用于治疗肿瘤的方法

用于治疗肿瘤的方法
【专利摘要】本发明提供藉由给药IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂而治疗肿瘤(例如，膀胱癌)的方法，其中所述IL-2融合蛋白不需要以所述肿瘤为目标。
【专利说明】用于治疗肿瘤的方法
[0001] 联邦政府赞助的研宄下进行的发明的权利声明
[0002] 此成果是由以下美国国家卫生研宄院的补助款（补助款编号：CA097550)所支持。 政府对本发明具有一定权利。

【背景技术】
[0003] 在美国，膀胱癌（本文中亦称为尿道上皮细胞癌）为男性中第四最常见的 癌症类型和女性中第九最常见癌症，而且每年估计有70, 500个新案例（52, 760位男 性和17, 770女性）和14, 680位死亡（10, 410位男人和4, 270位女人）（Jemal, A. et al·，CA Cancer J Clin, 60:277-300, 2010)。局部疾病通常是使用免疫疗法（Bacillus Calmette-Guerin)、连接至膀胱镜的电灼装置或藉由囊肿切除术治疗。晚期疾病通常是 以化学疗法或化学疗法与辐射的组合而治疗。对于以传统的单一药剂化学疗法治疗的 转移性肌肉-侵入性膀胱癌患者而言，存活中位数为大约7至8个月（Raghavan，D. et al·，N Engl J Med, 322:1129-1138, 1990)。在将包含甲氨蝶呤（methotrexate)、长春花 喊（vinblastine)、多柔比星（doxorubicin)以及顺钼（cisplatin)(MVAC)以及吉西他 滨（gemcitabine)和顺铂（GC)的组合细胞毒性疗方导入转移性膀胱癌的处理，存活中 位数已几乎增加两倍至超过13个月，而且3年存活率为大约20 %至25% (Loehrer, P. J. et al.,J Clin Oncol, 10:1066-1073, 1992 ；von der MaasejH.et al.,J Clin Oncol，18:3068-3077, 2000)。然而，彼等案例中因癌症而最终发生死亡者超过90%，而且在 过去20年没有核准晚期/转移性膀胱癌的新药物。在目前的治疗选择的有限功效的情况 下，需要额外的治疗方针。


【发明内容】

[0004] 如下述，本发明的特征为治疗癌症的方法。于优选的具体实施例中，本发明的特征 为对有癌症的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白与一种或多种治疗剂的组合，以治疗所 述癌症。
[0005] 于一个态样中，本发明通常的特征为一种改善受试者的癌症的方法，其涉及对有 需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白与一种或多种治疗剂，藉此改善所述癌症。
[0006] 于另一个态样中，本发明的特征为一种减少受试者中的肿瘤负担的方法，其涉及 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此减少所述肿瘤的体积。
[0007] 于又另一个态样中，本发明的特征为一种治疗受试者的化学抗性癌症的方法，其 涉及对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此治疗所述化学抗性癌 症。
[0008] 于进一步的态样中，本发明的特征为一种在受试者中诱发针对癌症的耐久性免疫 记忆反应的方法，其涉及对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此诱 发所述针对癌症的耐久性免疫记忆反应。
[0009] 于又另一个态样中，本发明的特征为一种增加具有癌症的受试者的存活的方法， 其涉及对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此增加所述受试者的 存活。
[0010] 于另一个态样中，本发明的特征为一种用于治疗膀胱癌的套组，其含有IL-2融合 蛋白和一种或多种治疗剂。
[0011] 任何以上态样或本文描述的发明的任何其它态样的多个具体实施例中，IL-2融合 蛋白不特异性地以癌症为目标或结合癌症。于另一个具体实施例中，IL-2融合蛋白包括T 细胞受体（TCR)结构域。于又另一个具体实施例中，T细胞受体结构域为单链T细胞受体。 于进一步具体实施例中，一种或多种治疗剂是选自由下列各者所组成群组：乙酸阿比特龙 醋（abiraterone)、六甲密胺（altretamine)、脱水长春花喊（anhydrovinblastine)、欧瑞 斯他汀（auristatin)、阿扎胞苷（azacitidin)、AZD 8477、苯达莫司汀（bendamustin)、贝 伐单抗（bevacizumab)、荷萨罗丁（bexarotene)、比卡鲁胺（bicalutamide)、BMS184476、 2, 3, 4, 5, 6-五氟-N-(3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、博来霉素（bleomycin)、硼替佐米 (bortezomib)、N，N-二甲基-L-缬氨酰基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰 基-I-L-脯氨酸-第三丁基酰胺、恶病质素（cachectin)、卡培拉滨（capecitabin)、西马多 丁（cemadotin)、西妥昔单抗（cetuximab)、瘤可宁（chlorambucil)、环磷酰胺，3'，4' -二去 氢-4' -二氧基 _8' -诺文（norvin)-长春喊（caleukoblastine)、多西他赛（docetaxol)、 多稀紫杉醇（doxetaxel)、环磷酰胺、卡钼（carboplatin)、卡莫司汀（carmustine) (BCNU)、顺钼、念珠藻环肽（cryptophycin)、环磷酰胺、阿糖胞苷（cytarabine)、达卡巴 嗪（dacarbazine) (DTIC)、更生霉素（dactinomycin)、达沙替尼（dasatinib)、柔红霉 素（daunorubicin)、多拉斯他丁（dolastatin)、多韦替尼（dovitinib)、多柔比星（阿 霉素）（adriamycin)、表阿霉素（epirubicin)、埃坡霉素 B(epothilone B)、埃罗替尼 (erlotinib)、艾瑞布尔（eribulin)、依托泊苷（etoposide)、依维莫司（everolimus)、 5-氟尿啼啶、非那利得（finasteride)、氟他胺（flutamide)，吉非替尼（gefitinib)、 吉西他滨（gemcitabine)、轻基脲和轻基脲紫杉焼类、宜佛斯酰胺（ifostamide)、干扰素 α、伊马替尼（imatinib)、伊匹单抗（ipilimumab)、依利诺替康（irinotecan)、拉钩它索 (Iargotaxel)、拉帕替尼（Iapatinib)、来那度胺（Ienalidomid)、利阿挫（Iiarozole)、洛 那法尼（Ionafarnib)、氯尼达明（Ionidamine)、洛莫司汀（Iomustine) (CCNU)、二氯甲基二 乙胺（mechlorethamine)(氮芥）、美法仑（melphalan)、轻乙基磺酸米伏布尔（mivobulin isethionate)、利索新（rhizoxin)、什汀尼夫（sertenef)、链脲霉素（streptozocin)、 丝裂霉素（mitomycin)、甲氨蝶呤、5-氟尿啼啶、尼鲁米特（niIutamide)、奥那司酮 (onapristone)、草酸钼（oxaliplatin)、他克挫（paclitaxel)、帕尼单抗（panitumumab)， 帕挫帕尼（pazopanib)，普拉曲沙（pralatrexate)、泼尼莫司汀（prednimustine)、卩比曲 克辛（卩；[1'；!_奸61；!_111)、丙卡巴餅（卩1'00&1^&2；!_116)、啦挫卩林口丫啶（卩7『&2010&(31^(1；!_116)、利妥 昔单抗（rituximab)、RPR109881、罗米地辛（romidepsin)、索拉非尼（sorafinib)、磷酸 雌莫司汀（stramustine磷酸醋）、舒尼替尼（sunitinib)、它莫西芬（tamoxifen)、他索 尔明（tasonermin)、紫杉醇（taxol)、替莫挫胺（temozolomide)、拓扑替康（topotecan)、 曲妥珠单抗（transtuzumab)、维A酸（tretinoin)，三甲曲沙（trimetrexate)、威罗菲尼 (vemurafenib)、长春花碱、长春新碱（vincristine)、硫酸长春地辛（vindesine sulfate)、 长春氟宁（vinflunine)以及伏立诺他（vorinostat)。在其它具体实施例中，一种或多种治 疗剂是选自由吉西他滨和以铂为主的化合物（包含顺铂）所组成群组。于又另一具体实施 例中，癌症是选自由膀胱癌、尿道、输尿管以及肾盂的尿道上皮细胞癌、肾脏癌、乳癌、结肠 癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色 素瘤、肝癌、食道癌、胰脏癌以及胃癌所组成群组。在进一步具体实施例中，癌症是膀胱或尿 道上皮细胞癌。在又进一步具体实施例中，癌症有化学抗性。在其它具体实施例中，IL-2融 合蛋白和一种或多种治疗剂在约7至14天内给药。在又其它具体实施例中，IL-2融合蛋白 和一种或多种治疗剂是在约3至5天内给药或同时给药。在额外的具体实施例中，IL-2融 合蛋白是ALT-801，而且一种或多种治疗剂是顺铂。于进一步具体实施例中，一种或多种治 疗剂是吉西他滨。在又额外的具体实施例中，IL-2融合蛋白特异性地以癌症细胞为目标。 于一些具体实施例中，IL-2融合蛋白特异性地以癌症细胞表面上的p53胜肽/HLA络合物 为目标。
[0012] 本发明所定义的组成物和物件是单独的，或相反地是与根据以下提供的实施例有 关而制造。将从【具体实施方式】和从权力要求书清楚了解所述发明的其它特征和优点。
[0013] 定义
[0014] 所谓"肿瘤负担"（亦称为"肿瘤负荷"）意指身体中的癌症细胞的数目、肿瘤的尺 寸或癌症的量。
[0015] 所谓"IL-2融合蛋白"意指含有与第二多肽融合的整个全长IL-2蛋白质或其生物 上有活性的片段的多肽。第二多肽可为目标多肽，亦即，抗体或其抗原结合片段；T细胞受 体（TCR)或其胜肽结合片段；受体或其配位体结合结构域等，其中所述第二多肽特异性地 以IL-2融合蛋白为目标或将IL-2融合蛋白导向癌症细胞。或者，第二多肽可为非目标多 肽，亦即，不特异地以IL-2融合蛋白为目标或将IL-2融合蛋白导向癌症细胞的多肽。
[0016] 所谓"T细胞受体（TCR)结构域"意指包括需要结合呈现于适当的MHC或HLA分子 中的同族胜肽的T细胞受体的所有部分的多肽。TCR结构域的非限制性实例是描述于美国 专利第7, 456, 263号；美国专利第6, 534, 633号；美国专利申请公开案第US2003/0144474 号；以及美国专利申请公开案第US2011/0070191号，其等全文是以参考方式纳入本文中。
[0017] 所谓"ALT-801"意指能结合人类p53胜肽（氨基酸264至272) HLA-A*0201(c264scTCR-IL-2)的IL-2和TCR结构域之间的融合物。一个ALT-801的阐释 性氨基酸序列包含以下信号序列：
[0018] Metdtlllwvlllwvpgstgqsvtqpdarvtvsegaslqlrckysysgtpylfwyvqyprqglqlllky ysgdpvvqgvngfeaefsksnssfhlrkasvhwsdsavyfcvlsedsnyqliwgsgtkliikpdtsggggsggggsg gggsggggsssnskviqtprylvkgqgqkakmrcipekghpvvfwyqqnknnefkfIinfqnqevlqqidmtekrfs aecpsnspcsleiqsseagdsalylcasslsgggtevffgkgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatI vclatgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsrycIssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsen dewtqdrakpvtqivsaeawgradvnakttapsvypIapvsgaptssstkktqlqlehlIldlqmilnginnyknpk ltrmltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadeta tiveflnrwitfcqsiistlt
[0019] -个成熟ALT-801 (但没有信号序列）的阐释性氨基酸序列为：
[0020] qsvtqpdarvtvsegaslqlrckysysgtpylfwyvqyprqglqlllkyysgdpvvqgvngfeaefsks nssfhIrkasvhwsdsavyfcvlsedsnyqliwgsgtkliikpdtsggggsggggsggggsggggsssnskviqtpr ylvkgqgqkakmrcipekghpvvfwyqqnknnefkflinfqnqevlqqidmtekrfsaecpsnspcsleiqsseagd salylcassIsgggtevffgkgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatIvclatgffpdhvelswwvng kevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeaw gradvnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkatelkh lqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiist It
[0021] -个编码ALT-801的阐释性核酸为：
[0022] atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggtcagtcagtg acgcagcccgatgctcgcgtcactgtctctgaaggagcctctctgcagctgagatgcaagtattcctactctgggac accttatctgttctggtatgtccagtacccgcggcaggggctgcagctgctcctcaagtactattcaggagacccag tggttcaaggagtgaatggcttcgaggctgagttcagcaagagtaactcttccttccacctgcggaaagcctctgtg cactggagcgactctgctgtgtacttctgtgttttgagcgaggatagcaactatcagttgatctggggctctgggac caagctaattataaagccagacactagtggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggtggcggcggttctggcg gtggcggttcctcgagcaattcaaaagtcattcagactccaagatatctggtgaaagggcaaggacaaaaagcaaag atgaggtgtatccctgaaaagggacatccagttgtattctggtatcaacaaaataagaacaatgagtttaaattttt gattaactttcagaatcaagaagttcttcagcaaatagacatgactgaaaaacgattctctgctgagtgtccttcaa actcaccttgcagcct agaaattcagtcctctgaggcaggagactcagcactgtacctctgtgccagcagtctgtc agggggcggcacagaagttttctttggtaaaggaaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccac ccgaggtcgctgtgtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccaca ggcttcttccctgaccacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacc cgcagcccctcaaggagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccacc ttctggcagaacccccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggaccc aggatagggccaaacccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagacgttaacgcaaagacaacc gccccttcagtatatccactagcgcccgtttccggagcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaact ggagcatttactgctggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgc tcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacct ctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgt aatagttctggaactaaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaat ttctgaacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaacttaa
[0023] 所谓"MART-lscTCR/IL-2"意指能结合呈现于HLA-A*0201内容中的MRT-I胜肽 (氨基酸27至35)的IL-2和TCR结构域之间的融合物。一个MART-lscTCR/IL-2(包含信 号序列）的阐释性氨基酸序列为：
[0024] Metdtlllwvlllwvpgstgqkeveqnsgplsvpegaiaslnctysdrgsqsffwyrqysgkspelimf iysngdkedgrftaqlnkasqyvsllirdsqpsdsatylcavnfgggklifgqgtelsvkpdtsggggsgggasggg gsggggsssiagitqaptsqilaagrrmtlrctqdmrhnamywyrqdlglglrIihysntagttgkgevpdgysvsr antddfpltlasavpsqtsvyfcasslsfgteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatlvcla tgffpdhvelswwvngkevhsgvstdpqplkeqpalndsryclssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewt qdrakpvtqivsaeawgradvnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrm ltfkfympkkatelkhlqcleeelkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivlelkgsettfmceyadetative flnrwitfcqsiistlt
[0025] -个成熟MART-lscTCR/IL-2 (但没有信号序列）的阐释性氨基酸序列为：
[0026] Qkeveqnsgplsvpegaiaslnctysdrgsqsffwyrqysgkspelimfiysngdkedgrftaqlnkas qyvsllirdsqpsdsatylcavnfgggklifgqgteIsvkpdtsggggsgggasggggsggggsssiagitqaptsq iIaagrrmtlrctqdmrhnamywyrqdlglglrlihysntagttgkgevpdgysvsrantddfpltlasavpsqtsv yfcasslsfgteaffgqgtrltvvedlnkvfppevavfepseaeishtqkatIvclatgffpdhveIswwvngkevh sgvstdpqplkeqpalndsrycIssrlrvsatfwqnprnhfrcqvqfyglsendewtqdrakpvtqivsaeawgrad vnakttapsvyplapvsgaptssstkktqlqlehllldlqmilnginnyknpkltrmltfkfympkkateIkhlqcl eeeIkpleevlnlaqsknfhlrprdlisninvivielkgsettfmceyadetativeflnrwitfcqsiistlt
