一种竹节参皂苷及其制备方法与用途
【专利摘要】本发明涉及一种用作疫苗佐剂的竹节参皂苷及其制备方法与它的用途，该方法包括竹节参提取、萃取分离与树脂吸附等步骤。本发明把竹节参总皂苷进一步分离纯化，改进以往只用总皂苷成分并未对其主要成分进行研究的缺点，本发明正是以此为出发点，解决了经常困扰人们不清楚用药成分的问题；本发明中竹节参皂苷活性部位具有非常明显的免疫佐剂作用，为开发新型疫苗佐剂指明了方向。
【专利说明】一种竹节参皂苷及其制备方法与用途
【【技术领域】】
[0001]本发明属于疫苗佐剂【技术领域】。更具体地，本发明涉及一种用作疫苗佐剂的竹节参皂苷，还涉及所述竹节参皂苷的制备方法，还涉及所述竹节参皂苷的用途。
【【背景技术】】
[0002]竹节参系五加科人参属植物竹节参的干燥呈竹鞭状根茎，为我国的名贵特产少常用的中药材之一。竹节参多生长在海拔1000m以上的阔叶疏林阴湿地或岩石、沟涧旁边，对土壤条件要求较高，适宜在中性或微酸性环境中生长，喜腐殖质层厚、疏松肥沃、排水良好的沙壤土。在云南、贵州、四川、湖北、陕西、甘肃、河南、浙江、安徽、江西等省民间有较长的应用历史，还有少量出口香港。有滋补强壮，散瘀止痛，止血祛痰的功效，也是土家族著名民族药，一直被湖北恩施土家族先民奉为“草药之王”。随着现代药理学研究深入，竹节参的主要功效已经逐步地体现在某一类成分，甚至到某种成分上。竹节参的主要有效成分为竹节参皂苷和皂苷类。在现有技术中也记载了竹节参皂苷的制备方法，例如CN101732379A公开了 DlOl大孔吸附树脂富集纯化竹节参总皂苷工艺，它只是介绍了提取工艺；CN102247416A公开了竹节参总皂苷的降血脂作用。未见报道竹节参皂苷用于疫苗佐剂。
[0003]目前，用于人用疫苗的佐剂为铝盐佐剂(主要是氢氧化铝及其磷酸盐，Alum)。铝盐佐剂作为人类疫苗佐剂已使用了几十年，成为人用疫苗中常用的佐剂，具有良好的佐剂效果。随着新型疫苗的不断出现，铝盐佐剂显现出一些问题，其中包括:(I)因其理化性质特点，铝盐疫苗冷冻后胶体状态被破坏，因此不能冷冻干燥和在低温状态下运输，但现在的很多多肽疫苗必须要低温保存。(2)因含盐量高，贮存日久有结晶沉淀，使制备的疫苗稳定性得不到保障。(3)铝盐对人、畜的神经系统可能有影响。(4)在注射部位有时会发生局部无菌性脓肿，甚至可以形成 肉芽肿，轻度局部反应较为常见。(5)对肿瘤疫苗不适合，以铝盐佐剂作疫苗主要适用于以抗体为保护性免疫的疫苗。(6)铝盐佐剂释放抗原物质的速度缓慢，效应也比较弱，对许多可溶性抗原都不够有效，对抗原的要求比较高。因此研究新型疫苗佐剂是制备新型疫苗的重要环节。
[0004]从植物中提取皂苷可以激活哺乳动物的免疫系统，其免疫佐剂活性受到广泛关注。皂苷QS-21是最具代表性的物质，其研究已进入临床试验阶段。皂苷QS-21是南美的植物中提取物皂树皮皂苷(Quil A)的主要成分，研究表明其产生抗体应答持续保护时间要比铝盐佐剂长，因此可以作为铝盐佐剂替代物。但是，Quil A存在严重的毒性，对小鼠的致死量在100-125 μ g，除此还有严重的溶血性，在注射部位可引起肉芽肿和注射部位症状，所以限制了在人用疫苗中的使用。至今，从Quil A中分离得到23种单体化合物。皂昔QS-21对小鼠的致死剂量是500yg，毒性虽小于Quil A，但是它还是仅用于肿瘤疫苗中。而且，皂苷QS-21等分子结构中存在酷键结构影响了其稳定性。因而，人们越来越关注从其它植物中寻找具免疫佐剂活性且毒性相对较低的皂苷。
[0005]本发明竹节参皂苷制备方法对竹节参总皂苷进一步分离纯化，改进以往只用总皂苷成分并未对其主要成分进行研究的缺点，本发明正是以此为出发点，解决了经常困扰人们不清楚用药成分的问题；本发明方法制备得到的竹节参皂苷活性部位具有非常明显的免疫佐剂作用，为开发新型疫苗佐剂指明了方向。
【
【发明内容】
】
[0006][要解决的技术问题]
[0007]本发明的目的是提供一种竹节参皂苷。
[0008]本发明的另一个目的是提供所述竹节参皂苷的制备方法。
[0009]本发明的另一个目的是提供所述竹节参皂苷的用途。
[0010][技术方案]
[0011]本发明是通过下述技术方案实现的。
[0012]本发明涉及一种用作疫苗佐剂的竹节参皂苷的制备方法。
[0013]该制备方法包括如下步骤:
[0014]A、竹节参提取
[0015]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加热回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；
[0016]B、萃取分离
[0017]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:1~4用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着减压浓缩，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物；
