正在悄然来临，我国于1999年末成为老年型国家，而且我国老年人口以3%的速度增长。在老年人中疾病的排列顺序是心脏病、肿瘤、脑血管病，第四位是老年性痴呆。据估计，在65岁以上的老年人中，有10%患有轻度和中度痴呆。4-5%患有严重痴呆，85岁以上的老人这个比例超过15%。有专家预言，老年性痴呆将是21世纪人类第一杀手，目前全球的老年性痴呆病人估计在2000-2500万。美国超过400万，中国已超过500万。痴呆给病人、家庭和社会带来诸多方面的危害，如个人生活质量下降，治疗药物、医疗、护理照料费用，由于病人的精神症状、行为和人格障碍给社会和他人带来损失。在美国老年性痴呆(Alzheimer’ s disease, AD)的费用仅次于心脏病和肿瘤而居第三位,在1994年为830亿。我国虽然没有对AD病人费用统计，每年估计至少花费50亿元。到2050年，我国老年痴呆病人将超过3000万，预计费用将超过I万亿元。痴呆患者不仅对本人极为痛苦，而且对家庭和社会的负担很大，因此，寻找有效药物以延缓、控制AD病情的发展是极为重要的。
[0003]迄今，现代医学尚无能终止或逆转老年性痴呆病理改变而起到根本治疗作用的疗法。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的问题，本发明提供了一种覆盆子提取物，及其在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。·
[0005]本发明具体方案如下:
覆盆子提取物，包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分；
所述水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步骤提
取:
1、取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液；
聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上DlOl大孔树脂，用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液；聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上DlOl大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液；
4、步骤2)氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3)乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分；该部分主要成分为留醇和萜类成分；将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮洗脱部分，该为部分主要成分为鞣质和黄酮聚合物。
[0006]取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分；该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分，该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
本发明还涉及上述提取物在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。
[0007]本发明提取物来自植物成分覆盆子，具有良好的抑制老年痴呆的作用。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1 HE染色照片
A空白组海马CAl区HEX400 B模型组海马CAl区HEX400 C脑复康组海马CAl区HE X 400 D水洗高剂量组海马CAl区HE X 400 E水洗低剂量组海马CAl区HEX 400 F氯仿高剂量组海马CAl区HEX400 G氯仿低剂量组海马CAl区HEX400 H丙酮高剂量组海马CAl区HEX400 I丙酮低剂量组海马CAl区HEX400 J乙酸乙酯高剂量组海马CAl区HEX400 K乙酸乙酯低剂量组海马CAl区HEX400。
[0009]图2免疫组化照片`
L 空白组 Pser404_tauX400 M 模型组 Pser404_tauX400 N 脑复康组Pser404-tau X 400 O 水洗高剂量组 Pser404_tau X 400 P 水洗高剂量组 Pser404_tauX400Q丙酮高剂量组Pser404-tauX400 R丙酮低剂量组Pser404-tauX400 S氯仿高剂量组Pser404_tau X 400 T氯仿低剂量组Pser404_tau X 400 U乙酸乙酯高剂量组Pser404-tau X 400 V 乙酸乙酯低剂量组 Pser404_tauX400。
【具体实施方式】
[0010]实施例1覆盆子提取物制备
