一种具抗病毒功效的络新妇属蜘蛛有效部位及其制备方法

一种具抗病毒功效的络新妇属蜘蛛有效部位及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种具抗病毒功效的络新妇属蜘蛛有效部位及其制备方法。具体而言，本发明涉及络新妇属蜘蛛提取物有效部位在制备抑制疱疹病毒感染的药物中的应用。该有效部位由粉碎或未粉碎的蜘蛛目络新妇亚科络新妇属（Nephila?spp.）虫体用溶剂提取、浓缩提取回收溶剂、大孔吸附树脂柱层析、水洗、醇水溶液梯度洗脱方法纯化；得到的有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，粉碎而得。本发明人经实验发现，该有效部位具有抑制单纯疱疹病毒HSV-1的功效，可以预期用于治疗单纯疱疹病毒引发的病毒感染和/或口腔溃疡疾病。
【专利说明】一种具抗病毒功效的络新妇属蜘蛛有效部位及其制备方法

【技术领域】
[0001]本发明涉及医药【技术领域】，具体而言，具体而言，本发明涉及一种抑制单纯疱疹病毒感染活性的络新妇属蜘蛛提取物有效部位及其制备方法和医药用途。
技术背景
[0002]单纯疱疹病毒在全球广泛流行，人类是其唯一宿主。其直径约为120~150微米，含有DNA的核位于中间，向外依次由包膜、体被、衣壳三种同心结构组成,衣壳表面为162个壳微粒组成的3:3:2轴对称的20面体，在低温下可生存数月，湿热50°C及干燥90°C 30分钟灭活。单纯疱疹病毒可分为I型和II型二种，I型疱疹病毒(HSV-1)主要感染腰以上部位的皮肤粘膜和器官，HSV-1主要通过呼吸道、皮肤和粘膜密切接触传播，99%的口唇粘膜、鼻前庭、眼结膜、咽喉部的炎症及疱疹，口和口周围发生的疱疹都是由I型疱疹病毒感染引起的。在发达国家如美国其感染率分别为儿童期(20-40%)和成年期(50-70%)。
[0003]单纯疱疹病毒感染及其导致的口腔溃疡易反复发作，目前尚无特效治疗方法，临床上主要的治疗措施包括局部治疗和全身治疗，西医治疗以局部用碘甘油及维生素B1、B2和维生素C 口服，一般疗效不甚明显。严重、顽固的口腔溃疡则需内服激素类药品、抗菌素类药品等，使用此类药物又存在较大的毒副作用和易使病人产生耐药性和菌群失调的不足之处。如目前临床常用的单纯疱疹病毒感染治疗药物无环鸟苷即阿昔络韦，主要适用于病毒复制的原发性感染和复发性感染，对潜伏感染难以发挥作用。
[0004]中药对抗单纯疱疹病毒感染所用之外用药包括锡类散、冰硼散等外用制剂，但治疗效果不十分理想；内服药包括牛黄解毒丸、牛黄上清丸等，又对本病症无显著的针对性。近期出现的不少新的口腔含片类药物制剂如西瓜霜含片、华素片和溶菌酶含片等分别在口感、杀菌、抗炎方面有所进步。但是有些又不适于哺乳期妇女、甲状腺功能亢进患者和碘过敏者。
[0005]因此，应用现代病毒药理学技术，开发出新的抗HSV-1感染以及治疗口腔溃疡天然药物是十分必要的。避开核苷类抗病毒药物的副作用，寻找创新性的先导化合物骨架，以期开发出新型抗单纯疱疹病毒感染药物或与已上市之抗HSV-1感染药物联用，是本发明的目的。
[0006]近期，随着对生物资源和动物药源的开发越来越取得进展，伴随着中药现代化的进程加快，我国加大对传统中医药资源研究开发的力度，越来越多的动物类药物得到开发和利用。例如以大理学院主持研发的美洲大蠊醇提物纯化制成的产品“康复新”，在烧伤、烫伤等外伤创面的良好疗效。从美洲大蠊醇提物中纯化精制而成的“心脉龙注射液”，具强心升压，改善微循环，兴奋呼吸，利尿，增加心、脑、肺、肾的血流量。“心脉龙注射液”主治:右心衰，也可治急慢性心衰，失血性休克，低血压,室性早博,病窦性综合症,心脑缺血性疾病，为2004年通过SFDA审批的国家二类新药(中药)。