一种可注射型生物活性人工骨材料及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可注射型生物活性人工骨材料及制备方法，属于医药【技术领域】。本发明中的可注射型生物活性人工骨材料由固相和液相两部分按固液比（0.8～1.2）g：1ml调和配制；其中所述的固相包括磷酸盐混合物和碳二亚胺；所述的磷酸盐混合物和缩合剂的质量比为10:1；所述的磷酸盐混合物为摩尔比1:2混合的磷酸四钙和磷酸氢钙。所述的液相包括水、壳聚糖和柠檬酸，其中水：壳聚糖：柠檬酸的质量比为100：（1～2）：（4～5）。本发明采用碳二亚胺型缩合试剂来实现生物活性分子与壳聚糖衍生物的共价偶联。上述可注射型生物活性人工骨材料在制备人工骨中广泛应用。
【专利说明】一种可注射型生物活性人工骨材料及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及一种可注射型生物活性人工骨材料及制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]磷酸钙骨水泥是目前采用最多的可注射性骨修复材料，但作为组织工程支架，磷酸钙骨水泥的最大缺陷是孔隙小，不利于细胞长入，且固化速度较慢。由于固化后，颗粒状的钙磷盐易流失、移位，固化后强度低。另一种自固化骨水泥PMMA，存在固化过程放热，生物惰性，与自体骨结合差，残余单体对人体有害等缺陷，其在临床的使用已受到置疑。
[0003]目前可注射骨组织工程支架材料的研究和开发多集中在软骨方面，在骨组织工程的研究和开发较少。为数不多的可注射型组织工程支架材料是可注射藻酸钙、纤维蛋白凝胶等生物材料。注入体内后多为凝胶状，易于流失，并且不具备一定的力学强度，对于要求有一定强度的骨缺损修复而言，显然是不适宜的。但可注射组织工程支架材料注射前是流态，易于种子细胞的负载和复合生长因子。注射后根据骨缺损形状自由塑型固化，操作简单，固化后的强度可达到或超过自体松质骨，便于临床使用。故新型可注射组织工程支架的研究将发挥组织工程技术和微创外科技术的优势，更好地为广大患者服务。
【发明内容】
[0004]针对现有技术的缺陷和不足，本发明的首要目的在于提供一种可注射型生物活性人工骨材料。
[0005]本发明的另一目的在于提供上述可注射型生物活性人工骨材料的制备方法。
[0006]本发明的再一目的在于提供上述可注射型生物活性人工骨材料的应用。
[0007]本发明的目的通过下述技术方案实现:一种可注射型生物活性人工骨材料，由固相和液相两部分按固液比(0.8~1.2) g:lml调和配制；
[0008]所述的固相包括磷酸盐混合物和缩合剂；所述的磷酸盐混合物和缩合剂的质量比优选为10:1 ；
[0009]所述的液相包括水、壳聚糖和柠檬酸，其中水:壳聚糖:柠檬酸的质量比为100:(1 ~2):(4 ~5);
[0010]所述的磷酸盐混合物为摩尔比1: 2混合的磷酸四钙和磷酸氢钙；
[0011]所述的缩合剂优选为碳二亚胺；
[0012]本发明的可注射型生物活性人工骨材料的制备方法，包括下列步骤:
[0013](1)将磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1:2混合，在无水乙醇介质中球磨混合，在80°C下烘干，制得磷酸盐混合物；
[0014](2)将步骤(1)制得的磷酸盐混合物与碳二亚胺按质量比10:1混合均匀，制得固相；
[0015](3)将壳聚糖、柠檬酸和水按照质量比(1~2): (4~5):100的比值进行混合，并充分搅拌，制得液相；
[0016](4)将步骤(2)中制备的固相与步骤(3)中制备的液相按固液比(0.8~1.2) g:1ml调和配制，制得可注射型生物活性人工骨材料。
[0017]步骤(3)中所述的壳聚糖的脱乙酰度为70~100%，重均分子量为2000~100万。
[0018]上述可注射型生物活性人工骨材料在制备人工骨中应用。
[0019]本发明采用碳二亚胺型缩合试剂来实现生物活性分子与壳聚糖衍生物的共价偶联。
[0020]本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:
[0021]1.本发明采用磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1:2混合制备获得的磷酸钙盐的复合配方，使材料体系具有适宜的固化速度。
[0022]2.本发明中采用生物降解交联剂碳二亚胺，共价交联壳聚糖；采用天然产物氢键交联壳聚糖，使形成的高分子框架结构较好"固定"钙磷盐，防止体液冲蚀。
【具体实施方式】
[0023]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0024]实施例1
[0025](1)将磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1: 2混合，在无水乙醇介质中球磨混合，在80°C下烘干，制得磷酸盐混合物；
[0026](2)将步骤(1)制得的磷酸盐混合物与碳二亚胺按质量比10:1混合均匀，制得固相；
[0027](3)将壳聚糖、柠檬酸和水按照质量比1:4:100的比值进行混合，并充分搅拌，制得液相；
[0028](4)将步骤(2)中制备的固相与步骤(3)中制备的液相按固液比0.8g:1ml调和配制，制得可注射型生物活性人工骨材料。
[0029]实施例2
[0030](1)将磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1: 2混合，在无水乙醇介质中球磨混合，在80°C下烘干，制得磷酸盐混合物；