[0027] -个编码MART-lscTCR/IL-2的阐释性核酸的为：
[0028] atggagacagacacactcctgttatgggtactgctgctctgggttccaggttccaccggtcagaaggag gtggagcagaattctggacccctcagtgttccagagggagccattgcctctctcaactgcacttacagtgaccgagg ttcccagtccttcttctggtacagacaatattctgggaaaagccctgagttgataatgttcatatactccaatggtg acaaagaagatggaaggtttacagcacagctcaataaagccagccagtatgtttctctgctcatcagagactcccag cccagtgattcagccacctacctctgtgccgtgaacttcggaggaggaaagcttatcttcggacagggaacggagtt atctgtgaaacccgacactagtggtgggggtgggagcgggggtggtgctagcggtggcggcggttctggcggtggcg gttcctccagcattgcagggatcacccaggcaccaacatctcagatcctggcagcaggacggcgcatgacactgaga tgtacccaggatatgagacataatgccatgtactggtatagacaagatctaggactggggctaaggctcatccatta ttcaaatactgcaggtaccactggcaaaggagaagtccctgatggttatagtgtctccagagcaaacacagatgatt tccccctcacgttggcgtctgctgtaccctctcagacatctgtgtacttctgtgccagcagcctaagtttcggcact gaagctttctttggacaaggcaccagactcacagttgtagaggacctgaacaaggtgttcccacccgaggtcgctgt gtttgagccatcagaagcagagatctcccacacccaaaaggccacactggtgtgcctggccacaggcttcttccctg accacgtggagctgagctggtgggtgaatgggaaggaggtgcacagtggggtcagcacggacccgcagcccctcaag gagcagcccgccctcaatgactccagatactgcctgagcagccgcctgagggtctcggccaccttctggcagaaccc ccgcaaccacttccgctgtcaagtccagttctacgggctctcggagaatgacgagtggacccaggatagggccaaac ccgtcacccagatcgtcagcgccgaggcctggggtagagcagacgttaacgcaaagacaaccgccccttcagtatat ccactagcgcccgtttccggagcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagcatttactgct ggatttacagatgattttgaatggaattaataattacaagaatcccaaactcaccaggatgctcacatttaagtttt acatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgcta aatttagctcaaagcaaaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaact aaagggatctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctgaacagatgga ttaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaactta〇
[0029] 所谓"剂"意指任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子或多肽或其片段。
[0030] 所谓"治疗剂"意指用于癌症治疗的任何化学治疗或生物治疗剂。治疗剂的 非限制性阐释实例包含乙酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞 苷、AZD 8477、苯达莫司汀、贝伐单抗、蓓萨罗丁、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五 氟-N_(3-氟-4-甲氧基苯基）苯磺酰胺、博来霉素、硼替佐米、N，N-二甲基-L-缬氨酰 基-L-缬氨酰基-N-甲基-L-缬氨酰基-L-脯氨酰基-I-L脯氨酸-第三丁基酰胺、恶病质 素、卡培拉滨、西马多丁、西妥昔单抗、瘤可宁、环磷酰胺、3'，4' -二去氢-4' -二氧基-8' -诺 文-长春碱、多西他赛、多烯紫杉醇、环磷酰胺、卡铂、卡莫司汀（BCNU)、顺铂、念珠藻环肽、 环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪（DTIC)、更生霉素、达沙替尼、柔红霉素、多拉斯他丁、多韦替 尼、多柔比星、表阿霉素、埃坡霉素 B、埃罗替尼、艾瑞布尔、依托泊苷、依维莫司、5-氟尿嘧 啶、非那利得、氟他胺、吉非替尼、吉西他滨、羟基脲以及羟基脲紫杉烷类、宜佛斯酰胺、干扰 素 α、伊马替尼、伊匹单抗、依利诺替康、拉钩它索、拉帕替尼、来那度胺、利阿唑、洛那法尼、 氯尼达明、洛莫司汀（CCNU)、二氯甲基二乙胺（氮芥）、美法仑、羟乙基磺酸米伏布尔、利索 新、什汀尼夫、链脲霉素、丝裂霉素、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、尼鲁米特、奥那司酮、草酸铂、他 克唑、帕尼单抗、帕唑帕尼、普拉曲沙、泼尼莫司汀、吡曲克辛、丙卡巴肼、吡唑啉吖啶、利妥 昔单抗、RPR109881、罗米地辛、索拉非尼、磷酸雌莫司汀、舒尼替尼、它莫西芬、他索尔明、紫 杉醇、替莫唑胺、拓扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、三甲曲沙、威罗菲尼、长春花碱、长春新碱、 硫酸长春地辛、长春氟宁以及伏立诺他。
[0031] 所谓"化学抗性"意指已变成对一种或多种治疗剂有抗性的癌症或癌症细胞。
[0032] 所谓"改善"意指减少、抑制、衰减、缩减、遏止、或稳定疾病的发展或恶化。
[0033] 所谓"诱发针对肿瘤的耐久性免疫记忆反应"意指对后续激发或肿瘤再生长或癌 性生长的治疗诱发的抗性。
[0034] 所谓"变化〃意指如以标准领域中已知的方法（诸如描述于本文者）所侦测的表 达水平或基因或多肽活性的变化（增加或减少）。如本文中使用，变化包含表达水平的10% 变化，优选为表达水平的25 %变化，更优选为40 %变化，以及最优选为50 %或更大的变化。
[0035] 所谓"类似物"意指非相同，但具有类似功能性或结构性特征的分子。例如，多肽 类似物保留相应的自然产生多肽的生物活性，同时具有增强类似物相对于自然产生多肽的 功能的某种生物化学改性。此生物化学改性可增加类似物的蛋白酶抗性、膜渗透率或半衰 期，但没有改变，例如，配位体结合。类似物可包含非天然氨基酸。
[0036] 于这揭示内容中，"包括（comprises) "、"包括（comprising) "、"含有 (containing)"以及"具有（having)"等可具有将彼等归结于美国专利法中的意思，而且 可意指"包含（includes) "、"包含（including) 〃等；"基本上由…所组成（consisting essentially)"或"基本上由…组成（consists essentially) 〃同样具有归结于美国专利 法中的意思，而且所述术语为开放式，只要所叙述的基本或新颖特征并非藉由存在超过所 叙述者而改变，允许存在超过所叙述者，但排除前案的具体实施例。
[0037] "侦测"意指辨别欲侦测的分析物的存在、不存在或量。
[0038] 所谓"可侦测的标记"意指当组成物键合至感兴趣的分子时，使得后者可经由光 谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学方式侦测。例如，有用的标记包含放射性同位素、磁 性珠、金属珠、胶体粒子、荧光染料、电子密集试剂、酵素（例如，如ELISA中常用者）、生物 素、地高辛配体（digoxigenin)或半抗原。
[0039] 所谓"疾病"意指任何破坏或干扰细胞、组织或器官的正常功能的病症或异常。疾 病的实例包含癌症。
[0040] 所谓"有效量"或"治疗量"意指相对于未经治疗的患者，需要治疗、预防或改善疾 病症状的量。用以实践本发明以治疗性处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量是依 据受试者的给药方式、年龄、体重以及一般健康而改变。最终，主治医师或兽医将决定适当 的量及剂量疗方。此量被称为"有效"量。
[0041] 所谓"片段"意指多肽或核酸分子的一部分。优选地，这部分含有参考核酸分子或 多肽的整个长度的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。片段可含有 10、20、30、40、50、60、70、80、90，或100、200、300、400、500、600、700、800、900或 1000个核苷 酸或氨基酸。
[0042] "杂交"意指氢键结，其可为互补核碱基之间的瓦特生-克里克（Watson-Crick)、 胡格斯丁（Hoogsteen)或反向胡格斯丁氢键结。例如，腺嗓呤和胸腺喃啶为通过形成氢键 而配对的互补核碱基。
[0043] 所谓"单离的多核苷酸"意指核酸（例如，DNA)，其不含在衍生本发明的核酸分 子的生物体的自然产生基因组中会在所述基因侧面的基因。因此，所述术语包含，例如，并 入质体、并入自发性复制的质体或病毒、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA的重组 DNA ;或存在为无关其它序列的个别分子者（例如，藉由PCR或限制性内切酶酶切而产生的 cDNA或基因组或cDNA片段）。此外，所述术语包含从DNA分子转录的RNA分子，以及为编 码额外多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
[0044] 所谓"单离的多肽〃意指已自天然伴随的组分分离的本发明的多肽。典型地，当多 肽至少60重量％自与其天然联结的蛋白质和自然产生的有机分子游离时，所述多肽为单 离的。优选地，制备本发明的多肽的至少75%，更优选为至少90%，以及最优选为至少99 重量％。本发明的单离多肽可，例如，藉由萃取自天然来源；藉由表达编码此多肽的重组核 酸；或藉由化学合成蛋白质而获得。纯度可藉由任何适当的方法，例如，柱色谱法、聚丙烯酰 胺凝胶电泳法而测量，或藉由HPLC分析。
[0045] 所谓"标志"意指任何具有联结疾病或异常的表达水平或活性变化的蛋白质或多 核苷酸。
[0046] 如本文中所使用，"获得一剂"中的"获得"包含合成、购买或取得所述剂。
[0047] "引物组"意指一组可使用于如PCR的寡核苷酸。引物组会由至少2、4、6、8、10、12、 14、16、18、20、30、40、50、60、80、100、200、250、300、400、500、600 或更多个引物所组成。
[0048] 如本文中所使用，"重组"包含参考使用表达编码多肽的异源多核苷酸的细胞而产 生的多肽。细胞产生重组多肽，因为彼等已藉由导入适当的单离的核酸序列而被基因上地 改变。所述术语亦包含参考细胞或核酸或质体，其是已藉由导入异源核酸或将天然核酸改 变成对所述细胞而言非天然形式而改性，或所述细胞是衍生自因此改性的细胞。因此，例 如，重组细胞表达非发现于细胞的天然（非重组）形式内的基因、表达发现于天然形式内的 基因的突变体、或表达不正常地表达、表达不足或完全不表达的天然基因。
[0049] 所谓"减少"意指至少10%、5%、50%、75%，或100%的负向变化。
[0050] 所谓"参考品"意指标准或控制条件。
[0051] "参考序列"是定义为用作序列比较的基准序列。参考序列可为指定序列的子集或 全部；例如，全长cDNA或基因序列的节段或完整的cDNA或基因序列。至于多肽，参考多肽 序列长度将通常是至少约16个氨基酸，优选为至少约20个氨基酸，更优选为至少约25个 氨基酸，以及甚至更优选为约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸。至于核酸， 参考核酸序列的长度将通常是至少约50个核苷酸，优选为至少约60个核苷酸，更优选为至 少约75个核苷酸，以及甚至更优选为约100个核苷酸或约300个核苷酸或周围或之间的任 何整数。
[0052] 所谓"特异性地结合"意指识别和结合表达特定标志的癌症细胞，但实质上不会识 别和结合样本中的其它细胞的融合蛋白。
[0053] 所谓"实质上相同"意指对参考氨基酸序列（例如，本文所述氨基酸序列的任何一 者）或核酸序列（例如，本文所述核酸序列的任何一者）展现至少50%同一性的多肽或核 酸分子。优选地，此序列与用于比较的序列在氨基酸浓度或核酸方面有至少60%，更优选为 80%或85%，以及更优选为90%、95%或甚至99%相同。
[0054] 序列一致性典型地是使用序列分析软件（例如，Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center，1710University Avenue，Madison，Wis.53705，BLAST，BESTFIT，GAP 或 PILEUP/ PRETTYBOX程序）测量。此软件藉由分配多个取代、缺失及/或其它改性的同源性程度而比 对相同或相似的序列。保守性取代典型地包含内以下群组内的取代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精 氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在测定一致性程度的例示性方法中，可为使用BLAST程序，其 中一和^T icici之间的概率分数表示有密切相关的序列。
[0055] 所谓"受试者"意指哺乳动物，包含，但非限制于，人类或非人类的哺乳动物，诸如， 牛、马、犬、绵羊或猫。
[0056] 本文中所使用的"肿瘤"意指所有无论是恶性或良性的肿瘤细胞生长和增殖，而且 意指所有癌性前期和癌性的细胞和组织。
[0057] 应了解本文提供的范围为范围内所有值的速记。例如，应了解1至50的范围包含 任何数字、数字的组合或由 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50所组成群组的次范围。
[0058] 如本文中所使用，术语"治疗（treat) "、"治疗（treating) "、"治疗（treatment) " 等意指减少或改善与所述治疗联结的异常及/或症状。应将了解虽然未排除，治疗异常或 病症不需要完全移除与其联结的异常、病症或症状。
[0059] 除非具体地注明或从前后文显而易见，如本文中所使用，应了解术语"或"包含 边值。除非具体地注明或从前后文显而易见，如本文中所使用，应了解术语"一（a) "、"一 (an) "以及"所述"为单数或复数。
[0060] 除非具体地注明或从前后文显而易见，如本文中所使用，应了解术语"约"是技术 领域中的正常公差范围内，例如，平均值的2个标准差内。应了解"约"是在注明的值的 10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0· 5%、0· 1%、0· 05%或 0· 01% 内。除非前 后文清楚显示，否则本文提供的所有数值是由术语"约"改变。
[0061] 本文变量的任何定义中的化学群组列表的叙述包含将变数定义成任何单一群组 或所列群组的组合。本文的变数或态样的具体实施例的叙述包含那具体实施例作为任何单 一具体实施例或与任何其它具体实施例或其部分的组合。
[0062] 本文提供的任何组成物或方法可与本文提供的一种或多种任何其它组成物和方 法组合。

【专利附图】

【附图说明】
[0063] 图1是显示于40天进行吉西他滨+顺铂；ALT-801 ;或吉西他滨+顺铂+ALT-801 的两个治疗循环后，裸鼠中的皮下人类UMUC-14膀胱肿瘤异体移植物的肿瘤体积平均值变 化的图表。
[0064] 图2是显示48天进行以11天休息隔开的吉西他滨+顺铂；吉西他滨 +MART-lscTCR/IL-2 ;ALT-801 ;或吉西他滨+ALT-801的两个治疗循环后，裸鼠中的皮下人 类UMUC-14膀胱肿瘤异体移植物的肿瘤体积平均值变化的图表。
[0065] 图3是显示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2与化学疗法疗方的组合对裸鼠中的皮 下人类膀胱UMUC-14异体移植物的生长效果的图表。
[0066] 图4是显示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2与化学疗法疗方的组合对小鼠体重效 果的图表。
[0067] 图5是显示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2与化学疗法疗方的组合对裸鼠中的皮 下人类膀胱KU7P异体移植物的生长效果的图表。
[0068] 图6是显示ALT-801和MART-lscTCR/IL-2与化学疗法疗方的组合对小鼠体重效 果的图表。
[0069] 图7是显示吉西他滨、ALT-801以及MART-lscTCR/IL-2对裸鼠中的皮下人类膀胱 KU7P异体移植物的生长效果的图表。
[0070] 图8是显示以ALT-801或PBS (对照组）治疗得到原位MB49Iuc肿瘤的白子 C57BL/6小鼠的存活率的图表。
[0071] 图9A是显示以ALT-801或PBS (对照组）治疗得到原位MB491uc肿瘤的C57BL/6 小鼠的存活率的图表。图9B为显示未接受治疗或以ALT-801治疗的C57BL/6小鼠的原位 MB491uc肿瘤的生物发光的影像。
[0072] 图10是显示以ALT-801或PBS (对照组）治疗得到原位MB491uc肿瘤的C57BL/6 小鼠的存活率的图表。
[0073] 图11是显示以ALT-801治疗具有MB491UC浅表性膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠的存 活率的图表。
[0074] 图12A和12B是显示以ALT-801每周治疗一次（"1X4"）（图12A)或每周治疗两 次（"2X4"）（图12B)(为期四周）具有MB491UC浅表性膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠，的存活 率的图表。
[0075] 图13是来自以PBS或ALT-801治疗后的正常和带有MB491uc肿瘤的C57BL/6小 鼠的经H&E-染色的膀胱组织剖面影像。
[0076] 图14A和14B是显示来自以PBS或ALT-801治疗后的正常和带有MB491uc肿瘤的 C57BL/6小鼠的PMBC(图14A)和脾脏（图14B)中的免疫细胞群体的图表。
[0077] 图15是显示来自以PBS或ALT-801治疗后在研宄第10天的带有MB491uc肿瘤的 C57BL/6小鼠的膀胱组织剖面的经染色的巨噬细胞的影像。
[0078] 图16A和16B是显示来自以PBS或ALT-801治疗后的正常（图16A)和带有MB491uc 肿瘤的C57BL/6小鼠（图16B)的膀胱中的巨噬细胞的浓度变化的图表。
[0079] 图17A和17B是显示以PBS或ALT-801治疗后的正常和带有MB491uc肿瘤的 C57BL/6小鼠的尿中IFNy (图17A)和TNFa (图17B)的变化的图表。
[0080] 图18是显示以ALT-801而非IL-2治疗延长带有原位MB491UC膀胱肿瘤的小鼠的 存活率的图表。在研宄第O天，以聚赖氨酸预处理膀胱后，对C57BL/6小鼠（10至11周龄） 膀胱内滴注1849111(：细胞（31104个细胞/膀胱）。在1^49111(3肿瘤细胞滴注后第7、10、14 以及17天，静脉内给药六1^'-801(1.611^/1^，11 = 8)，1'11^2(0.4211^/1^，11 = 8)或？135(100 4 1^ η = 8)。显示比较研宄组的卡普兰-迈耶（Kaplan-Meier)存活曲线。