[0018]C、树脂吸附
[0019]在树脂柱中，将大孔吸附树脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无乙醇味，接着将大孔吸附树脂浸泡在以重量计4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后将大孔吸附树脂浸泡在以重量计I~3%Na0H水溶液中2~4h，用水洗至中性备用；
[0020]步骤B得到的正丁醇萃取物吸附条件如下:树脂柱的径高比为1:8~12，上样量为0.05~0.15g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在DlOl大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱；
[0021]洗脱条件如下:先用水冲洗至流出液无色,再用体积分数为80~95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为2~4倍柱体积，洗脱流量0.8~1.2mL/min ;得到的洗脱物进行减压浓缩，然后真空干燥，其产物是所述的竹节参皂苷。
[0022]根据本发明的一种优选实施方式，在步骤A中，所述竹节参粉碎粒度是20-40目。
[0023]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，竹节参与乙醇水溶液的重量比是1:8~12。
[0024]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤A中，所述乙醇水溶液的体积分数为62 ~75%。
[0025]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述的减压浓缩是在压力
0.001~0.01MPa下进行的，所述的干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行。[0026]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤B中，所述浓缩液与正丁醇的体积比是 1:1.8 ~3.2。
[0027]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的大孔吸附树脂是DlOl大孔吸附树脂。
[0028]根据本发明的另一种优选实施方式，在步骤C中，所述的减压浓缩是在压力
0.001~0.01MPa下进行的，所述的干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行干燥。
[0029]本发明还涉及采用所述制备方法得到的竹节参皂苷。
[0030]本发明还涉及所述的竹节参皂苷在制备疫苗佐剂中的用途。
[0031 ] 下面将更详细地描述本发明。
[0032]本发明涉及一种用作疫苗佐剂的竹节参皂苷的制备方法。
[0033]该制备方法包括如下步骤:
[0034]A、竹节参提取
[0035]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数为55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加热回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液；
[0036]所述的竹节参原料是目前我国市场上销售的竹节参中药材，例如湖北省恩施州宣恩椿木营竹节参种植基地种植的竹节参。通常，竹节参中药材需要进行常规挑选、清洗、干燥等预处理后，再使用在中药材加工【技术领域】中通常使用的粉碎机对干燥竹节参的进行粉碎，粉碎的竹节参再用标准筛进行筛分，收集20-40目竹节参粉作为本发明方法的处理原料。
[0037]根据本发明，用乙醇处理竹节参的作用在于将竹节参的有效成分皂苷提取出来。
[0038]在本发明中，使用体积分数为55~85%乙醇水溶液浸泡竹节参粉，如果乙醇水溶液的浓度超过85%，则会使皂苷含量降低，且脂溶性色素等杂质含量升高；如果乙醇水溶液的浓度低于55%，则会使皂苷杂质增加；因此，乙醇水溶液的浓度为55~85%是合适的，乙醇水溶液的浓度优选地是60~80%，更优选地是62~75%。
[0039]在用乙醇处理竹节参时，竹节参与乙醇水溶液的重量比优选地是1:6~14，浸泡
2.6~4.5h,更优选地是1:8~12，浸泡3.2~3.8h。
[0040]在这个步骤中，每次加热回流提取时间优选地是1.8~4.2h，更优选地是2.5~
3.6h0
[0041 ] 用乙醇处理竹节参所使用的设备是目前市场上普遍销售的圆底烧瓶(或常规化学处理化工设备)，例如由蜀牛玻璃仪器公司以商品名圆底烧瓶销售的产品。