[0031](2)将步骤(1)制得的磷酸盐混合物与碳二亚胺按质量比10:1混合均匀，制得固相；
[0032](3)将壳聚糖、柠檬酸和水按照质量比2:5:100的比值进行混合，并充分搅拌，制得液相；
[0033](4)将步骤(2)中制备的固相与步骤(3)中制备的液相按固液比Ig:lml调和配制，制得可注射型生物活性人工骨材料。
[0034]实施例3
[0035](1)将磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1: 2混合，在无水乙醇介质中球磨混合，在80°C下烘干，制得磷酸盐混合物；
[0036](2)将步骤(1)制得的磷酸盐混合物与碳二亚胺按质量比10:1混合均匀，制得固相；
[0037](3)将壳聚糖、柠檬酸和水按照质量比1:5:100的比值进行混合，并充分搅拌，制得液相；
[0038](4)将步骤(2)中制备的固相与步骤(3)中制备的液相按固液比1.2g:1ml调和配制，制得可注射型生物活性人工骨材料。
[0039]实施例4人脐带间充质干细胞的提取、培养及诱导
[0040](I)健康脐带的获得:委托暨南大学附属第一医院妇产科建立产妇体检健康档案，征得本人及家属同意后签订合约，对计划生产的产妇提前半年定期提供包括血常规、生化，HIV、梅毒、各型肝炎病毒等传染性疾病，肿瘤标志物等检测，筛选健康的产妇，在其分娩后取得脐带，脐带及新生儿建档，建立供者随访制度。
[0041](2)干细胞的提取:剥离脐带上的动静脉，经缓冲液冲洗后剪碎，先后经质量分数为0.1%的胶原酶I1、质量分数为0.25%的胰酶消化10~20min，收集悬浮细胞，接种于含有F-12完全培养液的塑料培养瓶中，置于37°C，体积分数5%C02培养箱培养，定期换液。
[0042](3)生物反应器里的培养:观察细胞80%融合时，质量分数0.25%胰酶消化冲洗。取一定数量的细胞与预先水化的Cytodex-3型微载体按比例混合于F-12完全培养基，置于生物反应器内，起始培养体积占反应器容积的一半，细胞贴壁后，培养体积逐渐增加至反应器容积。脉冲动力随培养体积增加，直至恒定。其后定期换液、添加微载体实行连续培养。期间可取样干细胞标记物检测。
[0043](4)干细胞的成骨诱导:取样观察微载体上的细胞多数融合后，改用含地塞米松IX 10-8mol/L、β -甘油磷酸钠10mmol/L、维生素C50ug/ml的成骨诱导的F-12培养液，连续培养8-10天后，获得成骨细胞，即可与材料复合使用。期间取样做成骨细胞标记物检测。
[0044]实施例5动物试验
[0045]取3~4月龄同种新西兰兔,在胚骨上端作骨缺损模型,缺损约IOX 5X 5mm,去骨皮质，深达骨髓腔，不冲洗，在实施例1中制备的可注射型生物活性人工骨材料固化前加入实施例4诱导制备的成骨细胞一并注入(两者比例为质量比10:1)缺损内，材料不超出正常骨皮质，缝合伤口，进行动物饲养；分别于手术后1、2、4、6、8、12、18、24个月进行X线，ECT检测和骨密度测定，组织学检测、病理学检测、骨成分检测。结果发现手术后的24月内缺损的胫骨上端的得到了恢复 ，并且人工骨没有出现变形等问题。
[0046]实施例6动物试验
[0047]取3~4月龄同种新西兰兔，建立兔腰椎椎间融合模型，取出椎间盘组织，刮除上下椎板，以骨质微渗血为度，在实施例1中制备的可注射型生物活性人工骨材料固化前加入实施例4诱导制备的成骨细胞一并注入(两者比例为质量比10:1)椎体间隙，使材料局限于间隙内，待材料完全固化坚硬后缝合伤口，进行动物饲养；分别于手术后1、2、4、6、8、12、18、24个月进行X线，ECT检测和骨密度测定，组织学检测、病理学检测、骨成分检测。结果发现术后的24月内兔腰椎椎间融合。
[0048]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种可注射型生物活性人工骨材料，其特征在于由固相和液相两部分按固液比(0.8~1.2) g:lml调和配制； 所述的固相包括磷酸盐混合物和缩合剂；所述的磷酸盐混合物和缩合剂的质量比为.10:1 ； 所述的液相包括水、壳聚糖和柠檬酸，其中水:壳聚糖:柠檬酸的质量比为100: (I~.2):(4 ~5)。
2.根据权利要求1所述的可注射型生物活性人工骨材料，其特征在于:所述的磷酸盐混合物为摩尔比1:2混合的磷酸四钙和磷酸氢钙。
3.根据权利要求1所述的注射型生物活性人工骨材料，其特征在于:所述的缩合剂为碳二亚胺。
4.权利要求1~3任一项所述的可注射型生物活性人工骨材料的制备方法，其特征在于包括下列步骤: (1)将磷酸四钙与磷酸氢钙按照摩尔比1:2混合，在无水乙醇介质中球磨混合，在80°C下烘干，制得磷酸盐混合物； (2)将步骤(1)制得的磷酸盐混合物与碳二亚胺按质量比10:1混合均匀，制得固相； (3)将壳聚糖、柠檬酸和水按照质量比(I~2):(4~5):100的比值进行混合，并充分搅拌，制得液相； (4)将步骤(2)中制备的固相与步骤(3)中制备的液相按固液比(0.8~1.2)g:lml调和配制，制得可注射型生物活性人工骨材料。
5.根据权利要求4所述的可注射型生物活性人工骨材料的制备方法，其特征在于:步骤(3)中所述的壳聚糖的脱乙酰度为70~100%，重均分子量为2000~100万。
6.权利要求1~3任一项所述的可注射型生物活性人工骨材料在制备人工骨中应用。
【文档编号】A61L27/00GK103736149SQ201310729315
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年12月25日 优先权日:2013年12月25日
【发明者】李志忠, 孙国栋, 焦延鹏 申请人:暨南大学