1、取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏；
2、氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液；
聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上DlOl大孔树脂，用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液；
3、乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液；聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液；
聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上DlOl大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液；
4、水洗部分:步骤2)氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3)乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分；该部分主要成分为留醇和萜类成分；
丙酮洗脱部分:将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮部分，该为部分主要成分为鞣质和黄酮聚合物；
氯仿部分:取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分；该部分主要成分为黄酮和酚酸类；
乙酸乙酯部分:取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分，该部分主要成分为黄酮和酚酸类。 [0011]实施例2覆盆子提取物对肾阳虚型老年性痴呆大鼠海马CAl区形态学及tau蛋白过度磷酸化的影响实验
兔抗Pser404-tau试剂盒，Abgent公司产品；兔SP检测试剂盒,北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为11137A10 ;DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号为911882A。
[0012]I实验方法
1.1造模与给药
SD大鼠120只，雄性，SPF级，体重180-220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号为SCXK(湘)2009-0004。实验动物适应I周后，Morris水迷宫实验筛选动物，剔除10只后(剔除离群，在逃避潜伏期内总是找不到平台的大鼠)，随机分成11组:空白组、模型组、脑复康组、覆盆子水洗高剂量组、水洗低剂量组、丙酮洗脱高剂量组、丙酮洗脱低剂量组、氯仿醇洗高剂量组、氯仿醇洗低剂量组、乙酸乙酯提取高剂量组、乙酸乙酯提取低剂量组，每组10只。每天观察记录动物的一般情况，每5天称体重一次，观察体重变化情况。
[0013]空白组腹腔注射生理盐水(0.5ml/100g)，其余各组均腹腔注射D-半乳糖(125mg/kg)，连续6周，造成亚急性衰老模型。然后空白组和模型组灌胃生理盐水(lml/100g )，脑复康(西药单一成分:吡拉西坦)组(0.4g/100g.d)预防性灌胃脑复康混悬液；
各给药组灌胃覆盆子提取物，取实施例1覆盆子水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分，所得计量以覆盆子原药材计，分别分为高剂量组和低剂量组。高剂量各组均预防性灌胃2.4g/100g.d，低剂量各组均预防性灌胃1.2g/100g.d，连续4周。
[0014]灌胃最后2周，采用氢化可的松混悬液给大鼠肌肉注射(25mg/kg)造成肾阳虚模型，造模完成后进行历时6天的Morris水迷宫实验。
[0015]1.2脑标本处理
心脏取血后直视下将输液针刺入左心室至升主动脉，同时剪开右心耳，用0.9%温生理盐水250ml灌注至肝脏完全变白，右心室流出澄清液体后，右脑快速取出放预冷的4%多聚甲醛固定24h，乙醇系列脱水，二甲苯透明，常规石蜡包埋，切片厚2-4μπι，连续切片，每5张取一张，分别进行HE染色和免疫组化染色。光镜下每张切片计数3个视野(400X)的细胞，总和除以3作为该大鼠的细胞计数。
[0016]1.3形态学检测
HE染色:⑴烤片30min_lh “2)二甲苯I IOmin ;(3)二甲苯II IOmin ;⑷无水乙醇I 3min ；
(5)无水乙醇 II 3min ；(6) 95% 乙醇 I 3min ；(7) 95% 乙醇 II 3min ；(8) 75% 乙醇 3min ;(9)自来水洗去乙醇几秒；(1Φ苏木精染色5min ;(11)自来水泛蓝30min ;(12)伊红10-30秒；(13) 95%乙醇I过；(14) 95%乙醇II过；(15)无水乙醇I 3min ;(16)无水乙醇II 3min ;(17)干燥；(18)二甲苯I 2min ；(19)二甲苯II 2min ;?)干燥，中性树胶封片。