[0081] 图19Α至19D描述Μ0、ΝΚ、⑶4以及⑶8细胞耗尽对带有小鼠 MB491uc原位膀胱 肿瘤的C57BL/6小鼠中的ALT-801功效的效果。图19Α是描述给药ALT-801的小鼠相较于 给药PBS的小鼠的存活率的图表。图19B是描述给药ALT-801和藉由于研宄第2、3、6、9、13 以及16天腹腔内注射抗NK抗体（Ab)(克隆PK136,100 μ L中有250 μ g)而使NK细胞耗尽 的小鼠相较于给药PBS的小鼠的存活率的图表。图19C是描述给药ALT-801和藉由于研宄 第6、9、13以及16天腹腔内注射氟弗松（Clophosome) (150yL/剂量）而使M0耗尽的小鼠 相较于给药PBS的小鼠存活率的图表。图19D是描述给药ALT-801和藉由于研宄第2、3、 6、9、13以及16天腹腔内注射抗〇)4413(克隆61(1.5，10(^1^中有25(^8)和抗〇)8413(克 隆53-6. 72,100 μ L中有250 μ g)而使⑶4和⑶8细胞耗尽的小鼠相较于给药PBS的小鼠 的存活率的图表。展示卡普兰-迈耶存活绘图。P值<0.05被认为是显著的。
[0082] 图20是描述带有小鼠 MB491UC原位膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠的血液MDSC浓度的 变化的图表。条状物表示平均值土SEM。*与对照组比较为P彡0. 05。
[0083] 图21是带有MB491UC原位膀胱肿瘤的小鼠膀胱中的巨噬细胞的免疫组织化 学染色影像。于研宄第0天，小鼠接收MB491UC滴注，而且11天后静脉内接收PBS或 ALT-801 (1.6mg/kg)治疗。治疗之后24小时牺牲小鼠，并且收集膀胱以染色。将膀胱剖面 以抗iNOS (Ml巨噬细胞标志）及抗MMP-9 (M2巨噬细胞标志）及抗F4/80 (巨噬细胞pan标 志）Abs染色。显示代表性组织剖面。放大率为200x。
[0084] 图22是描述免疫细胞子集在C57BL/6小鼠中的血清IFN- γ浓度的ALT-801介导 诱发中的角色的图表。将C57BL/6雌性小鼠腹腔内注射抗CD4(GK1. 5)、抗CD8(53-6. 72) 及/或抗NKL l(PK136)Abs，以耗尽免疫细胞子集。接着，将小鼠静脉内注射1.2mg/kg ALT-801，并于24小时后以ELISA测定血清IFN-γ浓度。条状物表示平均值土标准误差 (η = 5/ 群组）。
[0085] 图23是描述IFN-γ对MB491uc细胞体外生长的效果的图表。MB491uc细胞（2χ 1〇5/孔）是在有Ing/mL或10ng/mL IFN-γ的RPMI-10中培养2天。MB491UC细胞的凋亡 是于膜联蛋白V染色后以流式细胞仪测定。
[0086] 图24是描述ALT-801诱发的针对MB491uc肿瘤细胞的LAK细胞细胞毒性的图表。 淋巴激素活化杀手细胞（LAK)是从小鼠脾细胞制备，接着以20nM ALT-801进行体外活化3 天。LAK 细胞（4x IO6/ 孔）与 PKH67 标示的 MB491uc (4x IO5/ 孔）在有 0 至 50nM ALT-801 的RPMI-10中培养。24小时后采收培养细胞，并且以0. OOlmg/mLPI标示。死PI1B491UC 细胞的百分比是以流式细胞仪测定。
[0087] 图25是描述吉西他滨减少带有MB491uc肿瘤的小鼠中的脾细胞MDSC浓度的图 表。将雌性C57BL/6小鼠静脉内注射MB491uc细胞（Ix 106/小鼠）。10天之后，将一个 群组的小鼠以40mg/kg吉西他滨静脉内治疗。3天后牺牲小鼠，并且将脾细胞单离。脾脏 Grl+⑶llb+MDSCs的百分比是以流式细胞仪测定。
[0088] 图26描述磁性分选后MDSC纯度的流式细胞仪分析。以MACS柱正向选择的细胞 是以抗⑶Ilb-PE和抗Grl-FITC抗体染色。稍后进行过继转移（adoptive transfer)的 ^1化+61*1+细胞具有96%的纯度。
[0089] 图27是描述ALT-801以MDSC过继转移后的免疫细胞而诱发肿瘤细胞杀死的图 表。收集来自MDSC接收方小鼠（黑色）或载体对照组的小鼠（白色）的脾细胞，并且藉由 与50nM ALT-801培育而活化成LAK细胞。接着将LAK效应细胞与MB491uc目标细胞混合， 以评估彼等的细胞溶解活性。亦标绘来自没有ALT-801活化的新鲜脾细胞的数据以及杀死 期期间添加 ALT-801后所评估的细胞溶解活性。*林：P〈0. 001。η = 2。
[0090] 图28描述针对临床试验第Ι/ΙΙ期的尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺 铂的组合给药的研宄设计和治疗方案。
[0091] 图29描述针对临床试验第I/II期的尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺 铂的组合给药的研宄设计和治疗方案。
[0092] 图30描述在尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺铂的组合给药的临床试 验第I/II期的患者人口统计变量和疾病状态。
[0093] 图31描述在尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺铂的组合给药的临床试 验第I/II期中的肿瘤评估。
[0094] 图32描述在尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺铂组合给药的临床试验 第Ι/Π 期中，给药ALT-801的患者的客观反应。
[0095] 图33描述在尿道上皮细胞癌中ALT-801与吉西他滨和顺铂组合给药的临床试验 第Ι/Π 期中，给药ALT-801的患者的无恶化存活期。
[0096] 图34是描述给药ALT-801的患者中增加的血清IFN-γ浓度（左区块：0. 04mg/kg ALT-801 ;右区块：0.06mg/kg ALT-801)的图表。

【具体实施方式】
[0097] 本发明提供治疗癌症或其症状的方法，包括对受试者（例如，哺乳动物，诸如，人 类）给药治疗有效量的包括IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的医药组成物。因此，一个 具体实施例为治疗患有或易得到癌症或其症状的受试者的方法。所述方法包含在治疗癌症 的条件下，对哺乳动物给药足以治疗癌症或其症状的治疗量的IL-2融合蛋白和一种或多 种治疗剂的步骤。本发明亦提供治疗癌症或其症状的方法，包括对受试者（例如，哺乳动 物，诸如，人类）单独给药治疗有效量的IL-2融合蛋白。
[0098] 本发明至少部分是基于对具有膀胱癌（本文亦称为尿道上皮细胞癌）的受试者给 药IL-2融合蛋白与一种或多种治疗剂的组合1)改善了癌症，2)减少了肿瘤负担，3)增加 了受试者的存活，以及4)诱发针对癌症的耐久性免疫记忆反应的发现。此外，发现IL-2融 合蛋白与一种或多种治疗剂的组合对于治疗化学抗性膀胱癌是有效的。再者，发现不特异 性地以癌症细胞或组织为目标的IL-2融合蛋白，如特异性地以癌症细胞为目标的IL-2融 合蛋白，对治疗膀胱癌上是有效的，。在某些具体实施例中，发现IL-2融合蛋白单一疗法对 于治疗膀胱癌（包含化学抗性的癌症）是有效的。
[0099] 已充分认知免疫治疗，包含IL-2,为用于增强针对某种癌症类型的抗肿瘤免 疫力的有效方法。IL-2对包含T和B细胞、单核细胞、巨噬细胞、淋巴激素活化杀手细 胞（LAK)以及NK细胞的一些免疫细胞类型具有刺激效果（Waldmann，T. A.，Nat Rev Immunol, 6:595-601，2006)。基于其提供耐久性且有冶愈性的抗肿瘤反应的能力，重组 人类IL-2 (Prokukin?)的全身性给药已核准治疗转移性黑色素瘤或肾脏细胞癌瘤患者 (Rosenberg，S.A.等人，Ann Surg, 210:474-484;讨论484-475, 1989 ;Fyfe，G.等人，J Clin Oncol, 13:688-696, 1995;以及 Atkins, M.B.等人，J Clin Oncol, 17:2105-2116, 1999)。 不幸地，与这治疗联结的可观毒性使在肿瘤的位置达到有效剂量是困难的，且限制了可 治疗的群体。例如，忍受剂量的IL-2的全身性治疗在实际上所有治疗患者中诱发淋巴 性活化，但只有在少数的这些个体中观察到抗肿瘤反应（R〇senberg，S.A.等人，Ann Surg，210:474-484 ;讨论484-475, 1989)。结果，高剂量IL-2的使用局限于有经验的人员 与专业的程序，而且其通常提供给有反应和具有优异的器官功能的患者（Tarhini，A.A.等 人，Curr Opin Investig Drugs, 6:1234-1239, 2005)。较低剂量的 IL-2 治疗同时具有较 少毒性和更多的方便性，产生较低反应速率且似乎是对于治疗转移性肿瘤无效（Yang，J. C.等人，J Clin Oncol, 21:3127-3132, 2003)。已显示以IL-2进行浅表性膀胱癌患者 的局部治疗（膀胱内）提供肿瘤退化，并且在一些临床研宄中延长的无退化时间（Den Otter, W.等人，J Urol, 159:1183-1186, 1998 ;and Den Otter, W.等人，Cancer Immunol Immuotherher，57:931-950, 2008)。在第2期研宄中，相较使用单剂或组合救援性化学疗 法所观察到的6至7个月，对顺铂有抗性的晚期/转移性尿道上皮癌瘤（其中65%为膀胱 癌）的患者全身性IL-2给药提供超过10个月的存活中位数，暗示对IL-2疗法的膀胱癌瘤 敏感性的进一步证据（Kim, J.等人，Urol Oncol, 21:21-26, 2003 ;以及 Gallagher, D. J.等 人，Cancer, 113:1284-1293, 2008)。然而，这些患者中的IL-2诱发毒性是显著的，并且限制 了治疗疗方（Kim, J.等人，Urol Oncol, 21:21-26, 2003)。因此，对于增强IL-2的冶愈效果， 减少其毒性，且在没有危害临床益助和扩张其效用超过目前核准的条件上的创新策略有迫 切需要。
[0100] 亦已显示特异性地以恶性肿瘤为目标的治疗策略是有效的。然而，虽然用于 膀胱癌的分子和基因标志已明显特征化，仍有使用针对膀胱癌的分子目标剂的少数 临床试验。使用针对HER-2/neu或VEGF的治疗抗体（Abs)或口服EGFR拮抗剂的晚 期/转移性膀胱癌的患者的最近临床研宄已显示相较于标准化学疗法无改善的功效 / 毒性剖面（Vaughn，D.J.，J Clin 0ncol，25:2162-2163,2007;Hussain，M.H.等人，J Clin 0ncol，25:2218-2224,2007;lHahn，N.M.等人，J Clin 0ncol，27:5018,2009;and Philips, G.K.等人，BJU Int，101:20-25, 2008)，表示这些目标不适用于膀胱癌。有趣地，基 因研宄说明膀胱癌肿瘤的发病机理主要是由两个分歧但重迭的途径所组成（Wu，X. R.，Nat Rev Cancer，5:713-725, 2005)。非肌肉侵入性膀胱肿瘤被认为是从简单和结节性增生发 生，而且得到成纤维细胞生长因子受体3、Ha-Ras以及PIK3CA基因中的频繁突变。肌肉 侵入性膀胱癌肿瘤被认为是源自原位扁平腺癌、重度言语障碍症或重生（de novo)。这些 肿瘤的至少50 %在肿瘤抑制物p53及/或成视网膜细胞瘤基因中含有缺陷（Rosser，C. J.等人，Expert Rev Anticancer Ther, 1:531-539, 2001)。与这发现一致，提升的 p53 的 肿瘤过度表达与膀胱癌患者中的转移性疾病的恶化相关（van Rhijn，B.W.G.等人，Cancer Research，64:1911-1914, 2004)。这亦由膀胱癌的转基因小鼠模式所支持。尿道上皮中表 达SV40大T抗原（其结合并且灭活p53蛋白质）的小鼠发展原位癌瘤和随机的肌肉侵 入性癌瘤，而过度表达Ha-ras的小鼠发展增生和浅表性疾病（Zhang，Z. T.等人，Onco基 因，20:1973-1980, 2001 ;and Zhang, Ζ· Τ·等人，Cancer Res, 59:3512-3517, 1999) ο
[0101] 申请人:辨识出肿瘤细胞中的ρ53蛋白以作为治疗干预的目标。肿瘤细胞中的 Ρ53基因中的错义突变的非常高频率出现和后续ρ53蛋白的过度表达创造晚期或转移性 膀胱癌瘤的患者中以ρ53作为肿瘤抗原而为目标的机会。ρ53为作用以遏止细胞增殖的 细胞内肿瘤抑制蛋白（Levine，A.J.等人，似1：1^6,351:453-456，1991;&11(1￥〇118(1611，1(· H. and Prives，C.，Cell, 120:7-10,2005)。当突变时，其丧失抑制不正常增殖的能力，并 且在肿瘤细胞中发生（Levine, A. J.等人，Nature, 351:453-456, 1991 ; & &Vousden，K. H. and Prives，C.，Cell, 120:7-10, 2005)。结果，p53突变/过度表达与肿瘤扩散和复 发与相关，而且与整体较低存活率和对各式各样的癌症类型（包含膀胱癌）中化学治 疗干预的抗性联结（van Rhijn，B.W.G.等人，Cancer Research, 64:1911-1914, 2004; Strano，S.等人，Oncogene, 26:2212-2219, 2007 ;and Goebell，P.J.等人，Urol Oncol, 28:377-388, 2010)。超过3, 400位膀胱癌患者的最近分析揭示肿瘤试样中可侦测 的P53过度表达相对于肿瘤分级和肿瘤期之间的高度显著相关（Goebell，P. J.等人，Urol Oncol，28:377-388, 2010)。肿瘤中的p53的过度表达亦与肿瘤恶化和晚期膀胱癌患者的差 存活率显著相关。由于正常组织中仅可侦测到低量的天然 P53,肿瘤相对于正常组织中所展 示的P53的差别创造出治疗性地以这蛋白为目标的机会。然而，p53为细胞内蛋白质，而且 非展示于细胞表面上，因此无法以Ab为主的剂接近。如同其它细胞内蛋白质，p53被处理， 而且P53胜肽是以HLA分子的形式呈现在细胞表面上。 申请人:辨识出HLA-A*0201呈现的 P53的胜肽表位（氨基酸264至272)以高浓度展示在不同人类肿瘤细胞和组织的表面上， 而正常组织不呈现可侦测浓度的此络合物。由于这表位是在P53中很少突变的区域内，其 细胞表面展示作为过度表达P53的肿瘤的广泛目标。 申请人:请求保护的方法部分是基于人 类肿瘤细胞的表面上的P53胜肽表位的展示。
[0102] 如本文中所使用，术语"治疗（treat) "、"治疗（treating) "、"治疗（treatment) "、 "疗法（therapy)"等意指减少或改善与所述治疗联结的异常及/或症状。应将了解虽然未 排除，治疗异常或病症不需要完全移除与其联结的异常、病症或症状。
[0103] 如本文中所使用，术语"预防（prevent) "、"预防（preventing) " "预防 (prevention) "、"预防治疗（prophylactic treatment) "等意指减少在不具有但有风险或 易于发展异常或病症的受试者中发展异常或病症的概率。
[0104] 如本文中所使用，术语"有效（effective) "、"功效（efficacy) "、"有效的 (effective) "等意指治疗、预防或改善与联结的疾病、异常及/或症状的能力。
[0105] 本发明的治疗方法（其包含预防治疗）中通常包括对有需要的受试者（例如，动 物、人类），包含哺乳动物，特别是人类，给药治疗有效量的IL-2融合蛋白与一种或多种治 疗剂的组合。此治疗将适合对患有、具有、易有癌症或有癌症的风险，特别是膀胱（或尿道 上皮）癌症的受试者（特别人类）给药。彼等"有风险"的受试者的测定可藉由受试者或 健康照护提供者的诊断试验或意见的任何客观或主观测定而进行（例如，基因试验、酵素 或蛋白质标志、标志（如本文中所定义）、家族历史等）。
[0106] 于一个具体实施例中，本发明提供一种监控治疗进度的方法。所述方法包含测定 患有或易有与癌症（特别是膀胱癌）联结的异常或其症状的受试者中的诊断标志（Marker) (例如，其蛋白质或指示剂等）的水平或诊断测量（例如，扫描、测定法、用于肿瘤尺寸评估 的扫描、手术移除的组织/活组织检查中的病理组织学评估等）的步骤，其中已对所述受试 者给药足以治疗疾病或其症状的治疗量的本文化合物。方法中的标志水平或测量的测定可 与健康正常控制者或其它饱受疾病所苦的患者中的标志的已知水平或测量比较，以建立受 试者的疾病状态。于优选的具体实施例中，受试者中的标志或测量的第二浓度是于测定第 一浓度后的时间点测试，而且比较两个浓度以监控疗法的病程或功效。在某些优选的具体 实施例中，受试者中的标志的预处理水平或测量是在根据本发明的开始处理之预定；这标 志的预处理水平或测量可接着与处理开始后受试者中的标志水平或测量比较，以测定处理 的功效。在某些优选的具体实施例中，治疗功效的监控是基于使用固体肿瘤委员会中的反 应评估标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Committee, RECIST) I. I 建议的新国际标准评估癌症的客观反应而完成。在其它具体实施例中，治疗功效是基于受 试者的整体存活或无恶化存活时间或存活率评估。
[0107] 医药组成物
[0108] 本文描述的方法仰赖于单独给药IL-2融合蛋白或随着一种或多种治疗剂给药。 本发明的IL-2融合蛋白包括与第二多肽融合的整个成熟IL-2多肽或其生物上有活性的片 段。在某些具体实施例中，第二多肽具有目标性功能，因为其特异性地结合癌症细胞上的表 位、胜肽、配位体或特征。据此，目标多肽的非限制性实例包含抗体和其抗原结合片段、T细 胞受体和其胜肽结合片段、以及受体和其配位体结合片段。能特异性地结合癌症细胞的任 何多肽可作为目标的IL-12融合蛋白的第二多肽。
[0109] 令人惊讶地，本发明提供有效作为所述方法中的目标IL-12融合蛋白的非目标性 IL-2融合蛋白。非目标IL-2融合蛋白的第二多肽包含抗体和其抗原结合片段、T细胞受体 和其胜肽结合片段、以及受体和其配位体结合片段。然而，这些案例中，第二多肽不特异性 地结合欲治疗的癌症细胞。于优选的具体实施例中，第二多肽为T细胞受体（TCR)，而且最 优选为单链T细胞受体（scTCR)。适合用于第二多肽的TCR分子的实例是描述于美国专利 第7,456,263号；美国专利第6,534,633号；美国专利申请公开案第旧2003/0144474号； 以及美国专利申请公开案第US2011/0070191号，其等全文是以参考方式纳入本文中。
[0110] 特别地，已产生具有显著地增加作为治疗分子的利用的TCR融合和接合络合物。 具体地，已创造融合分子的新类别，其增加细胞表面驻留时间，并且改善药物动力学剖面， 例如，这些分子具有较长的血浆半衰期。本发明亦提供编码此包括共价地连结生物上有活 性的多肽或分子的TCR分子的络合物的表达质体，以及制造方法和此融合和接合络合物及 表达质体和接合络合物的用途。
[0111] T细胞藉由在细胞表面上表达T细胞受体的方式而识别呈现在细胞表面上的抗 原。TCR是双硫链接的异二聚体，大部分是由α和β链醣蛋白质所组成。相似于在B细 胞中所操作用于产生抗体多样性的机转，T细胞使用机转以产生彼等受体分子的多样性 (Janeway and Travers ;Immunobiology 1997)。与免疫球蛋白基因相似，TCR基因是由在T 细胞的发展期间重新排列的节段所构成。TCR多肽是由氨基终端可变和羧基终端恒定区域 所组成。羧基终端区域作用为跨膜固定区且当受体被占用时参予细胞内信号传送的同时， 可变区域负责识别抗原。TCRa链含有仅由V和D节段所编码的可变区域，同时β链含有 额外的连结（J)节段。这些节段的重新排列和可变区域的突变和成熟造成能识别令人难以 置信的大数量的不同TCR分子中展示的不同抗原的TCR的多样谱型（repertoire)。
[0112] 先前已发展技术以产生识别特定抗原的高度特异性T细胞受体（TCR)。例如，待审 查的美国专利申请案u. S. S. N. 08/813, 781和美国专利第6, 534633号，其等全文是藉由参 考方式纳入本文中；以及国际公开案PCT/US98/04274和PCT/US99/24645,而且其中讨论的 参考文献揭露制备和使用特异性TCR的方法。额外地，特定特异性TCR已藉由重组方法而 产生成为可溶性、单链TCR(scTCR)。已揭露用于产生和scTCRs的方法和用途，而且描述于 国际申请案PCT/US98/20263,其是以参考方式并入本文中。可改变此TCR和scTCR，以便创 造融合物或接合物以产生有用于作为治疗剂的TCR和scTCR。本发明的TCR络合物可产生 藉由将重组地产生的TCR或scTCR编码区基因上稠合编码生物上有活性的多肽或分子的基 因，而产生TCR融合接合物。或者，TCR或scTCRs亦可将生物上有活性的分子化学地结合， 以产生TCR接合络合物。
[0113] 本文所使用的术语"融合分子"意指藉由重组、化学或其它适合的方法共价地连结 (亦即，稠合）的IL-2和第二多肽，诸如，TCR结构域。若有需要，融合分子可通过胜肽连接 子序列于一个或多个位置融合。或者，胜肽连接子可用以协助融合分子的构筑。本发明的 融合分子展现使其等作为较佳的治疗分子的改善特征。