[0042]用乙醇处理竹节参所使用的加热回流提取设备是目前市场上销售的加热套(或常规加热回流提取化工设备)，例如由巩义市予华仪器有限责任公司以商品名销售的电热套
女口
广叩ο
[0043]根据本发明，在压力0.001~0.01MPa与室温的条件下进行减压浓缩。在减压浓缩时所使用的设备是目前市场上销售的旋转蒸发仪，例如由上海亚荣生化仪器厂公司以商品名RE-52AA型旋转蒸发仪销售的产品。
[0044]B、萃取分离[0045]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:1~4用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着减压浓缩，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物；
[0046]根据本发明，使用正丁醇萃取的目的在于使溶于有机溶剂正丁醇的皂苷萃取出来。
[0047]在本发明中，所述浓缩液与正丁醇的体积比优选地是1:1.8~3.2，更优选地是1:2.2 ~2.8。
[0048]在本发明中，在用正丁醇萃取时，让在萃取设备中的正丁醇与所述浓缩液充分混合，在这种混合过程中，所述浓缩液的有效成分在两相之间进行分配，即从所述浓缩液转移到正丁醇中，从而实现有效成分的分离。
[0049]在本发明中用正丁醇萃取时所使用的设备是目前市场上销售的分液漏斗(或常规萃取化工设备)，例如由四川蜀牛玻璃仪器公司以商品名分液漏斗销售的产品。
[0050]所述正丁醇相无色应该理解是在用正丁醇萃取所述浓缩液后，萃取后的正丁醇用眼观察是没有颜色的，或者是几乎没有颜色的。
[0051 ] 在这个步骤中，所述的减压浓缩如前面所述，在此不再赘述。
[0052]所述的干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行。本发明使用的干燥设备是目前市场上销售的，例如由上海一恒科学仪器有限公司以商品名真空干燥箱销售的产品。
[0053]C、树脂吸附
[0054]大孔吸附树脂预处理:在树脂柱中，将大孔吸附树脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脱至流出液不浑浊，`再用水洗至无乙醇味，接着将大孔吸附树脂浸泡在以重量计4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后将大孔吸附树脂浸泡在以重量计I~3%Na0H水溶液中2~4h，用水洗至中性备用；
[0055]步骤B得到的正丁醇萃取物吸附条件如下:树脂柱的径高比为1:8~12，上样量为0.05~0.15g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜，在DlOl大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱；
[0056]洗脱条件如下:先用水冲洗至流出液无色,再用体积分数为80~95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为2~4倍柱体积，洗脱流量0.8~1.2mL/min ；
[0057]得到的洗脱物进行减压浓缩，然后真空干燥，其产物是所述的竹节参皂苷。
[0058]大孔树脂是由聚合单体和交联剂、致孔剂、分散剂等添加剂经聚合反应制备而成。在聚合物形成后，致孔剂被除去，在树脂中留下了大量孔穴。因此，大孔树脂在干燥状态下其内部具有较高的孔隙率，且孔径较大(100~lOOOnm)。大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，以吸附为特点。它是一种不溶于酸、碱及各种有机溶剂的有机高分子聚合物。
[0059]本发明使用的大孔吸附树脂是DlOl大孔吸附树脂，例如是由上海紫一试剂公司以商品名DlOl大孔吸附树脂销售的产品。
[0060]由于DlOl大孔吸附树脂含有一些杂质，因此需要进行如下预处理:
[0061]DlOl大孔吸附树脂预处理:将DlOl大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱2-4h，用水洗至中性，然后用以重量计2%NaOH浸泡树脂柱2-4h，水洗至中性备用。
[0062]在本发明中，使用乙醇浸泡DlOl大孔吸附树脂目的是除去树脂上吸附的醇溶性杂质；使用5%HCL浸泡树脂的目的是为了让树脂上吸附的碱性成分变成盐而冲洗出去；使用2%Na0H浸泡树脂的目的是为了让树脂上吸附的酸性成分变成盐而冲洗出去；水洗至中性的目的是除去冲洗是残留的酸、碱及生成的盐类成分。
[0063]DlOl大孔吸附树脂吸附条件如下: [0064]柱径高比为1:10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜。在本发明中，填充大孔吸附树脂的径高比为1:10，是为了保持合适的流速。上样量选择为0.1g生药/毫升柱体积，如果过低，死吸附严重，影响皂苷得率；如果上样量过大，会造成过载，影响分离质量。上样后静置过夜，是为了让皂苷与大孔吸附树脂充分吸附。