上述药物上市后，每年为药物企业带来15亿元的年产值。大理学院云南省药用昆虫和蛛形类资源开发工程实验室暨药用特种昆虫国家地方联合工程研究中心进一步用美洲大蠊中提取分离得到有效部位证实有强效抗病毒作用，已经获得2项授权国家发明专利(戴志明；杨荣新；张成桂；巫秀美；赵昱，一种蟑螂多肽类物质的制备方法及其抗疱疹病毒医药用途，ZL201210137422.4 ;王晓雨、刘光明、宋丽艳、杨雷香、何正春、巫秀美、彭芳、董光平、朱孝慈、赵昱，美洲大蠊有效部位的用途，ZL200810060885.9)。基于上述成果的启发，在对云贵高原的药用昆虫抗病毒活性系列研究过程中，我们对蛛型纲络新妇属动物进行了综合采集、种属鉴定和抗病毒活性药效学研究。
[0007]蜘蛛入药在我国早已有之。《唐本草》云:“主蛇毒，温疟，霍乱，止呕逆”；《日华子本草》云:“冷，无毒；斑蜘蛛治疟疾，疔肿”；《长沙药解》云:“炒枯存性研细用；破瘀消肿”；《本草纲目》云:“主口，脱肛，疔肿，胡臭”;《吉林中草药》云:“治瘰疬，疔疮，蜂、蝎蜇伤”;《中药大辞典》云:“祛风，消肿，解毒。治狐疝偏坠，中风口，小儿慢惊、口噤。疳积；疔肿，瘰疬，疮疡，蜈蚣、蜂、蝎蜇伤”。以上历史记录表明其体内必应具有某些特殊的物质和其特有的作用机制。
[0008]根据相关文献，在针对药物应用方面，“蜘蛛”多为复方中的一味，公开资料中几乎没有蜘蛛作为单方应用于防治单纯疱疹病毒感染相关疾病的报导。用于治疗“口腔疾病”、“口腔溃疡”、“ 口疮”方面的复发有:“一种治疗治疗皮肤溃烂和口腔溃疡的药液及加工工艺”(CN1205945C，王化金)，是用蜈蚣、蜘蛛、蜂王浆和酒精组成的复方；“一种治疗口疮疾病的药物及其制备方法”(ZL201010280462.5，屈广花，杨其伟，李根)，是由明矾、干地龙、无毒蜘蛛、吴茱萸、维生素B2、强的松6味药物组成的中西药复方，其中蜘蛛仅作为配伍用的小量辅助性用药而已。已经公开的其它几个发明专利:(1)CN101972288A，张万荣，“一种治疗口腔疾病的药粉及其制备方法”，是由5种药材组成的复方制剂，用于治疗小儿鹅口疮、糜烂性口腔炎、烂嘴唇、牙周炎、牙痛等口腔疾病；(2) CN1895290A，姚茂龙，“喉净散配方及制作方法”，是由3种药材组成的复方制剂；用于治疗白喉、扁桃体炎；(3)CN1387864A，路明正，“一种治疗口腔溃疡和咽喉疼痛的药及其制备方法”，是由6种药材组成的复方制剂，主要治疗口疮和咽喉疼痛；(4)CN1110146A，王仁学，“一种速效口疮散”，是由5种药材组成的复方制剂；主治各种口腔疾病，兼治一般疔疮疖癣；(5)CN101632690A，闻恪玉，“一种治疗脓毒的药物”，是由7种药材组成的复方制剂；治疗慢性咽炎和口腔炎等症；(6)CN101352463A，海棠，“一种治疗腮腺炎的膏药”，是由5种药材组成的复方制剂；在上述公开资料中，蜘蛛均是作为配伍用的辅助性用药。可见，对于这一丰富的药物资源，前人对其有一定的临床药用知识方面的认识，但是对其抗病毒活性未经系统和科学的研究开发，因此将其作为抗病毒药物方面的科研及应用仍属空白。
[0009]络新妇蛛，Nephila, silk spider,属节肢动物门(Arthropoda)蛛型纲(Arachnida)络新妇亚科络新妇属昆虫，云贵高原州广泛分布。结大型金黄色网，网的直径可达一公尺以上，以拉丝悬于树间；生活在温暖地区。约60种，云南省分布有3种。该属蛛体色艳丽，雌成蛛个体较大，雄蛛小数倍。