[0114] 本文所使用的术语"增加的细胞表面驻留时间"说明请求保护的融合分子与细胞 表面上的蛋白质联结比单独融合分子的任何组分更长的时期。在某些具体实施例中，细胞 表面驻留时间增加 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或更高。
[0115] 本文所使用的术语"血清半衰期"或"血浆半衰期"意欲说明当本发明的融合分子 的浓度或量在身体中减少至特定浓度或量的切确二分之一时所需的时间。本发明的融合 分子展示比当IL-2未于融合分子中时显著更长的衰期。例如，当非为融合蛋白一部分时， 至于请求保护分子的组分的血清半衰期，所揭露的分子的血清半衰期可增加20%、30%、 40 %,50 %,60 %,70 %,80 %,90 %U00 %>200 %,300 %,400 %,500 %,750 %Λ000 %, 1250 %、1500 %、1750 %、2000 % 或更高。
[0116] "多肽"意指无论其尺寸，优选的基本上由20个天然氨基酸的任何者所组成的任 何聚合物。虽然术语"蛋白质"通常是参考相对大的蛋白质使用，"胜肽"通常是参考小多肽 使用，这些术语的使用通常在本领域中重迭。除非注明，否则术语"多肽"通常意指蛋白质、 多肽以及胜肽。如由标准分子测尺寸技术诸如离心或SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法所判断， 根据本发明有用的胜肽通常将在约〇. 1和100KD或更高达1000KD之间，优选在约0. 1、0. 2、 0· 5、1、2、5、10、20、30 以及 50KD 之间。
[0117] 额外地，IL-2融合蛋白可为适合用于诊断或成像研宄，诸如，荧光标记，诸如，绿色 荧光蛋白质、藻红蛋白、细胞色素或德州红；或放射性核素，例如，碘-131、纪-90、铼-188或 铋-212的可侦测地标示分子。参见，例如，Moskaug,等人J.Biol.Chem. 264,15709(1989); Pastan, I.等人·Cells 47,641，1986 ;Pastan 等人，Recombinant Toxins as Novel Therapeutic, Ann. Rev. Biochem.61,331, (1992) ;〃Chimeric Toxins^Olsnes and Phil, Pharmac. Ther. , 25, 355 (1982);公开 PCT 申请案第 WO 94/29350 号；公开 PCT 申请案 第WO 94/04689号；以及美国专利5, 620, 939的有关制造和使用包括效应物或标志的蛋白 质的揭示内容。
[0118] -个IL-2融合蛋白的具体实例如下：sc-TCR，诸如，融合IL-2的 c264sc-TCR(ALT-801)可藉由转染哺乳动物细胞而产生。融合络合物的c264scTCR/ IL-2蛋白识别来自以人类HLA抗原；HLA-2. 1形式呈现的人类野生型p53肿瘤抑制蛋白 的处理的胜肽片段。c264scTCR和其胜肽配位体已描述于Card等人，Cancer Immunoll Immuother(2004)53:345,Belmont,等人 Clin Immunol. (2006) 121:29, and Wen,等人 Cancer Immunother. (2008) 57:1781。c264scTCR识别的人类 p53 (氨基酸 264 至氨基酸 272) 胜肽序列（本文中称为264胜肽或p264)为LLGRNSFEV。肿瘤抑制蛋白p53的表达在恶性 细胞上向上调节。在本发明的特定具体实施例中，由c264scTCR/IL-2蛋白融合辨别在其表 面上呈现P53 (氨基酸264至氨基酸272)胜肽/HLA-A2络合物的肿瘤细胞促进针对肿瘤细 胞的免疫活性，特此提供抗癌症治疗活性。这目标识别可有益于治疗具有过度表达P53的 肿瘤（包含膀胱肿瘤）的受试者。
[0119] 本发明的其它融合分子包括融合对联结的肿瘤或病毒胜肽抗原（包含衍生自 MART-l、gplOO、MAGE、HIV、甲、乙以及丙型肝炎、CMV、氨基酸V、LCMV、JCV、流行性感冒、HTLV 以及其它病毒者）有特异性的其它scTCR的IL-2,其中，所述scTCR直接或通过连接子连结 IL-2〇
[0120] 此外，IL-2融合蛋白可进一步包括额外的多肽标志。例如，一个标志是在生理pH， 诸如，例如，6xHIS，带有电荷的多肽。在这种情况下，TCR融合物或接合络合物可藉由可商购 的金属-琼脂糖凝胶基质（诸如，Ni-琼脂糖凝胶，其能在约pH 6至9特异性地结合6xHIS 标志）而纯化。EE表位和myc表位为适合的蛋白质标志的进一步实例，而且表位可以一种 或多种可商购单克隆抗体特异性地结合。
[0121] 如所注明，本文揭露的融合蛋白的组分，例如，IL-2和第二多肽，可以几乎任何方 式组织，前提为IL-2融合蛋白具有意欲功能。特别地，若有需要，融合蛋白的各组分可以 至少一个适合的胜肽连接子序列隔开另一种组分。再者，组分可藉由连接子以定位，致使 IL-2可结合其受体，并且提供最佳免疫刺激活化性及/或第二多肽可结合其受体/配位体 和介导其活性。额外地，例如，融合蛋白可包含标志，以利于辨识及/或纯化融合蛋白。
[0122] 本发明的IL-2融合蛋白具有令人惊讶的增加 IL-2的血浆半衰期（超过单独IL-2 的血浆半衰期）或结合细胞表面蛋白质（例如，细胞表面受体）的融合分子的表面驻留时 间（超过单独IL-2的表面驻留时间）的能力。本发明的IL-2融合蛋白可具有增加分子的 血浆半衰期和增加分子的表面驻留时间的能力，藉此导致请求保护的分子的功效的显著增 加。
[0123] 通常，本发明的IL-2融合蛋白的制备可藉由本文所揭露的程序和藉由涉及识别 重组DNA技术而达成，例如，聚合酶链式扩增反应（PCR)、质体DNA的制备、以限制酶断裂 DNA、寡核苷酸的制备、DNA的连接、mRNA的单离、将DNA引入适合的细胞、宿主的转化或转 染、宿主的培养。额外地，融合分子可用离散剂和公知的电泳、离心以及色谱方法纯化单 离和纯化。通常，参见 Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratoty Manual (2nd ed. (1989) ；and Ausubel 等人,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons，New York(1989)的有关这些方法的揭示内容。
[0124] 本发明进一步提供编码本发明的融合蛋白的核酸序列且特别为DNA序列。优选 地，DNA序列是由适合染色体外复制的质体所携带，诸如，噬菌体、病毒、质体、噬菌粒、黏粒、 YAC或附加体。特别地，编码期望的融合蛋白的DNA质体可用以促进本文描述的制备性方 法，而且获得显著量的融合蛋白。DNA序列可插入适当的表达质体，亦即，含有用于插入的蛋 白质编码的序列的转录和翻译所需要的组件的质体。各式各样的宿主-质体系统可用以表 达蛋白质编码的序列。这些包含感染病毒（例如，牛痘病毒、腺病毒等）的哺乳动物细胞系 统；感染病毒（例如，杆状病毒）的昆虫细胞系统；微生物体，诸如，酵母含有酵母质体，或 以细菌噬菌体DNA、质体DNA或黏粒DNA转化细菌。取决于所利用的宿主-质体系统，可使 用一些适合的转录和翻译组件的任何一者。通常，参见前述的Sambrook等人，以及前述的 Ausubel 等人。
[0125] 通常，根据本发明的优选的DNA质体包括以磷酸二酯键连结的核苷酸序列，其包 括5'至3'方向的第一克隆位置以引入编码TCR链的第一核苷酸序列，其操作性连结编码 IL-2的序列。
[0126] 在大部分的情况下，优选为DNA质体编码的各融合蛋白组分是以"盒（cassette) " 形式提供。所谓术语"盒"意指各组分可轻易地以标准重组方法取代另一种组分。
[0127] 为了制造编码TCR融合络合物的质体，编码TCR分子的序列藉由使用适合的连 接酶连结编码IL-2的序列。编码呈现的胜肽的DNA可藉由从天然来源（诸如，适合的 细胞系）单离DNA或藉由已知的合成方法，例如，磷酸酯三酯方法而获得。参见，例如， Oligonucleotide Synthesis, IRL Press (M. J. Gait, ed.，1984)。合成的寡核苷酸亦可使用 可商购的自动化的寡核苷酸合成器制备。一旦单离，编码TCR分子的基因可藉由聚合酶链 式反应（PCR)或其它【技术领域】中已知的手段扩增。扩增TCR胜肽基因的适合的PCR引物的 可给PCR产物添加限制位点。PCR产物优选地包含IL-2多肽的剪接位点，而且TCR-IL-2融 合络合物的适当的表达和分泌所需的前导序列。PCR产物亦优选为包含编码连接子的序列， 或用于连接此序列的限制酶位置的序列。
[0128] 本文描述的融合蛋白优选地是藉由标准重组DNA技术而产生。例如，一旦单离编 码TCR蛋白的DNA分子，序列可连接编码IL-2多肽的另一种DNA分子。编码TCR分子的核 苷酸序列可直接连结编码IL-2胜肽的DNA序列，或更典型地，本文讨论的编码连接子序列 的DNA序列可插入编码TCR分子的序列和编码IL-2胜肽的序列之间，并且使用适合的连接 酶连结。产生的杂合DNA分子可于适合的宿主细胞中表达，以产生IL-2融合蛋白。DNA分 子以5'至3'定向彼此连接，致使于连结后，编码多肽的翻译框未改变（亦即，DNA分子于 框内彼此连接）。产生的DNA分子编码框内融合蛋白。
[0129] 其它核苷酸序列亦可包含于基因构筑物中。例如，控制编码与IL-2胜肽融合的 TCR胜肽的序列的表达的启动子序列，或将IL-2融合蛋白导向细胞表面或培养基的前导序 列可包含构筑物中或存在于于其中插入构筑物的表达质体中。特别优选为免疫球蛋白或 CMV启动子。
[0130] 融合蛋白的组分可以几乎任何顺序组织，前提为各者能进行其所欲功能。例如，在 一个具体实施例中，TCR是位于IL-2分子的C或N终端。
[0131] 如所注明，根据本发明的融合分子或结合分子可以许多方式组织。在例示性构型 中，TCR的C-端操作性地连结IL-2分子的N-端。若有需要，此连结可以重组方法达成。然 而，在另一个构型中，TCR的N-端连结IL-2分子的C-端。
[0132] 连接子序列优选地包括约1至20个氨基酸，更优选包括约1至16个氨基酸。优 选地，连接子序列有弹性，故能不以单一不期望的构象拉牢IL-2。连接子序列可用以，例如， 将识别位置与融合分子隔开。具体地，胜肽连接子序列可位于TCR链和IL-2胜肽之间，例 如，以相同地化学交联且提供分子弹性。优选地，连接子主要包括具有小侧链的氨基酸，诸 如，甘氨酸、丙氨酸以及丝氨酸，以提供弹性。优选地，约80或90百分比或更高的连接子 序列包括甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。至于含有异二聚体 的TCR IL-2融合蛋白，连接子序列适合地连结TCR分子的β链，虽然连接子序列亦可附 接TCR分子的α链。或者，连接子序列可连结至TCR分子的α和β链两者，以创造单链 分子。适合的连接子序列是 SGGGGSGGG(亦即，Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly)、 TSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSS以及VNAKTTAPSVYPLAPVSQ。可使用不同的连接子序列包含任 何数目的已成功地使用将抗体可变区域连接在一起的弹性连接子设计，参见Whitlow，M. 等人，（1991)方法：A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105。适合的连接子序 列可轻易地依经验辨识。额外地，连接子序列的适合的尺寸和序列亦可藉由基于TCR分子 的预测尺寸和形状的传统计算器模拟技术而测定。
[0133] 可采用一些策略以表达本发明的IL-2融合蛋白。例如，上述IL-2基因融合构筑 物可以已知手段（诸如，藉由限制酶的使用而在用于插入构筑物的质体中造成切口，接着 连接）并入适合的质体。接着将含有基因构筑物的质体引入适合的宿主以表达IL-2融合 胜肽。通常，参见前述的Sambrook等人。基于有关克隆化实验计划的因素，可实验地进行 适合的质体的选择。例如，质体应与被采用宿主的兼容，而且具有适合被采用宿主的复制 子。又，质体必须能容纳编码欲表达的IL-2融合蛋白的DNA序列。适合的宿主细胞包含真 核和原核细胞，优选为彼等可在培养基中轻易地转化和展现快速生长的细胞。特定优选的 宿主细胞包含原核生物，诸如，大肠杆菌（E. coli)、枯草杆菌（Bacillus subtillus)等以 及真核生物，诸如，动物细胞和酵母菌株，例如，酿酒酵母（S. cerevisiae)。哺乳动物细胞 通常为优选的，特别是J558、NS0、SP2-0或CH0。其它适合的宿主包含，例如，昆虫细胞诸如 Sf9。采用传统的培养条件。参见前述的Sambrook。接着，可选择安定的转化或转染的细胞 系。表达本发明的TCR融合络合物的细胞可以已知的程序测定。例如，连结免疫球蛋白的 TCR融合络合物的表达可以对连结免疫球蛋白有特异性的ELISA及/或免疫印渍测定。
[0134] 如上述通常，宿主细胞可用于制备性目的，以扩增编码期望的融合蛋白的核 酸。因此，宿主细胞可包含其中具体意欲产生融合蛋白的原核或真核细胞。因此，宿主 细胞具体地包含能扩增编码融合物的核酸的酵母菌、蝇、蠕虫、植物、青蛙、哺乳动物细 胞以及器官。可使用的哺乳动物细胞系的非限制性实例包含CHO dhfr-细胞（Urlaub and Chasm, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980))、293 细胞（Graham 等人，J Gen. Virol. ,36:59 (1977))或类骨髓瘤细胞 SP2 或呢0(6&1仕6311(1]\^18七6丨11，]^也· Enzymol. , 73(B) :3(1981)) 〇
[0135] 能扩增编码期望的融合蛋白的核酸的宿主细胞涵盖非哺乳动物真核细胞，包含昆 虫（例如，秋夜盗蛾（Sp. frugiperda))、酵母（例如，酿酒酵母、粟酒裂殖酵母（S. pombe)、 毕赤酵母（Ρ· pastoris.)，乳酸克鲁维酵母（Κ· lactis)、多形汉森酵母（Η· polymorpha);如 Fleer, R. , Current Opinion in Biotechnology, 3 (5) :486496 (1992)) 一般性评论、真菌以 及植物细胞。亦预期某种原核生物，诸如大肠杆菌和杆菌（Bacillus)。
[0136] 编码期望的融合蛋白的核酸可以用于转染细胞的标准技术引入宿主细胞。术语 "转染（transfecting) "或"转染（transfection) "意欲涵盖用于将核酸引入宿主细胞的所 有传统的技术，包含磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射、 病毒转导及/或整合。用于转染宿主细胞的适合的方法可发现于前述的Sambrook等人， 以及其它实验室教科书。
[0137] 本发明进一步提供用于单离IL-2的感兴趣的融合蛋白的产生过程。在过程中，已 引入编码操作性地连结调控序列的感兴趣的蛋白质的核酸的宿主细胞（例如，酵母菌、真 菌、昆虫、细菌或动物细胞）在培养基中和融合蛋白的存在下以生产规模生长，以刺激编码 感兴趣的融合蛋白的核苷酸序列的转录。随后，从采收的宿主细胞或从培养基单离感兴趣 的融合蛋白。标准蛋白质纯化技术可用以从培养基或从采收的细胞单离感兴趣的蛋白质。 特别地，纯化技术可用以表达和纯化来自各式各样的器具，包含轧辊瓶、旋转器烧瓶、组织 培养盘、生物反应器或发酵器的大规模（亦即，以至少数毫克量计）的期望的融合蛋白的纯 度。
[0138] 表达的IL-2融合蛋白可藉由已知方法单离和纯化。典型地，将培养基离心，并且 接着以亲和性或免疫亲和性色谱法，例如，蛋白质-A或蛋白质-G亲和性色谱法或免疫亲和 性实验计划（包括使用结合表达的融合络合物（诸如，连结的TCR或其免疫球蛋白区域） 的单克隆抗体）纯化上清液。本发明融合蛋白可藉由已知技术的适当组合而分离和纯化。 这些方法包含，例如，利用溶解度诸如盐沉淀和溶剂沉淀的方法、利用分子重量的差异的方 法诸如透析、超过滤、凝胶过滤以及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法、利用电荷差异的方法诸 如离子交换柱色谱法、利用特定亲和性的方法诸如亲和性色谱法、利用疏水性差异的方法 诸如反相高效液相色谱法以及利用等电点差异方法诸如等电聚焦电泳、金属亲和性柱诸如 Ni-NTA。通常，参见前述的Sambrook等人以及前述的Ausubel等人的有关这些方法的揭示 内容。
[0139] 优选地，本发明IL-2融合蛋白是实质上纯的。亦即，融合蛋白已从天然伴随的细 胞取代物单离，致使融合蛋白优选地以至少80%或90%至95%同构型（重量/重量）存在。 对于许多医药、临床以及研宄应用而言，融合蛋白最优选具有至少98至99%同构型（重量 /重量）。一旦实质上地纯化，融合蛋白应实质上不含污染物已用于治疗应用。一旦部分地 纯化或有实质纯度，可治疗地使用可溶性融合蛋白，或以本文揭露的体外或体内测定法中 进行。实质纯度可以各式各样的标准技术诸如色谱法和凝胶电泳法测定。
[0140] 本发明的截断的IL-2融合蛋白含有足以截断的TCR分子，使得TCR融合络合物于 表达之后可分泌入培养基。因此，截断的IL-2融合蛋白将不包含富含疏水性残基的区域， 典型为TCR分子的跨膜和细胞质结构域。因此，例如，至于本发明的优选的截断TCR分子， 优选为TCR分子的β链的残基约199至237和α链的残基约193至230不包含于截断的 TCR融合络合物中。
[0141] 有关融合蛋白的术语"错误折迭"意指部分地或完整未折叠（亦即，变性）的蛋白 质。融合蛋白可藉由接触以下讨论的一种或多种离散剂而部分地或完整错误折迭。更通常 地，本文揭露的错误折迭融合蛋白为相应的天然蛋白质的高吉布斯自由能（AG)形式的代 表。优选为通常为正确折迭的天然融合蛋白，其可完全溶于水溶液，而且具有相对低AG。 据此，天然融合蛋白在大部分情况下是安定的。
[0142] 藉由传统的策略或传统的策略的组合而侦测融合蛋白错误折迭是可能的。例如， 错误折迭可藉由各式各样的传统的生物物理技术，包含使用天然（对照组）和错误折迭分 子的旋光度测量而侦测。
[0143] 所谓术语"可溶性"或相似术语意指融合分子，特别是在低G力离心下（例如，标 准离心中每分钟少于约30, 000旋转）不轻易地从缓冲水溶液（例如，细胞培养基）沉降的 融合蛋白。再者，若融合分子于在低浓度或无浓度的阴离子性或非离子性的清洁剂的存在 下，在大于约5至37°C的温度及在或几乎中性pH中的水溶液中残留，则其是可溶的。在这 些条件下，可溶性蛋白质将通常具有低沉降值，例如，少于约10至50斯维德伯格单位。
[0144] 本文参考的水溶液典型地具有缓冲化合物以建立pH，典型地在约5至9的pH范围 内，以及在约2mM和500mM之间的阴离子性强度范围。有时添加蛋白酶抑制剂或温和非离 子性清洁剂。额外地，若有需要，可添加载体蛋白，诸如，少许mg/ml的牛血清白蛋白（BSA)。 例示性缓冲水溶液包含标准磷酸盐缓冲的生理盐水、Tris缓冲生理盐水或其它公知的缓冲 剂和细胞培养基调配物。
[0145] 医药治疗
[0146] 本发明包含有用于治疗肿瘤形成的IL-2融合蛋白。在一个特定具体实施例中，本 发明的IL-2融合蛋白有用于预防或减少肿瘤生长或用于减少肿瘤形成细胞入侵周边组织 或肿瘤转移的倾向。至于治疗用途，本文揭露的IL-2融合蛋白可全身性地给药，例如，在医 药上可接受的缓冲剂（诸如，生理条件的生理盐水）中的调配。优选的给药路径，包含，例 如，在患者中提供连续性、持续浓度的药物的皮下、静脉内、腹腔间地、肌内、或皮内注射。人 类患者或其它动物的治疗将使用治疗有效量的于生理上可接受的载体的本文辨识的治疗 剂进行。描述适合的载体和其调配物，例如，于Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin。治疗剂的量取决于给药方式、患者的年龄和体重以及肿瘤形成的临床症状而 改变给药。通常，虽然因为化合物增加的特异性，在某些情况下将需要较低量，但量将在彼 等用于与治疗与肿瘤形成有联结的其它疾病中使用的其它剂的范围中。
[0147] 治疗方法
[0148] 本发明的IL-2融合蛋白是有用于预防或改善肿瘤形成疾病。在一种治疗方式中， 对可能的或实际受到疾病影响的组织的位置给药或全身性地给药本文辨识或描述的剂。给 药的剂的剂量是取决于一些因素，包含各别患者的尺寸和健康。至于任何特定受试者，特定 剂量疗法应根据各别需求和个人给药或监督组成物给药的专业判断而随着时间调整。
[0149] 医药组成物的调配物