[0065]DlOl大孔吸附树脂洗脱条件如下:
[0066]洗脱条件为:先用水冲洗至流出液无色,再用体积分数为80-95%的乙醇水溶液，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量均为lmL/min。
[0067]本发明中，首先使用水冲洗至流出液无色，目的是洗去与大孔吸附树脂吸附能力较弱的皂苷类杂质。再用体积分数为80-95%的乙醇水溶液洗脱较适宜，因为如果使用乙醇水溶液小于80%，则极性较小，洗脱能力较弱，对于皂苷的洗脱不完全；如果选择乙醇的浓度大于95%，则效果与95%乙醇没有明显差异，且配制较困难。更优选地为乙醇体积分数为88-92%。
[0068]在这个步骤中，所述的减压浓缩与真空干燥与步骤B相同，不再赘述。
[0069]采用本发明方法制备得到的竹节参皂苷进行了 HPLC分析，其HPLC分析条件如下:
[0070]色谱柱:YMC-packODS-AQ 柱(250 X 4.6mm，粒径 5 μ m);
[0071]流动相:乙腈(A) -0.4%磷酸水溶液(B)；
[0072]柱温:30°C；
[0073]洗脱方式:梯度洗脱(O~5min，5~5%A ；5~20min，5~30%A ；20~30min，30~30%A ；30 ~50min, 30 ~85%A ；50 ~60min, 85 ~85%A)；
[0074]检测波长:203nm;进样量:10 μ I ;流速:1.0ml.min_l。
[0075]紫外检测器；氮气压力为33Ps ;漂移管温度40°C。
[0076]采用本发明方法制备得到的竹节参皂苷的HPLC图谱列于附图1中。从图中可以看出，在保留时间为37min-39min共出现四个较大的色谱峰，本发明人对以上四个色谱峰进行了结构鉴定，将四个色谱峰所对应的成分按照从前到后的顺序分别定义为化合物1、化合物2、化合物3及化合物4，采用1H-NMRj3C-NMR方法对所述四种化合物进行了鉴定，其鉴定结果如下:
[0077]化合物1:白色粉末，ES1-MS m/z:955 [Μ-Η1。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.34 (1Η,d, J=7.8Hz, Glc-H-1 ),5.42 (lH,br s，H_12)，5.41 (1H，s，Glc-H-l )，5.02 (1H，d，J=6.6Hz，GlcA-H-1) ,3.28 (1H, dd, J=Il.4,4.2Hz, H_3)，3.18 (1H, dd, J=13.2,2.4Hz, H-18)，1.28，1.26，1.11，1.09,0.91,0.88,0.83 (each3H, s, 7 X CH3)。
[0078]根据化合物I的1H-NMRj3C-NMR数据，鉴定化合物I为竹节参皂苷V。
[0079]化合物2:白色粉末，ES1-MS m/z:925 [Μ-Η1。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l ),5.42 (1H, br s，H_12)，5.28 (1H, d, J=6.0Hz，xyl—H—l )，4.99 (1H，d, J=3.0Hz, GlcA-H-1) ,3.29 (1H, br d, J=8.4Hz, H_3)，3.20 (1H, br d, J=I0.8Hz, H-18),1.29 (6H, s, 2 X CH3)，1.10，1.10,0.92,0.89,0.85 (each3H, s, 5 X CH3)。
[0080]根据化合物2的1H-NMRj3C-NMR数据，鉴定化合物2为pjs_2。
[0081]化合物3:白色粉末，ES1-MS m/z:925 [Μ-Η]。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.33 (1Η,d, J=8.4Hz, Glc-H-l),6.17 (1H, br s,1H, Araf-H-1),5.42 (1H, s，H—12)，5.02(1H，d,J=3.6Hz，GlcA-H-l)，3.33 (1H, dd, J=I0.8,3.6Hz，H_3)，3.19 (1H，dd，J=13.8,3.6Hz，H_18)，1.29 (6H, s, 2XCH3)，1.09,0.98,0.92,0.89,0.83 (each3H, s，5XCH3)。
[0082]根据化合物3的ES1-MS Jh-NMRJ3C-NMR数据，鉴定化合物3为竹节参皂苷IV。