[0010]根据《中药大辞典》，其基元是指园网蛛科大腹园网蛛等全虫。动物分类学中，将此属归为圆蛛总科络新妇亚科络新妇属，是云南省优势资源。为明确云贵高原药源广泛分布的络新妇属蜘蛛是否具有抗单纯疱疹病毒活性，及其抗病毒有效部位，指导进一步弄清其中起主要药理作用的物质结构基础，从分子药理学基础上阐明络新妇属蜘蛛多种生物活性的作用机制，发明人对民间习用的络新妇属进行了综合采集和药效学活性研究。本发明使用不同溶剂系统，测试了该生药材的大孔树脂提取物抑制I型单纯疱疹病毒HSV-1的药理活性。试验结果发现:络新妇属蜘蛛提取物有效部位对HSV-1病毒具有较强的抑制活性，可以作为抗HSV-1病毒天然药物进一步深入开发，从而构成本发明。


【发明内容】

[0011]本发明的目的是提供了一种络新妇属蜘蛛具有抑制单纯疱疹病毒活性的有效部位，该有效部位通过以下方法获得:用溶剂提取经粉碎或未粉碎的络新妇属蜘蛛虫体、浓缩提取回收溶剂、大孔吸附树脂柱层析、水洗、醇水溶液梯度洗脱方法纯化；得到的抑制单纯疱疹病毒活性有效部位经减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，粉碎得产品。
[0012]本发明的另一目的是提供了将络新妇属蜘蛛提取物有效部位应用于制备抑制单纯疱疹病毒感染的药物中的用途。
[0013]本发明的再一目的是提供了一种络新妇属蜘蛛提取物有效部位在制备治疗口腔溃疡的药物中的用途。
[0014]本发明的又一目的是提供了一种防治由单纯疱疹病毒引发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的络新妇属蜘蛛提取物有效部位和可药用辅料。其制剂形式包括散剂、口服液、喷雾剂、冲剂、贴膜、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、透皮吸收制剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂，及其控释或缓释剂型或纳米制剂。
[0015]本发明中提供络新妇属蜘蛛提取物有效部位的动物药材可以选用络新妇属蜘蛛虫体的任一部位，或它们的混合物。可以是干燥全虫，也可以是未经干燥的全虫或活体全虫。
[0016]至今为止，以往文献中并未发现有以本发明的工艺对络新妇属蜘蛛进行提取的文献报道，本大孔树脂提取法精制纯化得到的多肽类物质具有意想不到的新的药效活性效果。并且，迄今为止，中外文献并无针对云南采集到的络新妇属蜘蛛进行针对I型单纯疱疹病毒HSV-1抑制活性研究的报道，本针对性的研究尚属首次，其具有显著的抑制体外培养HSV-1生长的活性也属于意想不到的结果，因而可以预期进一步开发成为治疗单纯疱疹病毒疾病的药物或药物组合物。由此完成了本发明。
[0017]本发明的有益之处在于:首次用大孔树脂分离材料制备出络新妇属蜘蛛提取物有效部位，并首次发现了其在开发防治HSV-1病毒感染药物领域中的潜力，对于开发抑制单纯疱疹病毒或治疗口腔溃疡创新型药物提供了新的物质基础。本发明再一特点是:该属蜘蛛生长繁殖能力旺盛，在云贵高原广泛分布，便于养殖，每头雌蛛每年可以孵育600-800只子代，有利于成为稳定的生物药物资源，同时也有利于贫困山区农民养殖此类药源性动物达到脱贫目的。具有潜在的巨大社会效益和经济效益。该药物原料来源于天然养殖，制备步骤简便，成本低，污染小，利于大规模生产。
具体实施方案
[0018]为了更好地理解本发明的实质，下面分别用该类络新妇属蜘蛛经大孔吸附树脂柱层析精致纯化过程，以及得到的络新妇属蜘蛛提取物有效部位对单纯疱疹病毒HSV-1生长的抑制作用实验结果，说明其在抗病毒药物研究领域中的新用途。
[0019]必须说明的是:本发明的制备及实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0020]实施例1:用D-101大孔吸附树脂富集斑络新妇有效部位