[0150] 用于治疗肿瘤形成的治疗剂的给药可为造成治疗剂与其它组分的组合有效于改 善、减少或稳定化肿瘤形成的浓度的任何适合手段。化合物可以任何适当的量和以任何适 合的载体物质包含，而且通常是以组成物的总重量的1至95重量％的量存在。组成物可适 合用于非经口的（例如，皮下地、静脉内地、肌内地、膀胱内地或腹膜内地）给药路径的剂 量形式提供。一种给药的有利的方法是静脉内输注。医药治疗剂可根据传统的医药实践 调配（参见，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.)，ed. A. R. Gennaroj Lippincott Williams&Wilkins, 2000and Encyclopedia of Pharmacology Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylanj 1988-1999, Marcel Dekker，New York) 〇
[0151] 可调配根据本发明的医药组成物，以在实质上刚给药时即释放IL-2融合蛋白或 在任何预测定的时间或给药之后的时期释放IL-2融合蛋白。已知后者类型的组成物通常 作为控制释放的调配物，其包含（i)在延长的时期在身体内创造实质上恒定浓度的药物的 调配物；（ii)预定的延迟时间后在体内创造实质上恒定浓度的药物延长的期间的调配物； (iii)藉由维持身体中的相对、恒定及有效浓度和同时与活性物质的血浆浓度中的波动联 结的非所欲的副作用（锯齿动力图案）的最小化，而于预定时期持续作用的调配物；（iv) 局部化作用的调配物，所述局部化作用是藉由，例如，相邻或接触胸腺的控制释放组成物的 空间布置；(V)允许方便用剂，致使例如每周或每两周一次给药剂量的调配物；以及（vi)藉 由使用载体或化学衍生物将治疗剂传递至特别的细胞类型（例如，肿瘤形成细胞）而形成 肿瘤的调配物。至于一些应用，控制释放调配物避免白天频繁用剂的需求，以持续治疗水平 的血浆浓度。
[0152] 可探求任何数目的策略，以获得其中释放的速率胜过有问题的化合物的代谢速率 的控制释放。在一个实施例中，控制释放是藉由适当选择多个调配物参数和成分，包含，例 如，多种类型的控制释放组成物和涂层而获得。因此，治疗剂是以适当的赋形剂调配成医药 组成物，其在给药时，以控制的方式释放治疗剂。实例包含单一单位或多单位的锭剂或囊剂 组成物、油性溶液、悬浮液、乳剂、微囊剂、微球体、分子络合物、奈米粒子、贴片剂以及脂质 体。
[0153] 非经口的组成物
[0154] 医药组成物可藉由非经口地注射、渗入或植入（皮下、静脉内、肌内、腹膜内、膀胱 内或类似者）的剂量形式、调配物或经由适合的传递装置或含有传统的、非毒性医药上可 接受的载体和佐剂植入物而给药。此组成物的调配和制备为彼等医药调配物领域中公知 者。调配物科发现于前述的 Remington:The Science and Practice of Pharmacy。
[0155] 非经口的用途的组成物可以单位剂量形式提供（例如，于单一剂量安瓿）或于含 有许多剂量且其中可添加适合的防腐剂的小玻璃瓶（参见以下）。组成物可以溶液、悬浮 液、乳剂、渗入装置或植入用传递装置的形式，或其可以为使用之前以水或另一种适合的载 体复原的干燥粉剂呈现。除了减少或改善肿瘤形成活性剂之外，组成物可包含适合的非经 口地可接受的载体及/或赋形剂。一种或多种活性治疗剂可并入用于控制释放的微球体、 微囊剂、奈米粒子、脂质体或类似者。再者，组成物可包含悬浮、溶解、安定、PH调节剂、张力 调节剂及/或分散剂。
[0156] 如上所述，根据本发明的医药组成物可为适合用于无菌注射的形式。为了制备此 组成物，将一种或多种适合的治疗剂溶解或悬浮于非经口地可接受的液体载体。可接受的 载体和溶剂中可采用水、藉由添加适当量的氢氯酸、氢氧化钠或适合的缓冲剂、1，3-丁二 醇、林格式溶液（Ringer' s solution)以及等张氯化钠溶液和右旋糖溶液而调整至适合的 pH的水。水性调配物亦可含有一种或多种防腐剂（例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸 乙酯或对羟基苯甲酸正丙酯）。在其中一种化合物仅是不太或稍可溶于水中的情况下，可添 加溶解增强或溶解剂，或溶剂可包含10至60%重量/重量的丙二醇或类似者。
[0157] 控制释放非经口的组成物
[0158] 控制释放非经口的组成物可为水性悬浮液、微球体、微囊剂、磁性微球体、油性溶 液、油性悬浮液或乳剂的形式。或者，抗体可并入生物兼容的载体、脂质体、奈米粒子、植入 物或渗入装置。
[0159] 用于制备微球体及/或微囊剂的材料为，例如，生物能降解的/生物可腐蚀的聚合 物，诸如聚泌乳素、聚-(氰基丙烯酸异丁酯）、聚（2-羟基乙基-L-谷氨酰胺）以及聚（乳 酸）。当调配控制释放的非经口的调配物时，可使用的生物兼容的载体为碳水化合物（例 如，葡聚糖）、蛋白质（例如，白蛋白）、脂蛋白或抗体。用于植入物的材料可为非生物能降 解的（例如，聚二甲基硅氧烷）或生物生物能降解的（例如，聚（己内酯）、聚（乳酸）、聚 (乙醇酸）或聚（原酸酯）或其组合）。
[0160] 用于口服使用的固体剂量形式
[0161] 用于口服使用的调配物包含含有一种与多种活性成份混合的非毒性医药上可接 受的赋形剂的锭剂。此调配物对熟练的技术人员而言是已知的。赋形剂可为，例如，惰性稀 释剂或填充剂（例如，蔗糖、山梨糖醇、糖、甘露糖醇、微晶纤维素、包含马铃薯淀粉的淀粉、 碳酸钙、氯化钠、乳糖、磷酸钙、硫酸钙或磷酸钠）；造粒和崩解剂（例如，包含微晶纤维素的 纤维素衍生物、包含马铃薯淀粉的淀粉、交联羧甲基纤维素钠、海藻酸盐或海藻酸）；结合 剂（例如，蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、金合欢属、海藻酸、海藻酸钠、明胶、淀粉、预糊化淀粉、 微晶纤维素、硅酸镁铝、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、聚 乙烯基吡咯烷酮或聚乙二醇）；以及润滑剂、助流剂以及抗粘着剂（例如，硬脂酸镁、硬脂酸 锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化蔬菜油或滑石）。其它医药上可接受的赋形剂可为着色剂、调味 剂、增塑剂、湿润剂、缓冲剂等。
[0162] 锭剂可为未经涂怖或牠们可藉由已知技术涂布，视需要地延迟胃肠道中的崩解和 吸收，藉此于较长期间提供持续的作用。涂层可经调整以释放预定图案中的活性药物（例 如，为了达成控制释放调配物），或其可经调整成直到穿过胃（肠涂层）之后才释放活性药 物。涂层可为糖涂层、膜涂层（例如，基于羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、甲基羟乙基纤维 素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、丙烯酸酯共聚物、聚乙二醇及/或聚乙烯基吡咯烷酮）或 肠涂层（例如，基于甲基丙烯酸共聚物、乙酸酞酸纤维素、酞酸羟丙基甲基纤维素、乙酸琥 珀酸羟丙基甲基纤维素、聚乙烯基乙酸酯酞酸酯、紫胶及/或乙基纤维素）。再者，可采用时 间延迟材料，诸如，例如，单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0163] 固体锭剂组成物可包含经调整以保护组成物免于不要的化学变化（例如，释放 嵌合抗体之前的化学分解）的涂层。涂层可以前述的Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中所述相似方式施用于固体剂量形式上。
[0164] 口服使用的调配物亦可以可咀嚼锭剂、或其中活性成份与惰性固体稀释剂（例 如，马铃薯淀粉、乳糖、微晶纤维素、碳酸钙、磷酸钙或高岭土）混合的硬明胶囊剂、或其中 活性成份与水或油性培养基，例如，花生油、液体石蜡或橄榄油混合的软明胶囊剂呈现。可 以使用，例如，混合器、液床式仪器或喷雾干燥设备的传统方式，在上述锭剂和囊剂下使用 成分以制备粉体和颗粒。
[0165] 控制释放口服剂量形式
[0166] 口服使用的控制释放组成物可为，例如，经构筑成藉由控制活性物质的溶解及/ 或扩散而释放嵌合抗体治疗剂。溶解或扩散控制释放可藉由化合物的锭剂、囊剂、丸剂以及 颗粒调配物的适当涂层，或将化合物并入适当的基质而达成。控制释放涂层可包含上述一 种或多种涂层物质及/或，例如，紫胶、蜂蜡、糖蜡、蓖麻蜡、棕榈蜡、硬脂醇、单硬脂酸甘油 酯、二硬脂酸甘油酯、硬脂酸棕榈酸甘油酯、乙基纤维素、丙烯酸树脂、dl-聚乳酸、乙酸丁酸 纤维素、氯化聚乙烯、乙酸聚乙烯酯、乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯、聚丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸 甲酯、丙烯酸2-羟基甲酯、甲基丙烯酸酯水凝胶、1，3 丁二醇、乙二醇甲基丙烯酸酯、及/或 聚乙二醇。在控制释放基质调配物中，基质材料亦可包含，例如，水合甲基纤维素、棕榈蜡以 及硬脂醇、卡波姆（carb〇p〇l)934、聚硅氧烷、三硬脂酸甘油酯、丙烯酸甲酯-甲基丙烯酸甲 酯、聚乙烯基氯化物、聚乙烯及/或卤代氟碳。
[0167] 含有一种或多种治疗化合物的控制释放组成物亦可为易浮的锭剂或囊剂的形式 (亦即，口服给药时在胃内容物的顶部浮动特定时期的锭剂或囊剂）。一种或多种化合物的 易浮的锭剂调配物可藉由将一种或多种化合物与赋形剂和20至75%重量/重量的水胶体 (诸如，羟乙基纤维素、羟丙基纤维素或羟丙基甲基纤维素）的混合物造粒而制备。接着，可 将所获得颗粒体可压缩成锭剂。与接触胃液时，锭剂在其表面周围形成实质上不透水的凝 胶屏障。这凝胶屏障参予维持密度少于一，藉此允许锭剂在胃液中保持浮的。
[0168] 组合疗法
[0169] 本发明提供IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的组合给药。IL-2融合蛋白可在 给药治疗剂之前、同时或之后给药。此外，若超过使用一种治疗剂，则这些剂可同时或分别 给药。另外，IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的给药可以多个剂量方案给药。在特定具 体实施例中，IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂可藉由一种或多种以休息期隔开的多种用 剂方案给药。
[0170] 取决于患者的疾病阶段，新佐剂设定中的本发明的IL-2融合蛋白和一种或多种 治疗剂的组合是在额外的疗法或手术之前，或作为第一线、第二线或后线疗法。于优选的具 体实施例中，组合疗法对囊肿切除术之前的膀胱癌受试者有特异性。此疗法可根除微肿瘤 转移，降期肿瘤，减少循环肿瘤细胞手术后的植入以及增进存活。在其它具体实施例中，本 发明的组合疗法是对晚期或转移性膀胱癌受试者有特异性的第一线或第二线疗法。此治疗 可提供有抗性或不适合标准疗法的受试者。IL-2融合蛋白作为单一疗法的用途亦可有效地 用于这些治疗设定。
[0171] 本发明的IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的组合可较以各别剂的治疗有利地 提供更有效的疗法。在某些优选的具体实施例中，组合疗法包括ALT-801作为IL-2融合蛋 白，和顺铂及/或吉西他滨作为治疗剂。额外地，本发明的具体实施例包含膀胱（或尿道 上皮）癌症受试者的治疗，其中所述癌症可为转移性细胞癌瘤、癌瘤（或肿瘤）原位、非肌 肉-侵入性、肌肉-侵入性、局部晚期、肿瘤转移、第I至IV期或低或高恶性。
[0172] 于优选具体实施例中，IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的组合给药较以治疗剂 的单独治疗更有效地治疗或预防受试者的癌症。使用IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂 的组合治疗成效可在预期或回推的基准上以与治疗剂的单独治疗比较，使用相似研宄组或 交叉研宄的历史功效手段。可良好建立用于癌症治疗的功效测量，而且其可包含整体肿瘤 反应（亦即，基于RECIST、WHO或其它标准的恶化疾病的速率、安定的疾病、部分反应或完整 反应的速率）、无恶化存活、恶化的时间、整体存活或存活率、风险比、复发率或时间、肿瘤生 物标志分析、生活质量测量、额外的治疗的速率或时间等。使用IL-2融合蛋白和一种或多 种治疗剂的组合治疗的相较于治疗剂的单独治疗的较佳的功效是典型地定义为统计学上 地显著的功效手段的改善（亦即，P值〈0. 10或优选为〈0. 05)，或可为定义为周、月或年测 量的事件的时间增加 1%、5%、10%、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、 100 %、200 %、300 %、400 %、500 %、750 %、1000 %、1250 %、1500 %、1750 %、2000 % 或更高 的改善速率测量。在非限制性实例中，使用本发明的ALT-801和吉西他滨+顺铂组合给药 治疗晚期或转移性膀胱癌受试者提供较先前报导的以吉西他滨+顺铂或其它以顺铂为主 的化学疗法疗方治疗的晚期/转移性膀胱癌受试者为更佳的抗肿瘤功效。具体地，von der Maase等人（J. Clin. Oncol. (2000) 17:3068)报导在晚期或转移性膀胱癌患者的第III期临 床研宄中，以独立辐射学复查，以吉西他滨+顺铂的治疗造成49. 4% (182位评估患者中有 81位）的整体肿瘤反应速率（亦即，部分反应和完整反应的速率）和12.2%的完整反应速 率。这研宄亦报导以甲氨蝶呤、长春花碱、多柔比星以及顺铂治疗的患者中有相似的整体反 应速率（45. 7%，181位评估患者中有69位）和完整反应速率（11. 9% )。其它化学疗法疗 方（亦即，单剂、双重峰、三重峰）的后续研宄中，这报导的患者群体有类似或低劣的反应速 率（Yafi等人的评论Curr. Oncol. (2011) 18: e25)。令人惊讶地，对晚期/转移性膀胱（尿 道上皮）癌症患者组合给药本发明的ALT-801和吉西他滨+顺钼，提供了较von der Maase 等人或其它人报导的吉西他滨+顺铂或其它以顺铂为主的化学疗法疗方更佳的整体反应 和完整反应速率。
[0173] 额外地，IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的组合给药对治疗或预防对化学疗法 有抗性的受试者的癌症有效。在特定具体实施例中，本发明的组合治疗包含让癌症有抗性 的一种或多种治疗剂。在其它具体实施例中，本发明的组合治疗包含不同于让癌症有抗性 的一种或多种治疗剂。在非限制性实例中，ALT-801和吉西他滨+顺铂的组合给药对于在 先前吉西他滨+顺钼疗法中恶化的膀I光癌患者提供完整反应（CR)是有效的。在370位以 顺铂为主的疗法后恶化的晚期尿道上皮细胞癌患者的第III期研宄中无 CR被报导的事实 下，这结果是高度未预料到的（Bellmunt等人J. Clin. Oncol. (2009)27:4454)。
[0174] 本发明的IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的组合可通过各式各样的机转提供 更有效的疗法。IL-2融合蛋白和细胞毒性治疗剂疗方可通过这些剂的组合对癌症的直接 效果而提供功效。在一些情况中，这些效果的时序可提供改善的结果。例如，针对巨瘤症的 细胞毒性治疗剂的快速活性与针对残余疾病的IL-2融合蛋白的耐久性长期活性的组合可 提供较单独剂更佳的功效。或者，治疗剂不仅对肿瘤细胞有直接细胞毒性效果，但亦可经 由所谓偏离目标效果（off-target effect)增效免疫系统，以与本发明IL-2融合蛋白的 组合达到有效率的抗癌症免疫力（Galluzzi，L.等人，Nat Rev药物Discov, 11:215-233)。 例如，以治疗剂的治疗可增加癌症细胞表面上的抗原目标的表达，藉此允许IL-2融合蛋白 诱发更有效的抗肿瘤免疫反应。于一些具体实施例中，藉由IL-2融合蛋白的组分和免疫 反应识别的抗原目标是IL-2融合蛋白交互作用导向针对肿瘤细胞。在一个实例中，治疗 剂增加肿瘤细胞表面上的HLA或HLA/胜肽络合物浓度，并且增强TCR-IL2融合蛋白的识 另IJ。在其它具体实例中，以铂为主的化合物（包含顺铂、草酸铂以及卡铂）不仅诱发第I 类HLA表达，也明显地减少人类肿瘤细胞上T细胞抑制分子TO-L2的表达（Lesterhuis，W. J.等人，J Clin Invest, 121:3100-3108)。PD-L2的向下调节可造成IL-2融合蛋白刺激 的T细胞的增强的抗肿瘤的效果。多种治疗剂（包含顺铂、他克唑以及多柔比星）具有藉 由增加肿瘤细胞对颗粒酶的渗透率，而将肿瘤细胞敏化成细胞毒性T淋巴球（CTL)的能力， 藉此使得牠们易受CTL介导的溶胞，甚至若牠们不表达识别的CTL抗原（Ramakrishnan，R. 等人，J Clin Invest, 120:1111-1124)。在本发明的其它具体实施例中，由于吉西他滨 的活性增加肿瘤细胞上第I类HLA的表达和增强对IL-2融合蛋白活化的CD8+T细胞交 叉呈现肿瘤抗原，IL-2融合蛋白与吉西他滨的组合可造成更有效的疗法（Liu, W.M.等 人，Br J Cancer，102:115_123;Nowak，A.K·等人，J Immunoll，170:4905_4913,2003;and Nowak, Α· Κ·等人，Cancer Res, 63:4490-4496, 2003)。在本发明中的组合疗法中，吉西他 滨的使用亦可选择性地杀死负责抑制抗原特异性的T-细胞反应的衍生自骨髓的抑制细胞 (MDSC) (Mundy_Bosse，B.L·等人，Cancer Res，71:5101_5110;Vincent，J·等人，Cancer Res, 70:3052-3061 ;Suzuki，E.等人，Clin Cancer Res, 11:6713-6721，2005 ;and Κο，Η· J.等人，Cancer Res，67:7477-7486, 2007)，藉此提供IL-2融合蛋白介导的抗肿瘤免疫活 性的较佳环境。化学疗法亦可诱发肿瘤自我吞噬，导致腺苷5'-三磷酸酯的释放，能吸引和 刺激抗肿瘤免疫反应（Michaud, M.等人，Science, 334:1573-1577)。整体上，本发明的组合 治疗的抗肿瘤作用机转可不仰赖于治疗剂的直接细胞毒性活性。因此，组合治疗可对于其 肿瘤对治疗剂组分有抗性的受试者是有效的。
[0175] 套组
[0176] 本发明提供用于治疗或预防肿瘤形成的套组。在一个具体实施例中，套组包含含 有治疗有效量的单位剂量形式的IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的治疗或预防组成 物。于优选具体实施例中，IL-2融合蛋白为ALT-801，而且一种或多种治疗剂为顺铂及/或 吉西他滨。于一些具体实施例中，套组包括含有治疗或预防细胞组成物的无菌容器；此容 器可为盒、安瓿、瓶、小玻璃瓶、管、袋、囊、泡罩包装或其它【技术领域】中已知的适合的容器形 式。此容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或适合用于保持药剂的其它材料所制。
[0177] 若有需要，本发明的IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂与用于对具有癌症或有 发展癌症的风险（例如，膀胱癌）的受试者给药IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂的指令 一起提供。指令将通常包含关于将组成物用于治疗或预防肿瘤形成的信息。在其它具体实 施例中，指令包含以下至少一者：治疗剂的描述；用于治疗或预防其局部缺血或症状的剂 量方案和给药；预防措施；警告；适应症；禁忌症；过量信息；不良反应；动物药理学；临床 研宄；及/或参考文献。指令可打印直接到容器上（当存在时）或为作为标签而施用于容 器的，或作为个别片、小册子、卡片或夹子而存在容器中或与容器一起供应。
[0178] 重组多肽表达
[0179] 除非另行说明，本发明的实践采用分子生物学（包含重组技术）、微生物学、 细胞生物学、生物化学以及免疫学，其是在熟练的技术人员的良好理解范围内的传统 的技术。此技术在文献，诸如，"Molecular Cloning:A Laboratory Manual"，第二 版（Sambrook，1989) ;"01igonucleotide Synthesis"（Gait, 1984) ;"Animal Cell Culture"(Freshney, 1987) ;''Methods in Enzymology"(31) "Handbook of Experimental Immunology"（Weir, 1996) ；aGene Transfer Vectors for Mammalian Cells"（Miller and Calos,1987) ;"Current Protocols in Molecular Biology" （Ausubel,1987); "PCR:The Polymerase Chain Reaction"，（Mullis, 1994) ;"Current Protocols in Immunology"(Coligan,1991)中完全解释。这些技术可应用于本发明的多核苷酸和多肽的 产生，诸如，可在本发明的制造和实践中考虑。用于特定具体实施例的特别有用的技术将在 以下段落讨论。