[0083]化合物4:白色粉末，ES1-MS m/z:793 [Μ-Η]。1H-NMlUeOOMHzJ5D5N) δ 6.34 (1H,d, J=7.8Hz, Glc-H-l ),5.42 (lH,br s，H-12)，5.04 (1H，d，J=7.8Hz，GlcA-H-l)，3.37 (lH,brd, J=9.9Hz, H-3)，3.19 (1H, dd, J=I0.2,2.4Hz, H-18), 1.31，1.28，1.06，1.00,0.91,0.89，
0.83 (each3H, s，7XCH3)。[0084]根据化合物4的1H-NMRj3C-NMR数据，鉴定化合物4为竹节参皂苷IV a。
[0085]因此，采用本发明方法所得到产物的主要成分为竹节参皂苷V、pjs-2、竹节参皂苷IV及竹节参皂苷IV a，四种皂苷均为齐墩果烷型皂苷，因此，采用本发明的方法可实现竹节参中齐墩果烷型皂苷的富集与纯化。
[0086]本发明还涉及采用所述制备方法所得到的竹节参皂苷。所述竹节参皂苷含量测定方法如下:
[0087]香草醛-高氯酸法步骤如下:
[0088]A、对照品溶液制备:精密称取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇配成1.32mg/ml的对照品溶液，备用。
[0089]B、供试品溶液制备:精密称取本发明干燥竹节参皂苷总提物0.2g，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀过滤即得供试品溶液。
[0090]C、检测波长的确定:精密吸取Α50μ I和MO μ 1，分别置于IOml试管中，依次加入以重量计5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml,高氯酸0.8ml，摇匀，在温度60°C水浴中加热15min,取出，冷却，加冰醋酸稀释至刻度，摇匀，用空白试剂在波长400~700nm处扫描，确定波长在552nm为待测波长。
[0091]D、标准曲线的绘制:精密量取步骤A中对照品溶液0.2ml,0.4ml,0.6ml,0.8ml、
1.0ml，分别置于IOml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀；吸取1.0ml置IOml具塞试管中，按步骤C操作，在552nm处测吸光度值，以吸光度A为纵坐标，对照品浓度C为横坐标绘制标准曲线，由该标准曲线可以得到回归方程A=0.07141C-0.00623，r=0.9993。
[0092]E含量测定:按照步骤B制备各段皂苷样品液，各取40μ I置IOml具塞试管中，按照步骤C操作，每个样品测3平行试样，与552nm处测吸光度值，再根据标准曲线测得各段阜苷含量。
[0093]本发明用作疫苗佐剂的竹节参皂苷制备方法具有下述特点与优势:
[0094]A、制备方法简单、试剂便宜、操作简单，易于大量成产。
[0095]B、用不同醇浓度洗脱DlOl大孔吸附树脂，使得对不同区段的皂苷进行研究，更加充分体现总皂苷中各皂苷的不同活性，为进一步研究奠定基础。[0096]本发明还涉及所述的竹节参皂苷在制备疫苗佐剂中的用途。
[0097]佐剂是非特异性免疫增强剂，当与抗原一起注射或预先注入机体时，它可增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型。
[0098]与现有技术中的疫苗佐剂相比，本发明的竹节参皂苷疫苗佐剂具有如下优点:
[0099]A竹节参皂苷疫苗佐剂副作用小、来源广泛、易于生产。
[0100]B竹节参皂苷佐剂具有更强的佐剂活性，能更大的辅助疫苗发挥作用。
[0101]C竹节参皂苷疫苗佐剂是属于中药疫苗佐剂，为开发新型疫苗佐剂奠定了基础。
[0102][有益效果]
[0103]本发明的有益效果是:本发明是竹节参皂苷具有明显的佐剂活性，而无溶血的毒副作用，能够辅助疫苗发挥增益增强作用。竹节参皂苷具有促进Thl细胞免疫及抗体产生活性，明显优于传统的alum佐剂只能刺激Th2型的抗体产生能力。因此竹节参皂苷可用于蛋白亚单位疫苗及肿瘤疫苗的佐剂。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0104]图1是本发明醇洗脱竹节参皂苷的HPLC图谱；
[0105]图2表示佐剂对活化的淋巴细胞IL-2产生的影响。与OVA组比较，*p〈0.05，#p〈0.01 ；
[0106]图3表示佐剂对活化的淋巴细胞IFN- Y产生的影响。与OVA组比较，*p〈0.05，#p〈0.01 ；
[0107]图4表示佐剂对抗体IgG及其亚型产生的影响。与OVA组比较，*p〈0.05。
【【具体实施方式】】
[0108]通过下述实施例将能够更好地理解本发明。在本发明中，在没有特殊说明的前提下，液相混合物中的组分的百分比应当理解为体积百分比，固相混合物的组分的百分比应当理解为重量百分比。
[0109]实施例1:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0110]该实施例的实施步骤如下:
[0111]A、竹节参提取