[0021]1.1斑络新妇醇提物的制备
[0022]新鲜捕捉到的斑络新妇蜘蛛250头(采自思茅地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为斑络新妇Nephila piIipesFabricius)，先浸入温度为5°C的90%甲醇水溶液中半小时，取出在组织匀浆机下匀浆，虫体匀浆以75%甲醇水溶液150毫升，于10°C下浸泡提取3次，每次4小时。过滤出提取液，合并提取液，在10°C下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得斑络新妇甲醇水溶液提取物。
[0023]1.2D - 101大孔吸附树脂柱层析制备斑络新妇提取物有效部位
[0024]斑络新妇甲醇水溶液提取物1.0克，用2克D - 101大孔吸附树脂吸附拌样，上25克D - 101大孔吸附树脂柱(柱内直径15毫米，高度25毫米)，先用双蒸水150毫升洗脱，续用30%乙醇-水溶液150毫升洗脱；续用65%乙醇-水溶液200毫升洗脱，取65%乙醇-水溶液洗脱液100毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得斑络新妇提取物有效部位49.0晕克。
[0025]实施例2:用D-101大孔吸附树脂富集棒络新妇有效部位
[0026]2.1棒络新妇乙醇水溶液提取物的制备
[0027]将捕捉到的棒络新妇蜘蛛160头(采自大理地区，活体标本由大理学院云南省药用昆虫及蛛形类资源利用开发工程实验室杨自忠教授鉴定为棒络新妇Nephila clavataL.Koch)，用沸水烫死，之后晒干，研钵磨粉，虫体粉以70%乙醇水溶液50毫升，于75°C下加热提取3次，每次I小时。过滤出提取液，合并提取液，在10°C下减压浓缩至干，真空冷冻干燥，即得棒络新妇乙醇水提取物。
[0028]2.2D - 101大孔吸附树脂柱层析制备棒络新妇提取物有效部位
[0029]棒络新妇甲醇水溶液提取物0.5克，用2克D - 101大孔吸附树脂吸附拌样，上25克D - 101大孔吸附树脂柱(柱内直径15，高度25)，先用双蒸水100毫升洗脱，续用25%乙醇-水溶液100毫升洗脱；续用65%乙醇-水溶液200毫升洗脱，取70%乙醇-水溶液洗脱液100毫升减压浓缩至干，冷冻真空干燥，即得棒络新妇提取物有效部位21.6毫克。
[0030]本发明中制备得到的络新妇属蜘蛛提取物有效部位原料药用制药领域中的常规方法，结合中、西药制药中常规的可药用辅料，可以制成各种药物组合物，如散剂、口服液、喷雾剂、冲剂、贴膜、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、透皮吸收制剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂，或上述剂型的控释或缓释剂型或纳米制剂。这些药物组合物可以用于预防或/和治疗由单纯疱疹病毒HSV-1引发的病毒感染和/或口腔溃疡。
[0031]本发明所涉及的络新妇属蜘蛛提取物有效部位及其药物组合物和各种制剂还可以与现已上市的治疗单纯疱疹病毒感染、口腔溃疡的常用药物联合或交叉使用，制备得到具有治疗单纯疱疹病毒感染、口腔溃疡的组合物或复方制剂。可组合的药剂例子包括阿昔络韦ACV及其衍生物VCV、FCV、泛昔络韦PCV、阿糖腺苷(ara-T)、溴乙烯去氧鸟苷(BVDU)、膦甲酸(PFA)、更昔络韦(GCV)等。此外，其还可以与神经痛镇痛药物以及解热镇痛药物合并用药。