[0180] 提出以下实施例，以便提供彼等【技术领域】中具有通常知识者和如何制造和使用测 定法、筛选以及本发明的治疗方法的完整揭示内容和描述，而非意欲限制发明人视为他们 发明的范畴。
[0181] 实施例
[0182] 实施例I:静脉内给药新颖IL-2融合蛋白ALT-801抑制小鼠模式中的膀胱癌。
[0183] ALT-801是白介素-2和能识别呈现人类p53胜肽（氨基酸264-272)/HLA-A*0201 络合物的肿瘤的T细胞受体（TCR)结构域之间的融合蛋白。当时与PBS治疗比较时，静脉 内给药ALT-801显著地延长带有MB491UC原位肌肉侵入性和浅表性膀胱癌的C57BL/6小鼠 的存活。以ALT-801治疗的小鼠亦存活以MB491UC肿瘤细胞的再激发（rechallenge)，表 示长效免疫反应和长期记忆。额外地，裸鼠中，ALT-801展现针对人类膀胱癌HLA-A*0201 +/ P53+UMUC-14和HLA-A*0201-阴性/p53+KU7异体移植的强效抗肿瘤活性，证实ALT-801的 TCR结构域目标活性对于功效是不需要的。UMUC-14和KU7异体移植模式中，ALT-801与吉 西他滨的组合显示较吉西他滨+顺铂（GC)化学疗法更佳的抗肿瘤效果和更低毒性，尽管这 些肿瘤细胞对GC有不同敏感性。
[0184] 实施例2 :ALT-801与吉西他滨和顺铂的组合对裸鼠中人类膀胱癌UMUC-14的原发 肿瘤生长的效果。
[0185] 单独c264scTCR-IL2 (ALT-801)和其与吉西他滨和顺铂的组合的多发性剂量给药 的抗肿瘤功效是在带有人类膀胱UMUC-14和KU7P细胞的无胸腺裸鼠中的原发肿瘤评估。用 吉西他滨和顺铂疗方的治疗是转移性膀胱癌患者的照护标准。为了评估这些化学治疗剂对 人类膀胱癌细胞的体外效果，以单独吉西他滨和顺铂和其组合治疗HLA-A2 +p53+UMUC-14细 胞。24小时培育之后，由于G0/G1细胞周期遏止，吉西他滨、顺铂以及吉西他滨+顺铂造成 UMUC-14细胞增殖的剂量依赖性减少。此等结果与此等药剂在细胞生长的作用机转一致。 与吉西他滨+顺铂的组合在体外培育亦诱发在UMUC-14肿瘤细胞表面上呈现p53胜肽（氨 基酸264至272)/HLA-A*0201络合物，表示藉由这治疗提升ALT-801的抗原目标。
[0186] 使用细胞增殖测定法进一步评估人类膀胱肿瘤细胞系对吉西他滨和顺铂的敏感 性。将UMUC-14和KU7P细胞平铺于含有多种量的吉西他滨和顺铂的培养基，并且在24小 时后使用WST-I试剂测定细胞增殖。经发现吉西他滨以2030 μΜ的IC5tl抑制UMUC-14细胞 生长，而以0. 05μΜ的IC5tl抑制KU7P细胞生长。顺铂亦显示对KU7P细胞（IC5(l，1.4yM)有 较UMUC-14细胞（IC 5(I，9.2 μ M)更大的抑制。整体上，这些结果说明UMUC-14细胞生长对化 学治疗剂相对有抗性，KU7P细胞生长则对化学治疗剂敏感。
[0187] 接着，评估吉西他滨、顺铂以及ALT-801治疗在带有皮下UMUC-14人类膀胱肿 瘤的裸鼠中的抗肿瘤效果。在这研宄中，四组带有UMUC-14肿瘤的小鼠（5只小鼠/群 组）进行研宄药物治疗的两个周期，各周期持续3周。至于ALT-801与吉西他滨及顺 铂（Gem+Cis+ALT-801)的组合，顺铂（Cis) (3mg/kg)是在研宄第1天（SDl)和SD22静 脉内给药，吉西他滨（Gem) (40mg/kg)是在SD1、SD8、SD22以及SD29静脉内给药，以及 ALT-801 (I. 6mg/kg)是在 SD3、SD5、SD8、SD10、SD24、SD26、SD29 以及 SD31 (图 1)静脉内 给药。其它研宄实验组包含ALT-801单一疗法、Gem+Cis组合疗法或PBS依适当的预定表 给予。与以PBS治疗的小鼠中所观察到者比较，三种测试的治疗疗方（Gem+Cis+ALT-801 ; ALT-801 ;Gem+Cis)各造成统计学上显著地减少皮下UMUC-14人类膀胱肿瘤的生长（图1)。 三个实验组之间，Gem+Cis+ALT-801显示最佳功效，其中肿瘤生长抑制（TGI)(相对于以PBS 治疗的小鼠中的肿瘤）为 87%，接着 ALT-801 (77% TGI)和 Gem+Cis (52% TGI)。以 Gem+Cis 治疗看见的肿瘤体积的减少仅在治疗的第二周期的期间观察到，而且可已部分归因于大肿 瘤的断裂或坏死，而不是导向抗肿瘤活性。ALT-801与吉西他滨和顺铂治疗的组合无显著地 减少小鼠体重，而且无观察到死亡率或毒性的治疗后征兆，暗示治疗疗方是安全的。
[0188] 实施例3:ALT-801或MART-lscTCR/IL-2融合蛋白与吉西他滨的组合对裸鼠中 UMUC-14人类膀胱癌的原发肿瘤生长的效果。
[0189] 进行这作为追踪的研宄评估ALT-801 (c264scTCR-IL2)加上吉西他滨和非目标性 的cTCR/IL-2融合蛋白（MART-lscTCR/IL-2)加上吉西他滨的多发性剂量给药对带有人 类膀胱UMUC-14细胞的无胸腺裸鼠的原发肿瘤生长的抗肿瘤功效。ALT-801 (c264scTCR/ IL-2)识别展示p53 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201络合物的肿瘤细胞，而且已证 实抑制无胸腺裸鼠中的HLA-A*0201+/p53 +皮下肿瘤的生长（Belmont,等人2006Clin Immunoll. 121:29, Wen,等人 2008Cancer Tmmunol Immuother. 57:1781)。MART-lscTCR/ IL-2为一种不同的scTCR/IL-2融合蛋白，识别以HLA-A*0201的形式呈现的MART-I (氨 基酸27至35)胜肽，但非p53(氨基酸264至272)/HLA-A*0201。这蛋白质已在与 HLA-A*0201+/p53+皮下肿瘤的研宄中作为非目标性的控制试剂。ALT-801和MART-lscTCR/ IL-2展现相当的结合细胞表面IL-2受体和刺激NK细胞反应的能力。然而，针对小鼠模式 中的皮下HLA-A*0201 +/p53+A375人类黑色素瘤肿瘤，ALT-801展现较MART-1 scTCR/IL-2更 佳的抗肿瘤活性（Wen,等人2008Cancer Immunol Immunother. 57:1781)。此效果可能是由 于ALT-801蛋白质的肿瘤特异性识别。
[0190] 评估ALT-801和MART-lscTCR/IL-2与吉西他滨的组合的功效，以测定肿瘤对 scTCR/IL-2融合蛋白的抗肿瘤活性的贡献，接收吉西他滨加上顺铂的带有肿瘤的小鼠作为 这研宄的对照组。
[0191] 带有皮下UMUC-14肿瘤（平均体积为80mm3)的无胸腺裸鼠（4只动物/群组）是 以吉西他滨（40mg/kg) (Gem)加上顺钼（3mg/kg) (Cis)、ALT-801 (I. 6mg/kg)加上Gem(40mg/ kg)或 MART-lscTCR/IL-2(2.4mg/kg，ALT-801 的剂量相当活性）加上 Gem(40mg/kg)静脉 内治疗（i.v.)，给两次治疗周期。第一治疗周期是由在第一周期中的研宄第1天（SDl)的 Cis注射，SD 1和SD 8的两次Gem注射，以及SD 3、SD 5、SD 8以及SD 10的ALT-801或 MART-lscTCR/IL-2的四次注射所组成。11天休息期（SD 15至SD 21)之后，使用与第一周 期中的相同疗方进行此研宄的第二治疗周期，接着进行6天追踪期（SD42至SD47)。
[0192] 相较于以Gem+Cis治疗的小鼠中所观察到者，使用ALT-801+Gem或MART-lscTCR/ IL-2+Gem的治疗造成皮下UMUC-14人类膀胱肿瘤的生长的统计学上显著的减少（图2)。 整体上，无发现ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem治疗之间的抗肿瘤活性有显著的差 异，虽然ALT-801+Gem显示疗程期间有较佳抗肿瘤功效的趋势。这些结果确认先前结果证 实这模式中的ALT-801治疗疗方的强效抗肿瘤活性。额外地，从非目标性的MART-lscTCR/ IL-2融合蛋白所观察到的功效说明了 UMUC-14人类膀胱异体移植亦对以IL-2为主的疗法 高度敏感。因此，这数据证实ALT-801的c264scTCR组分的目标活性对于其针对UMUC-14 膀胱肿瘤细胞的强效功效是必要的。与实施例2 -起，结果清楚说明IL-2融合蛋白与化学 疗法（吉西他滨+顺铂或吉西他滨）的组合造成针对人类膀胱肿瘤的有效治疗，包含对化 学治疗剂有抗性的肿瘤细胞。
[0193] 治疗疗方的期间无观察到死亡或毒性的治疗后征兆。在疗程期间的数个时间点， 相较于以Gem+C治疗的动物，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem实验组中观察到显著 的体重流失。然而，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem实验组两者的小鼠体重平均值 在11天休息期和一周追踪期的期间快速复原。这些发现证实此模式中充分忍受有短暂毒 性的 ALT-801+Gem 和 MART-lscTCR/IL-2+Gem 治疗疗方。
[0194] 实施例4 :ALT-801或MART-lscTCR/IL-2融合蛋白与吉西他滨的组合对裸鼠中的 UMUC-14和KU7人类膀胱癌的原发肿瘤生长的效果。
[0195] 进行这些研宄以评估ALT-801 (c264scTCR/IL-2)与吉西他滨的组合或吉西他滨 和顺铂及非目标性的scTCR/IL-2融合蛋白（MART-lscTCR/IL-2)与吉西他滨的组合对带有 人类膀胱UMUC-14或KU7P细胞的无胸腺裸鼠中的原发肿瘤生长的多发性剂量给药的抗肿 瘤功效。带有肿瘤的小鼠接收PBS或Gem加上Cis作为这研宄的对照组。Gem和Cis为转 移性膀胱癌患者的照护标准化学疗法。
[0196] 带有皮下UMUC-14肿瘤（平均体积为84mm3)的无胸腺裸鼠（5只动物/群组）是以 卩85、66111(4〇11^/1^)加上（^8(311^/1^)、嫩1?1'-18(31'0?/11^-2(2.1911^/1^41^-801的剂量相当 活性）加上 Gem(40mg/kg)、ALT_801 (I. 6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)或 ALT-801 (I. 6mg/kg) 加上Gem(40mg/kg)和Cis(3mg/kg)治疗，给两次周期的治疗。第一治疗周期是由第一周期 的研宄第9天（SD9)的Cis注射，SD 9和SD16的两次Gem注射，以及SD 11、SD 13、SD 16 以及SD 18的ALT-801或MART-1 scTCR/IL-2的四次注射。11天休息期（SD 19至SD 30) 之后，使用与第一周期中相同的疗法进行这研宄的治疗的第二周期，接着进行10天休息期 (SD40 至 SD49)。
[0197] 相较于以PBS治疗的小鼠中所观察到者，使用MART-lscTCR/IL-2+Gem、 ALT-801+Gem或ALT-801+Gem+Cis的治疗造成皮下UMUC-14人类膀胱肿瘤的生长有统计学 上显著的减少（图3)。观察到统计学上显著减少的生长，即使肿瘤的一些表面破裂明显地 影响PBS (从SD38开始）和Gem+Cis (从SD29开始）组中的肿瘤体积测量的精确度。实验 组 MART-lscTCR/IL-2+Gem、ALT-801+Gem 以及 ALT-801+Gem+Cis 之间没发现抗肿瘤活性有 显著差异，虽然ALT-801+Gem+Cis显示目前研宄的疗程期间有较佳抗肿瘤功效的趋势。这 些结果证实于先前结果所显现的此动物模式中的ALT-801治疗疗方的强效抗肿瘤活性。额 外地，所观察到的非目标性的MART-lscTCR/IL-2融合蛋白功效说明UMUC-14人类膀胱异体 移植亦对以IL-2为主的疗法高度敏感。因此，这数据进一步证实ALT-801的264scTCR组 分的目标活性对其针对UMUC-14膀胱肿瘤细胞的强效功效是不需要的。
[0198] 治疗疗方期间无观察到死亡。然而，在疗程期间的数个时间点，相较于未以Cis 治疗的动物，Gem+Cis和ALT-801+Gem+Cis实验组中无观察到显著的体重流失（图4)。 藉由使用Cis和从体重流失缓慢恢复表示这模式中的Cis的更高毒性，无发现抗肿瘤活 性的显著差异。这些结果显示在此治疗中Cis不提供治疗益助。当与PBS群组比较时， ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem实验组两者中亦发现体重流失，然而，ALT-801+Gem 和MART-lscTCR/IL-2+Gem实验组两者中的小鼠体重平均值在11天休息期和13天追踪期 的期间快速复原。这些发现证实这模式中充分忍受ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem 治疗疗方的短暂毒性。
[0199] 随着后续追踪，使用不同的人类膀胱肿瘤细胞系KU7P以进一步评估ALT-801和 MART-lscTCR/IL-2与Gem或Gem+Cis的组合的功效。细胞系是HLA-A*0201阴性和过度 表达P53的细胞系，而且不展示ALT-801或MART-lscTCR/IL-2分子识别的抗原。因此， 这模式的结果可提供进一步scTCR/IL-2融合物与Gem的组合的"非目标性"的抗肿瘤活 性的证据针对裸鼠中的原发人类膀胱肿瘤异体移植是有效的。接收PBS或Gem+Cis的带 有肿瘤的小鼠作为这研宄的对照组。带有皮下KU7P肿瘤（除了 PBS群组[约70mm3]之 夕卜，平均体积为81mm3)的无胸腺裸鼠（5只动物/群组）是以PBS、Gem(40mg/kg)加上 Cis(3mg/kg)、MART-lscTCR/IL-2(2. 19mg/kg，ALT-801 的剂量相当活性）加上 Gem(40mg/ kg)、ALT_801(1.6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)或 ALT_801(1.6mg/kg)加上 Gem(40mg/kg)和 Cis(3mg/kg)治疗，给两次治疗周期。第一治疗周期是由第一周期中的研宄的第7天（SD 7)的Cis注射所组成的，SD 7和SD 14的两次Gem注射，以及SD 9、SD 11、SD 14以及SD 16的ALT-801或MART-lscTCR/IL-2的四次注射所组成。11天休息期（SD 17至SD 27)之 后，使用与第一周期中相同的疗方进行这研宄的第二治疗周期，接着进行6天追踪期（SD37 至 SD45)。
[0200] 相较于以PBS治疗的小鼠中所观察到者，使用Gem+Cis、MART-lscTCR/IL-2+Gem、 ALT-801+Gem或ALT-801+Gem+Ci s的治疗造成皮下KU7P人类膀胱肿瘤的生长的统计 学上显著的减少（图5)。整体上，虽然ALT-801+Gem+Cis显示较佳的抗肿瘤功效的趋 势走向，疗程期间无发现实验组Gem+Cis、MART-IscTCR/IL-2+Gem、ALT-801+Gem以及 ALT-801+Gem+Cis之间的抗肿瘤活性有统计学上显著的差异（亦即，相较于Gem+Cis)。这 些结果与以上参考的研宄结果一致，所述研宄结果证实于UMUC-14膀胱肿瘤异体移植模式 中ALT-801和MART-lscTCR/IL-2治疗疗方的强效抗肿瘤活性。额外地，观察到的ALT-801 和MART-lscTCR/IL-2与Gem的组合对裸鼠中的HLA-A*0201-阴性/过度表达p53的KU7P 的人类膀胱肿瘤的非目标性的功效说明KU7P人类膀胱异体移植对以Gem+IL-2为主的疗法 高度敏感。因此，这数据进一步证实ALT-801的264scTCR组分的目标活性对于与Gem的组 合对于针对KU7P膀胱肿瘤细胞的强效功效是不需要的。这研宄的结果亦说明Gem+Cis疗 方对于抑制KU7P膀胱肿瘤的生长较UMUC-14膀胱肿瘤模式中更有效，而且ALT-801针对这 些膀胱癌细胞是有效的，但不论其对Gem+Cis疗方的敏感性。这些结果与上述KU7P细胞 的体外敏感性和UMUC-14细胞对吉西他滨和顺铂的抗性一致。发现单独以IL-2融合蛋白 ALT-801或MART-1 scTCR/IL-2或其与Gem+Cis的组合治疗针对化学疗法敏感和有抗性膀胱 肿瘤两者是有效。
[0201] 治疗疗方期间无观察到死亡。然而，与以上参考的研宄一致，相较于无以Cis治 疗的动物，Gem+Cis和ALT-801+Gem+Cis实验组中观察到显著的体重流失（图6)。以上说 明，KU7P膀胱肿瘤对Cis敏感，并且在当给药ALT-801+Gem的组合时展现稍微较佳的抗肿 瘤活性。然而，从Cis实验组中流失的体重的缓慢恢复表示Cis的较高毒性，因此，这模式 中有不理想的治疗指数。当与PBS组比较时，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem实验 组两者中亦发现体重流失，尤其是在第2治疗周期中，然而，ALT-801+Gem和MART-lscTCR/ IL-2+Gem实验组两者的小鼠体重平均值在11天休息期和8天追踪期的期间快速复原。这 些发现暗示这模式中充分忍受ALT-801+Gem和MART-lscTCR/IL-2+Gem治疗疗方的短暂毒 性。
[0202] 皮下KU7P膀胱肿瘤异体移植模式中进行相似研宄，以使用上述相同治疗方案 检验以 Gem(40mg/kg)、MART-lscTCR/IL-2(2. 19mg/kg，ALT-801 的剂量相当活性）或 ALT-801 (I. 6mg/kg)的单一疗法的抗肿瘤的效果。如图7中显示，相较于以PBS治疗的小 鼠中所观察到者，以Gem、MART-lscTCR/IL-2或ALT-801治疗造成皮下KU7P人类膀胱肿瘤 生长的统计学上显著减少。这效果显示较低的耐久性，相较于从Gem+MART-lscTCR/IL-2及 Gem+ALT-801组合中所观察到的其中连续治疗后看见少或无的肿瘤再生长（图3和5)。因 此，IL-2融合蛋白和化学疗法（在这情况下是吉西他滨）的组合治疗显示提供针对人类膀 胱肿瘤的最有效抗肿瘤活性。
[0203] 实施例5:ALT-801对带有MB491uc原位肌肉侵入性膀胱肿瘤的C57BL/6和白子 C57BL/6小鼠的存活的效果。ALT-801的TCR结构域的目标活性对于抗肿瘤活性是不需要 的。
[0204] 评估ALT-801 (c264scTCR-IL2)的多重剂量给药对带有同源MB491uc原位肌肉侵 入性膀胱肿瘤的免疫活性C57BL/6和白子C57BL/6小鼠的存活的效果。因为这些肿瘤缺 乏ALT-801所辨识的p53 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201络合物，这研宄是设计成评估 ALT-801针对膀胱癌的"非目标性"的抗肿瘤活性。
[0205] 使用免疫活性白子C57BL/6小鼠中的相关和可繁殖的小鼠膀胱癌模式（鼠胱癌细 胞系MB491uc)以评估ALT-801的功效。MB491uc细胞系表达萤光素酶，允许其使用生物发 光测定法侦测。在研宄第0天，膀胱的胰蛋白酶-EDTA预处理后，对白子C57BL/6小鼠（17 周龄）的膀胱内滴注入MB491uc(lx IO6个细胞/膀胱）。MB491UC肿瘤细胞滴注后第9、 16、23以及30天，静脉内给药？85(11 = 5)或41^-801(1.611^/1^，11 = 4)。维持小鼠以评估 肿瘤滴注之后实验组之间的存活率作为功效端点。相较于PBS，ALT-801显著地延长带有 MB491UC的小鼠的存活率（P = 0. 0171)(图8)。ALT-801实验组中存活的动物于最初滴注 之后第84天以膀胱内滴注MB491UC细胞（lx IO6个细胞每小鼠）而再激发。额外地，将首 次接受试验的C57BL/6对照小鼠于同日滴注肿瘤细胞，以作为对照组。于以MB491UC细胞 再激发之后第16天，进行以萤光素酶为主的成像侦测MB491UC细胞。先前以ALT-801治疗 的群组的肿瘤细胞再激发的小鼠无显示生物发光肿瘤信号，而首次滴注MB491UC的小鼠显 示肿瘤细胞信号的证据，证实先前以ALT-801治疗的群组的小鼠对MB491uc肿瘤细胞的再 植入有抗性。卡普兰-迈耶存活曲线显示先前以ALT-801治疗的群组再激发的小鼠的存活 较首次滴注MB491uc的小鼠为显著更长（P = 0. 0246)。