[0112]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计55%乙醇水溶液中，浸泡2h，再加热回流提取3次，每次lh，合并提取液，再在压力0.006MPa下减压浓缩得到一种浓缩液；
[0113]B、萃取分离
[0114]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:1用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.006MPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0115]C、树脂吸附
[0116]DlOl大孔吸附树脂预处理:
[0117]将DlOl大孔吸附树脂用乙醇浸泡24h后，用乙醇洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无醇味，然后用以重量计5%HCL浸泡树脂柱3h，用水洗至中性，然后用以重量计2%Na0H浸泡树脂柱3h，水洗至中性备用。
[0118]DlOl大孔吸附树脂吸附条件如下:
[0119]柱径高比为1:10，上样量为0.1g生药/毫升柱体积，上样后静置过夜。
[0120]DlOl大孔吸附树脂洗脱条件如下:
[0121]先用水冲洗树脂柱至流出液无色，再用体积分数为90%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为3倍柱体积，洗脱流量为lmL/min。
[0122]得到的洗脱物在压力0.006MPa下进行减压浓缩，然后在压力0.06MPa与温度35°C的条件下进行干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0123]采用本说明书描述的方法分析了本实施例制备得到的竹节参皂苷产物，其HPLC图谱见附图1，由此确定竹节参皂苷产物的主要成分为竹节参皂苷V、pjs-2、竹节参皂苷IV及竹节参皂苷IV a。采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是 68.9%ο
[0124]实施例2:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0125]该实施例的实施步骤如下:
[0126]A、竹节参提取
[0127]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:15，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计85%乙醇水溶液中，浸泡5h，再加热回流提取2次，每次5h，合并提取液，再在压力0.008MPa下减压浓缩得到一种浓缩液；
`[0128]B、萃取分离
[0129]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:4用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.0OSMPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0130]C、树脂吸附
[0131]按照与实施例1相同的方式进行DlOl大孔吸附树脂预处理、吸附与梯度洗脱，得到的洗脱物在压力0.0OSMPa下进行减压浓缩，然后在压力0.0SMPa与温度40°C的条件下进行干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0132]采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是70.1%。
[0133]实施例3:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0134]该实施例的实施步骤如下:
[0135]A、竹节参提取
[0136]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:6，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计60%乙醇水溶液中，浸泡2.6h，再加热回流提取3次，每次1.8h，合并提取液，再在压力0.0OlMPa下减压浓缩得到一种浓缩液；
[0137]B、萃取分离
[0138]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1: 1.8用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.0OlMPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0139]C、树脂吸附