[0032]下面通过药理相关实施例的方式说明该类经大孔吸附树脂柱层析后的斑络新妇提取物有效部位和棒络新妇提取物有效部位冻干粉原料对I型单纯疱疹病毒抑制作用的药理实验结果。实验结果说明其在抑制I型单纯疱疹病毒感染和防治口腔溃疡的药物研究领域中的用途。药理实施例给出了代表性有效部位的部分活性数据。同样必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0033]药理实施例1:采用MTT法测定斑络新妇提取物有效部位对Vero细胞的细胞毒性，以及用微量细胞病变抑制(CPE)法研究斑络新妇提取物有效部位对HSV-1的抑制作用试验
[0034]1.1实验材料与样品
[0035]1.1.1病毒:单纯抱疫病毒-1型(Herpes simplex virus-l, HSV-1),大理学院基础医学院微生物与免疫教研室提供。
[0036]1.1.2细胞:Vero细胞购自中国科学院上海细胞库。细胞用含10%小牛血清得RPMI1640培养基培养，维持液为含1.0%小牛血清的RPMI1640培养基。
[0037]1.1.3 试剂:
[0038]1.1.3.1RPMI1640 培养基购自 Gibco 公司；
[0039]1.1.3.2MTT =Amresco公司产品，上海生工生物工程技术服务公司分装；
[0040]1.1.3.3小牛血清:杭州四季青生物工程有限公司；
[0041]1.1.3.4青霉素: 石家庄制药集团有限公司；
[0042]1.1.3.5链霉素:石家庄制药集团有限公司；
[0043]1.1.3.6细胞消化液:含0.25%胰蛋白酶，0.02%EDTA_Na2，用Hank，s液配制；
[0044]1.1.3.7阿昔络韦:湖北科益药业股份有限公司，0.25克/支。
[0045]1.1.4 仪器:
[0046]1.1.4.1CO2 培养箱:2306-2 型，Shellab 公司；
[0047]1.1.4.2倒置显微镜:XD_2型，重庆光电仪器有限公司；
[0048]1.1.4.3 生物安全柜:A/B3 型，Labconco 公司；
[0049]1.1.4.4 酶标仪:Synergy-HT 型，B1-TEK 公司；
[0050]1.1.4.5立式自动电热压力蒸汽灭菌器:LDZX-40BI型，上海申安医疗器材厂；
[0051]1.1.4.6紫外分光光度计:UV-1201型，北京瑞利分析仪器公司；
[0052]1.1.4.7 除菌过滤器:Sterifil500 型，Millipore 公司；
[0053]1.1.4.8超纯水系统:UPWS-1_60D型，杭州永洁达净化科技有限公司。
[0054]1.2细胞培养和病毒传代:
[0055]将Ve1细胞培养于含10%灭活小牛血清，10U/毫升青霉素和100微克/毫升的RPMI1640培养基中，置37°C，5% 二氧化碳，100%相对湿度的培养箱中培养。将HSV-1加入长有单层Vero细胞的细胞瓶中，置37°C，5 %二氧化碳，100 %相对湿度的培养箱中培养，收集培养上清，置低温下保存。
[0056]1.3实验方法:
[0057]1.3.1采用MTT [3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐]法测定斑络新妇提取物有效部位对Vero细胞生长的抑制作用:
[0058](I)测试药物:实施例1制备得到的斑络新妇提取物有效部位；阿昔洛韦(ACV)为阳性对照药物。