[0206] 同样地，于另一种实验中，膀胱的聚赖氨酸预处理之后，在研宄第0天，对C57BL/6 小鼠（9至10周龄）的膀胱内滴注MB491uc (0. 075x IO6个细胞/膀胱）。在MB491uc肿瘤 细胞滴注之后第7、14、21以及28天，静脉内给药PBS(n = 6)或ALT-801(1.6mg/kg，η = 6)。维持小鼠，以评估实验组之间的存活率作为功效端点。相较于以PBS，ALT-801显著地延 长带有MB491UC的小鼠的存活率（P = 0. 007)(图9A)。最初滴注之后第62天，对ALT-801 治疗的存活者以膀胱内滴注MB491uc细胞（每只小鼠0.075x IO6个细胞）而再激发。额外 地，将首次接受试验的C57BL/6对照的小鼠 （η = 2)于同日滴注肿瘤细胞以作为对照。接 着，于以MB491UC细胞再激发之后第16天进行成像。先前以ALT-801治疗的群组的肿瘤细 胞再激发的小鼠无显示生物发光肿瘤信号，而首次滴注MB491UC的小鼠显示肿瘤细胞信号 的证据，暗示先前以ALT-801治疗的小鼠对MB491uc肿瘤细胞的再植入有抗性（图9B)。比 起首次接受试验的小鼠，先前以ALT-801治疗的小鼠在再激发之后存活更长，虽然使用卡 普兰-迈耶分析显示两个群组之间的存活时间无统计学上的显著性（P = 0. 0896)，但可能 是由于每群组中使用小数目的小鼠。
[0207] 在额外的研宄中，进一步评估免疫活性C57BL/6小鼠中的原位MB491UC肌肉侵入 性膀胱癌模式中的ALT-801静脉内给药的功效。膀胱的聚赖氨酸预处理之后，在研宄第O 天，将MB491uc(100yL中为0.075x IO6个细胞/膀胱）膀胱内滴注入C57BL/6小鼠（10至 11周龄）的膀胱。在18491此肿瘤细胞滴注后第7、14、21以及28天，将？85(11=10)或 ALT-801 (I. 6mg/kg，η = 10)静脉内给药。维持小鼠，以评估肿瘤滴注之后实验组之间的存 活率作为功效端点。相较于PBS，ALT-801显著地延长带有MB491UC的小鼠的存活率（Ρ = 0. 0201)(图10)。与这模式的先前研宄一致，观察到的针对原位MB491UC肌肉侵入性膀胱 肿瘤的ALT-801抗肿瘤效果与ALT-801融合蛋白的抗原目标活性无关。
[0208] 总而言之，这些结果证实ALT-801静脉内治疗对于延长带有同源性MB491uc原位 肌肉侵入性膀胱肿瘤的免疫活性小鼠的存活时间是有效的。ALT-801治疗亦提供针对彼等 先前暴露的肿瘤的耐久性免疫记忆反应。这些效果与ALT-801融合蛋白的目标活性无关。
[0209] 实施例6 :ALT-801的静脉内给药延长带有MB491uc的C57BL/6原位浅表性膀胱肿 瘤的小鼠的存活。
[0210] 进行这研宄以评估当以多重剂量疗方经由静脉内（i. V.)注射给药时，ALT-801对 带有鼠 MB491UC原位浅表性膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠的存活的效果。这研宄采用先前实施 例中描述的免疫活性C57BL/6小鼠中的相关和可繁殖的鼠 MB491UC膀胱癌模式。已证实滴 注后1至2天，将MB491UC细胞膀胱内滴注入C57BL/6小鼠的膀胱造成膀胱癌的浅表性形 式。滴注后第7至9天恶化成肌肉侵入性形式的肿瘤，而且在第2至3周后观察到肿瘤介导 的死亡。在本研宄中，在带有衍生自MB491UC细胞的鼠原位浅表性膀胱癌的C57BL/6小鼠 中检验静脉内给药ALT-801的存活益助。由于这些肿瘤缺乏ALT-801识别的人类p53(氨 基酸264至272)/HLA-A*0201络合物，此研宄是设计成评估ALT-801针对小鼠原位浅表性 膀胱癌的"非目标性"的抗肿瘤活性。
[0211] 聚赖氨酸预处理膀胱之后，在研宄第0天，将MB491uc(100yL中的0. 075x IO6细 胞/膀胱）膀胱内滴注入C57BL/6小鼠（9至11周龄）的膀胱。在肿瘤细胞滴注后第1、 8、15、20、23以及27天，静脉内给药？85(11 = 8)或41^-801(1.611^/1^，11 = 20)。当与？83 对照比较时，ALT-801的静脉内给药显著地延长小鼠的存活（P = 0. 0497)(图11)。
[0212] 在另一种实验中，聚赖氨酸预处理膀胱后，在研宄第0天，对C57BL/6小鼠（9至11 周龄）膀胱内滴注MB491UC细胞（0.075x IO6个细胞/膀胱）。肿瘤滴注之后，一组小鼠 (ALT-801 "lx 4"，n = 9)在SD1、SD8、SD15以及SD22经由侧尾静脉以静脉内注射I. 6mg/ kg ALT-801 每周四次而治疗，第二组小鼠（ALT-801"2x 4"，n = 9)在 SD1、SD4、SD8、SD12、 SD15、SD19、SD22以及SD26以I. 6mg/kg ALT-801注射八次（每周两次，共四周）而治疗， 以及对照组（η = 8)在 SD1、SD4、SD8、SD12、SD15、SD19、SD22 以及 SD26 以 PBS(K)O yL) 治疗。当与PBS对照组比较时，1.6mg/kgALT-801的"lx 4"和"2χ 4"治疗疗方两者显著 地延长小鼠的存活（分别为 P = 〇· 0413 和 P = 0· 0010)。PBS、ALT-801 "lx 4"（图 12Α) 和ALT-801 "2x 4"（图12B)组的存活时间中位数分别为15. 5、19以及22天。结果暗示 ALT-801的每周两次给药提供针对鼠 MB491uc原位浅表性膀胱癌的最佳抗肿瘤活性。观察 到的试验对象的抗肿瘤效果与ALT-801融合蛋白的抗原目标活性无关。
[0213] 实施例7 :带有MB491UC原位膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠的ALT-801治疗诱发免疫 细胞。
[0214] 进行这研宄以评估带有鼠 MB491uc原位膀胱肿的C57BL/6小鼠瘤的ALT-801治疗 的以免疫细胞为主的机转作用。如上述，在聚赖氨酸预处理膀胱后，在研宄（SD)第O天，对 C57BL/6小鼠膀胱内滴注MB491UC细胞（0. 075x IO6个细胞/膀胱）。没有肿瘤滴注的小鼠 作为对照。接着，在SD 7、10、14以及17,将小鼠（6只/群组）以PBS或ALT-801 (1.6mg/ kg)静脉内治疗。各治疗之后三天（亦即，SD 10、13、17、20)，牺牲小鼠群组，检验膀胱的肿 瘤恶化（血尿、膀胱尺寸、外观、新血管形成以及形态学），并且收集血液、脾脏以及膀胱以 进行免疫细胞分析。从血液制备PBMC，从脾脏制备细胞悬浮液，并且将膀胱固定且切割成区 块以进行免疫组织化学染色。将PMBC中的免疫细胞（⑶3、NK以及⑶8阳性细胞）及脾细 胞以单克隆抗体染色，并且以流式细胞仪分析。以IHC评估膀胱剖面中的免疫细胞（巨噬 细胞、NK以及CD3阳性细胞），并且以H&E染色检验肿瘤细胞。额外地，在整个研宄中，从动 物收集尿，以ELISA评估尿中细胞活素浓度（IFNy和TNF α )。
[0215] 与先前研宄相似，MB491uc细胞的膀胱内滴注造成膀胱中的原位肿瘤建立和造成 此等肿瘤在7至20天内快速发展成肌肉层（图13)。这些变化藉由增加血尿、膀胱的新血 管形成以及膀胱尺寸和其它外观的变化增加反映。如先前研宄中，以ALT-801治疗逆转这 些变化，造成在SD20的正常外观的膀胱（图13)。然而，值得一提的是带有MB491UC肿瘤或 正常小鼠的ALT-801治疗造成浸透入膀胱的免疫细胞增加。PBMC和脾脏中亦反映这些变 化，其中ALT-801治疗造成带有MB491uc肿瘤或正常的小鼠两者中的⑶3、⑶8以及NK细胞 的增加（图14A和14B)。伴随连续的ALT-801治疗，经诱发的免疫细胞（除了 PBMC⑶8细 胞）在SD20回复正常水平。在膀胱中，ALT-801治疗最明显地影响巨噬细胞水平，特别是 SDlO的带有动物的肿瘤中（图15)。将膀胱剖面中的染色的巨噬细胞水平定量，并且在图 16中显示绘制的数据。结果说明ALT-801治疗在正常小鼠（图16A)和带有MB491uc-肿瘤 的小鼠（图16B)两者中造成膀胱巨噬细胞水平显著的增加。在带有小鼠的肿瘤中，膀胱形 态学恢复正常时，经诱发的巨噬细胞水平在SD20恢复几乎正常的水平。以ALT-801治疗的 小鼠中亦见到NK和CD3阳性细胞的相似但较不显著的变化。这些结果暗示膀胱中的巨噬 细胞和其它免疫细胞亚型的ALT-801诱发负责于此模式中所观察到的抗膀胱肿瘤效果。
[0216] 尿中的细胞活素水平分析亦说明ALT-801治疗造成免疫反应的刺激。各剂量 的ALT-801之后，从带有MB491UC肿瘤的小鼠的尿中侦测到增加的IFNy浓度（图17A)。 ALT-801治疗无诱发这些动物的尿中的TNF α浓度（图17B)。然而，以PBS治疗的带有肿 瘤的小鼠的TNFa浓度随着时间增加，暗示肿瘤生长和尿TNFa浓度之间的因果关系。在 癌症患者中观察到ALT-801介导的血清IFNy的诱发和血清TNF a水平的治疗效果的缺乏 (Fishman 等人（2011)Clin Cancer Researchl7:7765)，表示这是对 ALT-80 治疗的常见免 疫反应。这些观察共同支持产生IFNy的免疫细胞（可能为巨噬细胞）在ALT-801治疗后 所观察到的抗肿瘤活性的角色。
[0217] 实施例8 :多发性骨髓瘤的鼠模式中的小鼠的ALT-801增加的存活。
[0218] 为了调查融合蛋白ALT-801 (c264scTCR-IL2)的效果和作用机转，对多发性骨髓 瘤的免疫活性C57BL/6小鼠模式以多发性剂量疗方给药。使用5T33P细胞（5T33骨髓瘤细 胞系的衍生物）发展人类多发性骨髓瘤的可繁殖的鼠模式。相较于PBS，ALT-801显著延长 带有5T33P骨髓瘤的小鼠的存活，且比起首次滴注5T33P的小鼠，ALT-801组的再激发小鼠 的存活显著更长。这些效果与ALT-801融合蛋白的目标活性无关，而且说明ALT-801提供 针对牠们先前暴露的肿瘤有耐久性免疫记忆反应的小鼠。
[0219] 如上说明，多个研宄已显示ALT-801展现针对缺乏T细胞的免疫缺陷小鼠的异体 移植模式中的HLA-A*0201 +/p53过度表达（p53+)的人类黑色素瘤、哺乳动物腺癌、膀胱癌以 及胰脏癌瘤的强效活性。由于CD8效应物T细胞可贡献ALT-801的抗肿瘤活性，发展免疫 活性小鼠中的额外合成的肿瘤模式以进一步评估ALT-801的功效。这些肿瘤缺乏p53胜肽 (氨基酸264至272) /HLA-A*0201络合物的表达。因此，这些模式中检验的ALT-801效果与 以scTCR为目标无关。基于免疫调节性分子对多发性骨髓瘤的已知抗癌症效果，发展免疫 活性小鼠中的鼠骨髓瘤模式，并且使用以评估ALT-801的功效和作用机转。
[0220] 鼠5T33骨髓瘤细胞，C57BL/KaLwRij小鼠中自发性地产生的一系列的可移植鼠骨 髓瘤中的一者，在C57BL/KaLwRij小鼠中是高度致瘤性，少至500个细胞即诱发瘫痪且早 在肿瘤植入后第36天死亡。5T33衍生细胞系，5T33P，是单离自先前已滴注lx IO7个亲代 5T33细胞系而瘫痪的C57BL/6小鼠。在这模式中，需要给予至少lx IO7个5T33P细胞以造 成C57BL/6小鼠瘫痪的接受率为大约100%。通常，注射lx IO7个5T33P细胞的小鼠显示 肿瘤接种后SD20和SD30之间的后腿瘫痪征兆。除了瘫痪以外，亦可使用BM细胞表达5T33 产生的IgG2b副蛋白质，以评估这模式中的肿瘤恶化状态。
[0221] 在最初研宄中，体外评估ALT-801对5T33P细胞生长的直接效果。细胞凋亡分析 说明500nM的ALT-801不影响5T33P细胞增殖，并且诱发细胞凋亡。基于先前非临床研宄， 预期这ALT-801水平是在治疗范围内。因此，ALT-801不出现对5T33P细胞具有直接的细 胞毒性效果。
[0222] 接着，检验带有鼠5T33P骨髓瘤肿瘤的免疫活性C57BL/6小鼠中的ALT-801的 体内抗骨髓瘤活性。研宄天=O(SDO)时，将雌性C57BL/6小鼠（5只小鼠/群组）经由 侧尾静脉以静脉内注射5T33P肿瘤细胞（lx IO7/小鼠）。肿瘤细胞注射之后，接着开始1 天（ALT-801-SD1实验组）或4天（ALT-801-SD4实验组）多重剂量ALT-801治疗。至于 ALT-801-SD1 实验组，在 SDI、SD4、SD8 以及 SD11，静脉内给药 1. 6mg/kg 的 ALT-801 (亦即， 4剂量）。同日，带有5T33P肿瘤的小鼠接收PBS(剂量相当的体积）以作为对照。至于 ALT-801-SD4 实验组，在 SD4、SD8、SD11 以及 SD15ALT-801，以 1.6mg/kg 静脉内给药。监控 小鼠的瘫痪或肿瘤生长和存活的临床征兆。展现后腿瘫痪的小鼠被认为是垂死。PBS组的 所有小鼠在SD22和SD34之间显示瘫痪征兆，而且这群组在肿瘤细胞给药后具有29天的存 活中位数。相反地，ALT-801-SD1和ALT-801-SD4组的所有小鼠在SD73 (ALT-801-SD1组的 观察期结束）存活，表示这些小鼠的5T33P肿瘤被治愈。因此，当时与PBS对照组比较时， 发现在SDl或SD4开始的多重剂量ALT-80治疗显著地延长带有5T33P骨髓瘤的小鼠的存 活（ALT-801-SD1 相对 PBS，Ρ〈0· 002 ;ALT-801-SD4 相对 PBS，Ρ〈0· 002)。ALT-801-SD4 组和 ALT-801-SD1组之间无观察到明显差异（PM). 05)。这些结果说明ALT-801治疗对这免疫活 性小鼠模式的5T33P骨髓瘤细胞是高度有效。
[0223] 为了评估ALT-801治疗是否提供长期抗肿瘤效果，对以骨髓瘤细胞先前挑战后存 活的以ALT-801治疗的小鼠再给药5T33P骨髓瘤细胞。将ALT-801-SD1实验组的小鼠 （η =5)在SD73 (最初肿瘤细胞挑战后）以lx IO7个5Τ33Ρ细胞再激发，以及将ALT-801-SD4 实验组的小鼠 （η = 5)在SD106以lx 1075Τ33Ρ个细胞再激发。在各个情况下，亦将五个 未接受治疗的小鼠注射lx IO7个5Τ33Ρ细胞，以作为肿瘤恶化的对照。无对任何的研宄组 进一步给药ALT-801研宄药物治疗。肿瘤细胞再激发之后，所有五只ALT-801-SD1小鼠存 活，直到SD192实验终止，而所有五只在SD73接收5T33P细胞的首次接受试验的小鼠显示 在SD89和SD107之间瘫痪和在肿瘤细胞给药后有16天的存活中位数。同样地，所有五只 ALT-801-SD4小鼠存活直到SD192,而五只在SD106接收5T33P细胞的首次接受试验的小鼠 中有四只显示在SD124和SD138之间瘫痪和在肿瘤细胞给药后有32天的存活中位数。总 体上，5T33P骨髓瘤细胞再激发之前给100天的ALT-801治疗显著地保护小鼠免于瘫痪和 死亡。共同地，这些结果展现不仅是ALT-801针对5T33P骨髓瘤的功效，也有其诱发长效免 疫记忆的能力。以上数据亦说明T细胞及/或NK细胞子集的活化效应物和记忆细胞可在 ALT-801针对5T33P肿瘤细胞的抗肿瘤活性中扮演了至关重要的作用，而且这些免疫细胞 可能可作用至少三个月来保护C57BL/6小鼠免于肿瘤再激发。
[0224] 治疗疗方期间无观察到死亡。在大部分情况下，在PBS和首次接受试验的实验组 中的小鼠展现后腿瘫痪之前，即观察到连续显著的体重流失，其是这模式中的典型征兆。 ALT-801实验组中无发现显著的体重流失，与使用ALT-801的其它同基因小鼠模式中所观 察到者一致。这些发现显示这模式中充分忍受有短暂毒性的ALT-801治疗疗法。无论是患 者的HLA-A*0201基因背景，应考虑患者的多发性骨髓瘤中ALT-801治疗的临床评估。
[0225] 相较于PBS，单一剂量ALT-801治疗显著地延长带有5T33P的小鼠的存活。这些 效果与体外副蛋白质产生测定法所评估的与研宄药物减少骨髓中的骨髓瘤细胞相关的能 力。相较于PBS群组，以一种或两种ALT-801剂量治疗的带有5T33P肿瘤的小鼠造成血液中 CD8+T细胞和NK细胞的数目及/或百分比的显著增加。免疫细胞耗尽研宄证实ALT-801的 抗骨髓瘤活性主要是由于CD8+T细胞，和部分是由于NK细胞。其它免疫细胞亦可在ALT-801 介导的抗骨髓瘤效果中扮演角色。
[0226] 进一步评估ALT-801对C57BL/6小鼠模式中的小鼠5T33P骨髓瘤细胞生长的效果 和功能性机转。在这研宄的第一部分中，在这模式中评估抗单一剂量ALT-801的肿瘤活性。 将雌性C57BL/6小鼠（5只小鼠/群组）静脉内注射5T33P骨髓瘤细胞。四天之后，对带有 5T33P肿瘤小鼠给药单一静脉注射的ALT-801(1. 6mg/kg)或PBS (剂量相当的体积）。监控 小鼠的存活作为研宄端点，而当小鼠展现后腿瘫痪的被认为是垂死。PBS组中的所有五只小 鼠在肿瘤细胞注射后第35天观察到死亡，而且存活中位数为24天。相反地，以ALT-801 治疗的小鼠的死亡显著地延迟，且存活中位数为49天（相对PBS组，P = 0.013)。ALT-801 群组的5只小鼠中的一者在整个120天观察期间的维持活着。
[0227] 在这研宄的第二部分中，评估5T33P模式中单一剂量ALT-801对骨髓中的骨髓瘤 细胞的短期效果。以ALT-801 (I. 6mg/kg)或PBS治疗带有肿瘤的小鼠，和在治疗后第1、4 以及8天收集骨髓细胞。接着将细胞体外培养6天，并且藉由ELISA分析培养上清液中的 产生副蛋白质的5T33P细胞（小鼠 IgG2b)。当与PBS组比较时，ALT-801体内治疗造成后 续骨髓培养物中的显著地较低水平的副蛋白质（P〈〇. 05)。来自ALT-801实验组的培养物中 看见副蛋白质浓度减少高达30倍。在研宄药物治疗后采集骨髓的所有三个时间点观察到 这效果。因此，单一剂量ALT-801治疗减少骨髓5T33P骨髓瘤细胞（如由副蛋白质产生所 测量）的能力是与ALT-801对延长这模式的延长效果一致。
[0228] 设计进一步的研宄以调查效应物免疫细胞在ALT-801针对免疫活性C57BL/6小鼠 中的小鼠5T33P骨髓瘤细胞的抗骨髓瘤效果中扮演的角色。与先前造成其它非临床研宄一 致，相较于PBS对照组中所观察到者，以一种或两种I. 2mg/kg剂量进行的ALT-801治疗带 有5T33P肿瘤的小鼠造成血液中的CD8+T细胞和NK细胞的数目及/或百分比的显著增加。 ALT-801治疗亦增加血液⑶4+CD25+FoxP3+Treg细胞的百分比。然而，这变化显著地少于效 应物CD8+T细胞和NK细胞子集所见者，表示其非ALT-801治疗的优势效果。
[0229] 如使用骨髓细胞培养测定法侦测衍生自5T33P的副蛋白质所评估，治疗后4天，以 一种或两种I. 2mg/kg剂量进行的ALT-801治疗亦对于减少骨髓中的5T33P骨髓瘤细胞数 目有效。免疫细胞耗尽研宄证实ALT-801的抗骨髓瘤活性是主要由于CD8+T细胞和部分由 于NK细胞。由于⑶8+和NK-细胞耗尽无法完整消除对C57BL/6小鼠中的5T33P肿瘤细胞 的抗肿瘤效果，其它免疫细胞可在ALT-801介导的抗骨髓瘤效果中扮演角色。这些研宄的 结果是与证实ALT-801治疗对于延长带有骨髓瘤的免疫活性小鼠的存活是高度有效的先 前研宄一致。
[0230] 实施例9 :ALT-801显著地延长带有MB491uc肿瘤的小鼠的存活。
[0231] 将静脉内给药ALT-801的功效与免疫活性C57BL/6小鼠的原位MB491UC肌肉侵入 性膀胱癌模式中的IL-2的功效比较。前临床动物研宄已说明ALT-801在裸鼠中展现针对 皮下 HLA-A*0201+p53 过度表达（p53+)UMUC-14 和 HLA-A*0201-阴性 p53 过度表达（p53+)的 KU7人类膀胱肿瘤异体移植中有相似的抗肿瘤活性，表示肿瘤细胞上的目标HLA-A*0201/ p53胜肽络合物对于ALT-801治疗效力好像不是必要的。对ALT-801针对免疫活性C57BL/6 小鼠中的鼠 MB491UC原位肌肉侵入性膀胱肿瘤的效果的额外调查亦隐含ALT-801的"非目 标性"的抗肿瘤活性。已知鼠 MB491uc肿瘤细胞缺乏ALT-801所识别的人类HLA-A*0201/ P53胜肽络合物。临床研宄已显示膀胱癌展现对以IL-2为主的疗法的适当敏感性。为了 了解ALT-801的抗肿瘤活性，比较膀胱肿瘤模式中的IL-2和ALT-801的抗肿瘤活性是令人 感兴趣的。
[0232] 在免疫活性C57BL/6小鼠的小鼠膀胱原位模式中评估ALT-801和IL-2静脉内治 疗的抗肿瘤效果。聚赖氨酸预处理膀胱后，在第〇天，对C57BL/6小鼠（10至11周龄）膀胱 内滴注MB491UC细胞（100 μ L中有3x IO4个细胞/膀胱）。在肿瘤细胞滴注后第7、10、14以 及 17 天，静脉内给药 ALT-801 (I. 6mg/kg，n = 8)、IL_2 (0· 42mg/kg，n = 8)或 PBS (100 μ L， η = 8)。当与IL-2和PBS对照比较时，ALT-801的四种静脉内剂量显著地延长小鼠的存活 (P < 0. 0002)(图18)。IL-2和PBS对照组之间无观察到统计学上显著差异（P = 0. 84)， 显示IL-2无抗肿瘤效果。这些结果说明每周两次的ALT-801治疗较针对MB491uc膀胱肿 瘤的重组人类IL-2展现更大的效力。亦从重复研宄获得相似的结果。