[0017]1.4免疫组化染色法检测海马CAl区Pser404_tau阳性细胞的表达
⑴58°C烤片1.5h ;⑵常规脱腊至水:二甲苯I lOmin—二甲苯II IOmin —无水乙醇I 5min —无水乙醇 II 5min — 95% 乙醇 I 3min — 95% 乙醇 II 3min — 80% 乙醇 3min —双蒸水3minX3次；⑶抗原修复:高压锅煮沸后修复lOmin，PBS冲洗3minX3次；⑷滴加3%H202去离子水37°C孵育lOmin，消除内源性过氧化物酶活性，PBS冲洗3minX3次；(5)滴加封闭用正常山羊血清工作液37°C孵育15min，倾去，勿洗；(6)滴加一抗工作液，4°C过夜；
(7)37°C复温45min，PBS冲洗5minX3次；⑶滴加生物素化山羊抗兔二抗工作液，37°C孵育15min，PBS冲洗5minX3次；(9)滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37°C孵育15min，PBS冲洗5minX3次；(W)二氨基联苯胺(DAB)显色5min,自来水冲洗30min ;(11)苏木精复染5min,自来水冲洗20min ;02)脱水透明:95%乙醇I (过)一95%乙醇II (过)一无水乙醇I 3min —无水乙醇II 3min —干燥一二甲苯I 2min — 二甲苯II 2min —干燥一中性树胶封片。
[0018]2统计学处理
所有数据用f 表示，使用SPSSl1.5软件进行单因素方差分析，组间用LSD法。
[0019]3 结果
3.1海马CAl区HE染色结果
结果见表1及图1。正常组:大鼠海马形态完整，细胞排列致密整齐，形态正常，细胞结构正常，核仁清晰，神经元细胞数量多。
[0020]模型组:大鼠海马形态破碎，结构异常，细胞变形，空泡坏死，胞核固缩，核深染，神经元细胞数量明显减少。
[0021]给药组:相比较模型组而言，除水洗低剂量和氯仿低剂量，各给药组大鼠海马神经细胞形态均有不同程度的恢复。神经元细胞数量比模型组多，染色较正常，排列较整齐，结构较正常，分布较均匀。
[0022]表1覆盆子活性成分对肾阳虚型老年性痴呆大鼠海马CAl区细胞总数、
【权利要求】
1.覆盆子提取物，其特征在于包括水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分任一部分； 所述水洗部分、丙酮洗脱部分、氯仿部分、乙酸乙酯部分、正丁醇部分依照下列步骤提取: 1)取覆盆子药材粉碎，用75%乙醇渗漉到基本无色，分别用氯仿、乙酸乙酯萃取，回收溶剂后，分别得氯仿部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏； 2)氯仿部位浸膏用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱后，收集水洗脱液即氯仿部位水洗脱液； 聚酰胺柱水洗脱后，再用乙醇洗脱，收集洗脱液得氯仿部位乙醇洗脱液； 聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，洗脱液用4mol/L盐酸中和pH至中性后，上大孔树脂，用丙酮洗脱优选用70%丙酮洗脱，收集洗脱液得氯仿部位丙酮洗脱液； 3)乙酸乙酯部位浸膏，用甲醇溶解，上已用水湿法装柱的聚酰胺柱，水洗脱，收集水洗脱液得乙酸乙酯部位水洗脱液； 聚酰胺柱水洗后，用乙醇洗脱，收集洗脱液得乙酸乙酯部位乙醇洗脱液； 聚酰胺柱再用氨水甲醇液洗脱，将洗脱液用4mol/L盐酸中和至中性，上大孔树脂，70%丙酮洗脱，以除去无机盐，得乙酸乙酯部位丙酮洗脱液； 4)取步骤2)氯仿部位水洗脱液浸膏与步骤3)乙酸乙酯部位水洗液合并，减压浓缩，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得水洗部分； 取氯仿部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得氯仿部分； 将氯仿部位丙酮洗脱液与乙酸乙酯部位丙酮洗脱液合并，回收丙酮后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得丙酮洗脱部分； 取乙酸乙酯部位乙醇洗脱液，回收乙醇后，使其浓度相当于每毫升浸膏含药材重2g，得乙酸乙酯部分。
2.如权利要求1所述覆盆子提取物，其特征在于所述步骤2)和3)中大孔树脂为DlOl大孔树脂。
3.权利要求1所述覆盆子提取物在制备预防、治疗抗老年痴呆药物中的应用。
【文档编号】A61K36/73GK103623082SQ201310624223
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】谢一辉, 黄丽萍, 樊浩, 张雨恬, 龚嘉华, 练波 申请人:江西中医药大学