[0059](2)取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成IXlO5/毫升，接种于96孔细胞培养板，每孔100微升，在37°C，5%二氧化碳，100%相对湿度的培养箱中培养24小时后加入用培养基稀释的斑络新妇提取物有效部位，浓度分别为800微克/毫升，400微克/毫升，200微克/毫升和40微克/毫升,置于培养箱中培养,培养72小时后,每孔加入MTT试剂10微升，继续培养4小时，弃去培养基，每孔加入二甲亚砜200微升，用振荡器振荡20分钟，在570nm波长下用酶标仪测定OD值。以只加培养基的培养孔为对照孔。
[0060]抑制率(%)=(对照孔OD值-实验组OD值)/对照孔OD值X 100%。
[0061]实验重复三次。根据不同浓度下对细胞生长的抑制率，计算对细胞生长的半数抑制浓度(TD50)。
[0062]1.3.2用微量细胞病变抑制法测定样品对病毒生长抑制作用:取对数生长期的Vero细胞，用培养基将细胞稀释成I X 15/毫升，接种于96孔细胞培养板，37°C，5 %二氧化碳，100%相对湿度培养24小时，加入10TCId50的病毒100微升，倾出病毒，分别加入不同浓度的斑络新妇提取物有效部位，同时设正常细胞对照和病毒感染对照，37°C，5%二氧化碳，100%相对湿度培养48小时后在倒置显微镜下观察细胞病变。以五级标准作为判断细胞病变的标准；一:细胞无变化，分值为 8分；+:25 %以下细胞出现病变，分值为6分；++:25%~50%细胞出现病变，分值为4分；+ + +:50%~75%细胞出现病变，分值为2分；+ + + +:75%以上细胞出现病变，分值为O分。计算半数抑制浓度(IC5tl)。同时用阿昔洛韦作为阳性对照药。
[0063]计算样品治疗指数:TI =半数中毒浓度(TD5tl) /半数抑制浓度(IC5(I)。
[0064]1.4实验结果:
[0065]结果如表一显示，斑络新妇提取物有效部位能确切抑制HSV-1的复制，其对HSV-1的半数抑制浓度和治疗指数如表所示。
[0066]表一.斑络新妇提取物有效部位对HSV-1的抑制作用
[0067]

【权利要求】
1.一种络新妇属蜘蛛提取物有效部位，其特征是:该有效部位是用溶剂提取经粉碎或未粉碎的络新妇属蜘蛛虫体、浓缩提取回收溶剂、大孔吸附树脂柱层析、水洗、醇水溶液梯度洗脱方法纯化，减压浓缩至无醇味、减压浓缩或冷冻干燥，粉碎而得；其中大孔吸附树脂柱层析所用材料是D-1Ol大孔吸附树脂。
2.权利要求1所述的络新妇属蜘蛛提取物有效部位在制备抑制疱疹病毒感染的药物中的应用。
3.权利要求1所述的络新妇属蜘蛛提取物有效部位在制备抑制I型单纯疱疹病毒HSV-1感染的药物中的应用。
4.权利要求1所述的络新妇属蜘蛛提取物有效部位在制备治疗口腔溃疡的药物中的应用。
5.根据权利要求1的络新妇属蜘蛛提取物有效部位，其特征是:络新妇属蜘蛛虫体是指络新妇属蜘蛛虫体的任一部位，或它们的混合物。
6.根据权利要求1的络新妇属蜘蛛提取物有效部位，其特征是:络新妇属蜘蛛虫体是指络新妇属蜘蛛干燥全虫、未经干燥的全虫或活体全虫。
7.一种用于防治由单纯疱疹病毒引发的病毒感染和/或口腔溃疡的药物或药物组合物，其含有治疗有效量的络新妇属蜘蛛提取物有效部位和可药用辅料。
8.根据权利要求7的药物组合物，其制剂形式是散剂、口服液、喷雾剂、冲剂、贴膜、注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、栓剂、透皮吸收制剂、滴丸剂、外用搽剂、软膏剂。
【文档编号】A61P31/22GK104042632SQ201310625000
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年12月1日 优先权日:2013年12月1日
【发明者】杨自忠, 朱振东, 马艳滟, 张成桂, 赵昱 申请人:大理学院