[0140]按照与实施例1相同的方式进行DlOl大孔吸附树脂预处理、吸附与梯度洗脱，得到的洗脱物在压力0.0OlMPa下进行减压浓缩，然后在压力0.01MPa与温度30°C的条件下进行干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0141]采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是61.5%。
[0142]实施例4:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0143]该实施例的实施步骤如下:
[0144]A、竹节参提取
[0145]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:14，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计80%乙醇水溶液中，浸泡4.5h，再加热回流提取4次，每次4.2h，合并提取液，再在压力0.002MPa下减压浓缩得到一种浓缩液；
[0146]B、萃取分离
[0147]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:3.2用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.002MPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0148]C、树脂吸附
[0149]按照与实施例1相同的方式进行DlOl大孔吸附树脂预处理、吸附与梯度洗脱，得到的洗脱物在压力0.002MPa下进行减压浓缩，然后在压力0.02MPa与温度46°C的条件下进行干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0150]采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是64.8%。
[0151]实施例5:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0152]该实施例的实施步骤如下:
[0153]A、竹节参提取
[0154]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:8，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计62%乙醇水溶液中，浸泡3.2h，再加热回流提取4次，每次2.5h，合并提取液，再在压力0.004MPa下减压浓缩得到一种浓缩液；
[0155]B、萃取分离
[0156]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:2.2用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.004MPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0157]C、树脂吸附
[0158]按照与实施例1相同的方式进行DlOl大孔吸附树脂预处理、吸附与梯度洗脱，得到的洗脱物在压力0.004MPa下进行减压浓缩，然后在压力0.04MPa与温度50°C的条件下进行干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0159]采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是61.9%。
[0160]实施例6:本发明醇沉竹节参皂苷的制备
[0161]该实施例的实施步骤如下:
[0162]A、竹节参提取
[0163]将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:12，将粉碎竹节参浸泡在浓度以重量计75%乙醇水溶液中，浸泡3.8h，再加热回流提取5次，每次3.6h，合并提取液，再在压力0.01MPa下减压浓缩得到一种浓缩液；[0164]B、萃取分离
[0165]步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:2.8用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着在压力0.01MPa下减压浓缩，于是得到正丁醇萃取物；
[0166]C、树脂吸附
[0167]按照与实施例1相同的方式进行DlOl大孔吸附树脂预处理、吸附与梯度洗脱，得到的洗脱物在压力0.01MPa下进行减压浓缩，然后在压力0.04MPa与温度50°C的条件下干燥，于是得到所述的竹节参皂苷。
[0168]采用本说明书描述的方法测定了本实施例制备产物的竹节参皂苷含量是59.9%。
[0169]试验实施例
[0170]一、溶血实验:
[0171]用抗凝真空采血管从兔耳静脉采集外周血，加入生理盐水，混匀，2000rpm，离心lOmin，重复洗涤3次，用生理盐水稀释制成0.5%v/v)的红细胞悬液。准确称取药物，分别用生理盐水配制，经过0.22 μ m微孔滤膜过滤，再用生理盐水依次稀释成浓度为1280、640、320、160、80、40、20、10μ g/mL 的稀释液。
[0172]在96孔板中，每孔加入0.5%的红细胞悬液100 μ L，再加入按照本发明方法制备的不同浓度的齐墩果烷型皂苷稀释液100 μ L，混匀，一个浓度重复3孔。再设阴性和阳性的溶血对照，分别为生理盐水及蒸馏水。在温度37°C培养箱中放置30min，以1000rpm离心IOmin0取各孔上清液100 μ L，使用酶标仪在波长405nm处检测吸光度值。实验重复3次，所测各组的吸收值减去生理盐水对照组的吸收值就可以表示溶血性，按照下面的公式计算其溶血率:`
[0173]溶血率(%) =100* (实验组OD-阴性对照OD) / (阳性对照OD-阴性对照OD)
[0174]按照本发明方法制备的竹节参齐墩果烷型皂苷对兔红细胞溶血活性试验结果列于表1中。
[0175]表1:皂苷的溶血活性测定
__OD 值(412nm) 溶血率(％ )
生理盐水0.丨丨±0.010.00
[0176]---
蒸馏水1.97 土 0.22__100.00土 10.50
Quil A (^igZml) 50.09±0.05-0.68±0.09
【权利要求】
1.一种用作疫苗佐剂的竹节参皂苷的制备方法，其特征在于该制备方法包括如下步骤: A、竹节参提取 将竹节参原料粉碎，按照竹节参与乙醇水溶液的重量比1:5~15，将粉碎竹节参浸泡在体积分数55~85%乙醇水溶液中，浸泡2~5h，再加热回流提取2~5次，每次I~5h，合并提取液，再减压浓缩至提取液无醇味，得到一种浓缩液； B、萃取分离 步骤A得到的浓缩液按照浓缩液与正丁醇的体积比1:1~4用正丁醇进行多次萃取与两相分离，直到正丁醇相无色，得到的正丁醇萃取液合并，接着减压浓缩，真空干燥，于是得到正丁醇萃取物； C、树脂吸附 大孔吸附树脂预处理:在树脂柱中，将大孔吸附树脂浸泡在乙醇中20~24h，然后用乙醇水溶液洗脱至流出液不浑浊，再用水洗至无乙醇味，接着将大孔吸附树脂浸泡在以重量计4~6%HCL水溶液中2~4h，用水洗至中性，然后将大孔吸附树脂浸泡在以重量计I~3%NaOH水溶液中2~4h，用水洗至中性备用； 步骤B得到的正丁醇萃取物吸附条件如下:树脂柱的径高比为1:8~12，上样量为0.05~0.15g生药/毫升柱 体积，上样后静置过夜，在DlOl大孔吸附树脂吸附饱和后，使用乙醇水溶液进行洗脱； 洗脱条件如下:先用水冲洗至流出液无色，再用体积分数为80~95%的乙醇水溶液洗脱，洗脱体积为2~4倍柱体积，洗脱流量0.8~1.2mL/min ； 得到的洗脱物进行减压浓缩，然后真空干燥，其产物是所述的竹节参皂苷。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述竹节参粉碎粒度是20~40目。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，竹节参与乙醇水溶液的重量比是1:8~12。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤A中，所述乙醇水溶液的体积分数为62~75%。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤B中，所述的减压浓缩是在压力0.001~0.01MPa下进行的，所述的干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤B中，所述浓缩液与正丁醇的体积比是1:1.8~3.2。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤C中，所述的大孔吸附树脂是DlOl大孔吸附树脂。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于在步骤D中，所述的减压浓缩是在压力0.001~0.01MPa下进行的，所述的干燥是在压力0.01~0.1MPa与温度30~50°C的条件下进行干燥。
9.根据权利要求1-7所述制备方法得到的竹节参皂苷。
10.根据权利要求8所述的竹节参皂苷在制备疫苗佐剂中的用途。
【文档编号】A61K39/39GK103611157SQ201310652240
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年12月5日 优先权日:2013年12月5日
【发明者】袁丁, 张长城, 刘朝奇, 王婷, 孙志伟, 周志勇, 崔倩倩, 万静枝, 何毓敏 申请人:三峡大学