[0233] 实施例1〇^1^_8〇1在1^0、疆或〇)4以及〇)8细胞耗尽后增加带有]\^49111(3肿瘤 的小鼠的存活。
[0234] 如上述，ALT-801的治疗增加带有MB491uc的小鼠的脾脏和血液中的⑶3+T细胞、 ⑶8+T细胞以及NK细胞百分比。事实上，血液⑶8+T细胞在整个四种剂量的ALT-801疗程 保持显著地提升。带有MB491UC肿瘤的小鼠中重复用剂ALT-801后，亦观察到膀胱中有增 加的CD3+T细胞和NK细胞渗透。相反地，无论ALT-801治疗，膀胱巨噬细胞水平随着原位 MB491uc肿瘤恶化而增加。这些结果说明这些免疫细胞子集中的一种或多种在这ALT-801 模式中的抗肿瘤活性中有扮演角色。
[0235] 带有小鼠 MB491uc原位膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠中的M0 NK或CD4以及CD8细 胞耗尽后，评估ALT-801静脉内注射的抗肿瘤效果。小鼠在SD 0接收MB491UC滴注，并且 接着在SD 7、10、14以及17接收静脉PBS或ALT-801 (I. 6mg/kg)治疗。ALT-801或PBS治 疗之前，小鼠群组藉由在SD 6、9、13以及16腹腔内注射Clophosome (150 μ L/剂量）的接 收厘0耗尽；藉由在5〇2、3、6、9、13以及16疆腹腔内注射抗413的疆细胞耗尽（1〇(^1^中 有克隆PK136,250 yg);或藉由在SD 2、3、6、9、13以及16腹腔内注射抗CD4Ab(100yL中 有克隆 GKL 5, 250 μ g)和抗 CD8Ab (100 μ L 中有克隆 53-6. 72, 250 μ g)的 CD4 和 CD8 细胞 耗尽。维持小鼠，以评估研宄组之间的存活率以作为功效端点。
[0236] 相较于PBS控制的小鼠，静脉内给药ALT-801显著地延长小鼠存活（P = 0. 0014) (图19A)。当比较PBS对照的小鼠时，在已耗尽NK细胞的以ALT-801治疗的小鼠中获得相 似的结果（P = 〇. 0068)(图19B)。在M0耗尽后废除的ALT-801治疗后（P = 0. 1435)(图 19C)或在CD4/CD8细胞耗损后废除的ALT-801治疗后（P = 0. 5993)(图19D)后观察到存 活的抗肿瘤效果。
[0237] 结果说明M0及/或⑶4/⑶8细胞在ALT-801对带有小鼠 MB491uc原位膀胱肿瘤 的C57BL/6小鼠的抗肿瘤效果中扮演重要的角色。带有MB491UC肿瘤小鼠中的NK细胞的 耗尽无显现对ALT-801的功效有任何效果，暗示NK细胞是不需要的或其它细胞类型补偿 ALT-801介导的抗肿瘤反应中的NK细胞活性。
[0238] 有大量文献显示衍生自骨髓的抑制或细胞（MDSC)在广大排列的肿瘤模式中扩 张。MDSC作用以通过各式各样机转抑制NK和T细胞。不受限于特定理论，带有原位MB491uc 肿瘤的小鼠中存在的MDSC可提供免疫抑制性机转导致肿瘤发展的证据。
[0239] 为了评估这模式中的MDSC浓度，如上述对C57BL/6小鼠膀胱内滴注MB491uc肿瘤 细胞（〇.〇3x IO6个细胞/小鼠）。对照的小鼠无接收肿瘤细胞。在肿瘤细胞滴注后第3、 5、7、10以及13天从对照和带有肿瘤的C57BL/6小鼠（每组5只）收集血液。以流式细胞 仪评估血液中的GR-l +/CDllb+MDSC水平。带有肿瘤的小鼠中的血液MDSC水平早在肿瘤细 胞滴注后3天提高，并且进一步增加这些动物中的时间（图20)。MB491UC细胞滴注之后13 天，相较于对照的小鼠，带有肿瘤的小鼠的血液MDSC水平显著地增加。
[0240] 这些发现暗示MDSC可在抑制免疫系统中扮演角色，以促进原位MB491UC肿瘤模 式中的肿瘤生长。进行此研宄以评估不同类型的免疫细胞在肿瘤恶化上扮演的角色和 ALT-801在带有MB491UC原位膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠中的抗肿瘤活性。
[0241] 实施例11 :静脉内给药ALT-801增加带有MB491uc原位膀胱肿瘤的C57BL/6小鼠 的膀胱中的Ml-类型巨噬细胞。
[0242] 在先前的临床动物研宄中，静脉内给药ALT-801延长带有MB491UC原位小鼠膀胱 癌的C57BL/6小鼠的存活。来自带有MB491UC肿瘤的小鼠的膀胱的IHC染色在重复用剂 ALT-801之后较以PBS对照治疗的小鼠的膀胱中所见者展现更高水平的⑶3和NK细胞渗 透。以F4/80pan巨噬细胞标志侦测巨噬细胞说明，无论治疗，肿瘤生长恶化时，更多巨噬细 胞渗入膀胱。进行这研宄，以特征化对带有MB491UC的小鼠的膀胱中的巨噬细胞的功能性 表型的ALT-801介导的效果。
[0243] 由于其丰度、可塑性以及多样性，巨噬细胞在固体肿瘤中扮演重要的角色。识别 巨噬细胞的两个相异的活化状态：传统活化的（Ml)表型和另外活化的（M2)表型。各类型 的巨噬细胞具有其本身用于辨识的标志。Ml巨噬细胞的特征包含iNOS的表达、ROS以及 IL-12的产生。M2巨噬细胞是与IL-10、IL-lb、VEGF以及基质金属蛋白酶（MMP)的大量产 生联结。
[0244] 这研宄包含两组实验组PBS和ALT-801 (3只小鼠/群组）。聚赖氨酸预处理后10 分钟之后，在研宄（SD)的第0天，将MB491UC细胞（0. 06x IO6个细胞/小鼠）膀胱内滴注 入膀胱。在SD 11，将IOOyL的ALT-801 (1.6mg/kg)或PBS通过尾静脉以静脉内注射。治 疗的24小时内，牺牲小鼠，并且将其膀胱以液态氮在OCT中急冻。进行IHC染色，以检查膀 胱中的巨噬细胞的活化状态。使用iNOS和MMP-9以分别辨识Ml和M2巨噬细胞。
[0245] IHC结果说明相较于以PBS治疗的带有肿瘤的小鼠的膀胱，ALT-801的静脉注射增 加带有MB491uc肿瘤的小鼠的膀胱中的Ml类型巨噬细胞（图21)。除了 ALT-801组中的一 只小鼠，可在PBS和ALT-801组两者的所有小鼠中侦测到MMP-9阳性细胞。那只特定的小 鼠在ALT-801治疗之后似乎无肿瘤，而且即使可侦测到F4/80pan标志无显示任何iNOS或 MMP-9的阳性染色。这些结果说明由于iNOS和MMP-9是巨噬细胞活化标志，无肿瘤的环境 中不激发巨噬细胞。F4/80抗体染色显示相较于非带有肿瘤的小鼠，带有MB491uc原位肿 瘤的小鼠的膀胱中有实质数目的巨噬细胞。就膀胱巨噬细胞的F4/80抗体染色水平而论， PBS和ALT-80实验组之间无显著差异。总结，带有MB491uc小鼠进行静脉内ALT-801治疗 之后，将膀胱中的更高的巨噬细胞百分比再极化成Ml表型。与ALT-801功效是取决于带有 MB491uc肿瘤的小鼠中的巨噬细胞的发现一致，这些结果暗示再极化的Ml巨噬细胞可贡献 ALT-801发挥的抗肿瘤效果。
[0246] 实施例12:ALT-801诱发C57BL/6小鼠中的产生IFN-γ的细胞。
[0247] 先前研宄已证实在免疫活性C57BL/6小鼠中的原位MB491UC肌肉侵入性膀胱癌模 式中的静脉内ALT-801给药的抗肿瘤活性。小鼠 MB491UC细胞不表达由ALT-801所识别的 人类p53(氨基酸264至272)/HLA-A*0201络合物。因此，假设ALT-801针对MB491uc肿瘤 有"非目标性"的抗肿瘤活性。评估ALT-801针对鼠 MB491UC膀胱肿瘤细胞的作用机转。
[0248] 先前显示ALT-801治疗增加动物模式和癌症患者中的IFN- γ血清水平 (Fishman 等人，Clin Cancer Res, 17:7765-7775, 2011 ；ffen 等人,Cancer Tmmunol Immuother, 57:1781-1794, 2008)。IFN-γ藉由抑制各种肿瘤细胞生长、向上调节肿瘤细胞 上的MHC分子的表达、多种免疫细胞的活化以及抗血管新生而在抗肿瘤免疫力中扮演重要 的角色。活化之后，可由免疫细胞，例如，CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞的多个子集产 生IFN-γ。在这报告中，评估以1.6mg/kg静脉内给药ALT-801后24小时，来自C57CL/6 小鼠的血液中的IFN-γ水平。对照的小鼠 （η = 5)的血清中的IFN-γ不可侦测，但在给 药ALT-801之后达成196 (±44) pg/mL的浓度（η = 5)(图22)。为了调查ALT-801治疗之 后哪些细胞类型为IFN-γ的主要产生者，将针对小鼠 CD4、CD8以及NK细胞的单克隆抗体 腹腔地注射入C57BL/6雌性小鼠，以耗尽相对应的免疫细胞子集。ALT-801注射24小时之 后，测定耗尽免疫细胞的小鼠中的血清IFN-γ水平。结果显示ALT-801给药之后，⑶4、NK 以及三重⑶4、⑶8以及NK细胞耗尽的小鼠 （η = 5/群组）的血清中的IFN-γ浓度分别达 到 75(±58)pg/mL、74(±25)pg/mL 以及 82(±52)pg/mL(图 22)。相反地，CD8T 细胞耗尽 的小鼠 （η = 5)的血清IFN-γ浓度达到257 (±60)pg/mL。结果说明⑶4+T细胞和NK细胞 是ALT-801诱发的IFN-γ的主要产生者，但⑶8+T细胞则否。血清IFN-γ的显著诱发仍 可在进行ALT-801治疗具有⑶4 +、⑶8+T细胞以及NK细胞的三重耗尽的小鼠后侦测。此发 现说明了除了 CD4+T细胞和NK细胞以外，其它类型细胞亦贡献以ALT-801治疗的小鼠中的 IFN-γ产生。
[0249] 在这研宄的第二部分中，调查IFN-γ对MB491uc细胞生长的效果。在具有1或 10ng/mL的IFN-γ的RPMI-10中培养MB491uc细胞（2x IO5/孔）。采收以IFN-γ治疗的 MB491UC细胞，并将其以FITC标示的膜联蛋白V染色。以流式细胞仪测定膜联蛋白V阳性 细胞凋亡MB491uc细胞。IFN-γ治疗不直接造成针对MB491uc细胞的可侦测的细胞毒性 (图 23)。
[0250] 在具有20nM ALT-801的RPMI-IO中培养小鼠细胞3天，接着在细胞毒性测定法中 用作针对PKH67标示的MB491uc目标细胞的效应物LAK细胞。在含有0至50nM ALT-801 的RPMI-IO中，于37°C培养效应细胞（4x 1〇7孔）和目标细胞（4x IO5/孔）24小时。基于 用碘化丙啶染色，以流式细胞仪，评估LAK细胞针对MB491UC细胞的细胞毒性。ALT-801活 化的细胞是取决于细胞毒性测定法期间存在的ALT-80的浓度的方式，有效地溶解MB491uc 细胞（图24)。
[0251] 吉西他滨是用于肌肉侵入性膀胱癌的标准组合化学疗法的药物中的一者。已报 导吉西他滨减少带有肿瘤的小鼠中的衍生自骨髓的抑制细胞（MDSC)。在此报告中，吾等研 宄吉西他滨对小鼠中的MB491uc细胞所诱发的MDSC的效果。将带有MB491uc肿瘤的小鼠 以40mg/kg的吉西他滨静脉内地治疗。天吉西他滨治疗后三天，单离脾细胞，并且以流式 细胞仪测定Grl +CDllb+MDSC的百分比。没有MB491uc肿瘤的正常对照的小鼠中，MDSC负责 I. 19(±0. 25)百分比的细胞。带有MB491uc肿瘤的小鼠中，这些MDSC增加至4. 29(±1. 32) 百分比的脾细胞。相反地，以吉西他滨治疗带有肿瘤的小鼠造成脾脏中的MDSC减少至 1. 83 (±0. 92)百分比（图25)。这些结果证实吉西他滨显著地减少带有肿瘤MB491uc的小 鼠中的脾脏中的MDSC水平。
[0252] 先前显示ALT-801和IL-2具有相同活性，以刺激活化体外人类T细胞和NK细胞。 展示针对多种肿瘤细胞的细胞毒性的IL-2活化的免疫细胞被称为LAK(淋巴因子活化的 杀伤）细胞。LAK细胞活性是将效应细胞ALT-801预活化的小鼠脾细胞用作效应细胞和将 MB491uc肿瘤用作目标细胞调查。这研宄的结果显示ALT-801活化的细胞是取决于ALT-801 在杀死期的浓度的方式，有效地溶解MB491uc细胞。此发现说明ALT-801能活化效应物免 疫细胞和增大它们针对膀胱肿瘤细胞的细胞毒性活性。额外地，吉西他滨治疗显著地减少 带有MB491UC肿瘤的小鼠的脾脏中的MDSC浓度。
[0253] 实施例13 :MDSC过继转移之后ALT-801诱发免疫细胞杀死肿瘤细胞。
[0254] 在C57BL/6小鼠中静脉内或皮下注射MB491UC膀胱肿瘤细胞后建立肿瘤造成血液 和脾脏中的MDSC水平显著增加。MDSC是由骨髓前体细胞、不成熟巨噬细胞、不成熟树突状 细胞以及不成熟粒细胞所组成的不成熟骨髓细胞的异质群体。大量文献显示在宽排列的肿 瘤模式中的MDSC扩增。MDSC作用以抑制NK和T细胞通过直接细胞接触、细胞因子以及代 谢途径的副产物、控制Tregs的扩增和活化以及支持肿瘤细胞的新生血管形成和转移性扩 散。在小鼠中，MDSC是由CDllb和Grl的细胞表面表达所界定。正常小鼠仅具有一小部分 (2至4% )的脾脏细胞为⑶llb+Grl+，但具有这表型的细胞可在一些小鼠肿瘤模式中达到 20至40%。为了调查这些细胞的活性，从带有皮下MB49G肿瘤的C57BL/6小鼠采收脾脏，并 且以抗Grl和抗Ly6G Ab珠磁性分选而单离MBSC。通过这程序，从各动物收集纯度为96 % 的 IX IO7MDSC(图 26)。
[0255] 接着，将纯化的MDSC转移入同基因的正常小鼠，以允许评估它们对正常免疫效应 细胞的免疫抑制活性。过继转移后四十小时，收集接收方小鼠的脾脏细胞，并且藉由以50nM ALT-801培养两天而活化。将产生的LAK效应细胞与以PKH67标示的MB491uc肿瘤细胞目 标共培养隔夜，以评估肿瘤细胞杀死。与先前对ALT-801的抗肿瘤效果的非临床研宄一致， 发现来自正常C57BL/6小鼠的ALT-801活化的LAK细胞有效地杀死MB491uc肿瘤细胞，而 没有ALT-801活化的新鲜脾细胞展现微弱的细胞溶解活性（图27)。更重要地，以ALT-801 体外刺激后，MDSC转移后从小鼠单离的脾细胞显示显著减少的作为具有抗肿瘤细胞溶解活 性的LAK细胞的可能性。不受限于特定理论，这些发现说明体内肿瘤诱发的MDSC的存在损 害脾脏效应细胞对后续ALT-801活化反应的能力。因此，此研宄结果支持膀胱肿瘤诱发的 MDSC活性不利于ALT-801的抗肿瘤效果的假说。
[0256] 至于多种免疫细胞功能的强效抑制剂，MDSC是用于抗癌症治疗的可能治疗目标。 例如，吉西他滨为广泛使用的化学治疗，可选择性地消除带有肿瘤的动物中的MDSC，并且增 强肿瘤-抑制性免疫活性（Suzuki等人，Clin Cancer Res, 11:6713-6721，2005)。在小鼠 膀胱肿瘤模式中的非临床研宄中，发现与吉西他滨和ALT-801的组合疗法较使用任一剂的 单一疗法更为有效。例如，以ALT-801(0.8mg/kg，次佳剂量）与吉西他滨（40mg/kg)的组合 治疗带有吉西他滨有抗性皮下MB49G肿瘤的小鼠造成较以PBS治疗的小鼠显著更慢的肿瘤 生长，而单独以41^-801(0.811^/1^)和吉西他滨（4〇11^/1^)治疗的小鼠中的肿瘤恶化与？83 组并无显著的不同。这些结果暗示吉西他滨治疗减少MDSC的免疫抑制活性，允许ALT-801 更有效地活化抗肿瘤免疫反应，而不是直接作用在肿瘤生长上。
[0257] 实施例14 :ALT_801的抗肿瘤机转作用的模式。
[0258] 已进行广泛的努力来揭示使用多种动物模式、免疫耗尽研宄、免疫组织化学、细胞 活素测定法、基因剔除小鼠、细胞介导的杀死方法以及流式细胞仪所分析的ALT-801针对 癌症的作用机转。不受限于特定理论，这些研宄活动的结果是与以下观察一致：
[0259] · ALT-801 活化 CD4+和 NK 细胞以分泌 IFN- γ。
[0260] · IFN- γ活化巨噬细胞，将肿瘤联结的巨噬细胞（TAM)从肿瘤-促进M2再极化成 肿瘤-破坏性Ml期，以及诱发针对肿瘤细胞的T hI免疫反应。
[0261] · ALT-801单独刺激记忆⑶8+Τ细胞以增殖和向上调节内生类型的杀伤受体。
[0262] ?这些活化的CD8+记忆细胞展示针对肿瘤的强效，但无抗原特异性的细胞杀死免 疫反应。
[0263] · IFN-γ依赖途径和非特定⑶8+记忆细胞两者对于ALT-801的体内抗肿瘤效力 是必要的。
[0264] IFN-γ和肿瘤联结的巨噬细胞的再极化
[0265] 正常和带有肿瘤的小鼠中渗入时，ALT-801治疗诱发IFN-γ的分泌。ALT-801静 脉内渗入后大约4至6小时，血清和尿两者中的有高浓度的IFN-γ (Fishman等人，Clin Cancer Res, 2011. 17:7765)。基于免疫耗尽研宄，CD4+和NK细胞为血清IFN-γ的主要来 源，显示ALT-801给药诱发的IFN- γ的血清水平是藉由消除小鼠中的CD4+T细胞和NK细 胞而实质上减少（实施例12)。膀胱癌细胞中，IFN-γ无抑制膀胱癌细胞生长或诱发细胞 凋亡。然而，在IFN-γ基因剔除（KO)的C57BL/6小鼠中，ALT-801丧失其针对膀胱内植入 MB491UC膀胱肿瘤的抗膀胱癌活性。不受限于特定理论，免疫组织化学染色结果说明这可能 因为需要IFN-γ来将M2TAM再极化成M1TAM(实施例11)。这些MlTAM展示针对肿瘤的快 速和强效的抗肿瘤反应。
[0266] IFN- γ为单核细胞和巨噬细胞的最强效刺激剂（Schroder等人，J Leukoc Biol, 2004. 75:163)。显示使用脂质体的单核细胞的耗尽移除ALT-801针对原位MB491uc 膀胱肿瘤的功效的研宄结果所证实单核细胞/巨噬细胞在ALT-801介导的抗肿瘤活性中 的关键角色（实施例10)。因此，IFN-γ (来自ALT-801活化的⑶4+和NK细胞）具有活 化循环单核细胞和巨噬细胞（诸如，肝脏中的Kupffer细胞）以渗入细胞介导的肿瘤杀死 的肿瘤病变（Seki等人，Clin Dev Immunol, 2011,2011:868345)的可能性。除了再极化 TAM和活化单核细胞和巨噬细胞以外，亦已知INF-γ (其为一种多效性细胞活素）展现多 种抗肿瘤功能（Schroder 等人，J Leukoc Biol, 2004, 75:163 ;Zaidi 等人，Clin Cancer Res, 2011，17:6118)。亦可想到从以ALT-801活化的CD4+和NK细胞分泌的INF-γ经由大量 次级反应基因的活化而直接影响肿瘤生长（Boehm等人，Annu Rev Immunol, 1997, 15:749) 〇
[0267] 发现CD4+T细胞耗尽亦移除ALT-801针对C57BL/6小鼠中的MB491uc的抗肿瘤 活性，但NK细胞耗尽则否。ALT-801亦在缺乏T细胞的SCID小鼠中，丧失其抗MB491UC活 性。不受限于特定理论，ALT-801-活化的⑶4+T细胞能渗入肿瘤，并且在肿瘤微环境中分 泌IFN-γ，以有效地再极化TAM，以用于肿瘤破坏。IHC研宄的数据（实施例11)与这理论 一致。
[0268] 经由新颖机转的记忆CD8+细胞介导的抗肿瘤活性
[0269] 在免疫耗尽研宄中，⑶8+和⑶4 +细胞的消除可消除ALT-801在C57BL/6小鼠中的 原位MB491uc膀胱肿瘤模式中的抗肿瘤活性，而单独消除NK细胞则否。因此，ALT-801-活 化的⑶8+细胞对于ALT-801的抗膀胱癌活性是重要的。
[0270] 最近已显示细胞因子介导的刺激可促进具有独特表型的记忆⑶8+细胞的无抗 原特异性的扩大。不同于向上调节ro-Ι和⑶25的抗原依赖性扩大所产生的记忆⑶8+T 细胞，这些研宄中的细胞因子介导的扩大记忆的CD8+T细胞表达具有广泛的溶胞能力 的NKG2D (其为一种颗粒酶B)，并且暗示所述能力负责癌症免疫疗法的明显抗肿瘤效果 (Tietze等人，Blood, 2012, 119:3073)。不受限于特定理论，这类型的记忆CD8+T细胞的 ALT-801活化在小鼠中的抗MB491uc肿瘤活性中扮演主要的角色。为了评估这可能性，首 先检验单独的ALT-801是否可诱发体外的记忆⑶8+T细胞扩大。以ALT-801或抗⑶3抗体 (TCR依赖性接合）活化之后，比较⑶8+⑶44 s T细胞的表型。曝露于ALT-801或抗⑶3抗体 的⑶8+T细胞产生具有明显不同表型的⑶8+⑶44s T细胞。ALT-801刺激导致NKG2D的向上 调节，但更高水平的CD25和Η)-1表达则否，而抗CD3刺激导致更高水平的CD25和Η)-1表 达，但非NKG2D向上调节。为了检验体内是否发生相似现象，将不带有肿瘤的小鼠以I. 6mg/ kg ALT-801 (于100 μ L)或PBS (100 μ L)静脉内地注射两次（隔72小时），并且在第二次 PBS或ALT-801治疗之后分析PBMC和脾细胞的表型一天。ALT-801治疗后，比较表达NKG2D 扩大的⑶8+CD44?记忆T细胞水平与以IL-2或PBS治疗的小鼠中所见的水平。相反地， ⑶8+CD44?记忆T细胞群体中无观察到ALT-801向上调节Η)-1或⑶25。
[0271] ⑶8+CD44?记忆T细胞过继转移实验中亦观察到相似的结果。在这研宄中，以 Celltrace? Violet标示的脾细胞（0. 5x IO6)从首次接受试验的C57BL/6小鼠过继转移入 首次接受试验的同基因的C57BL/6小鼠，接着在过继细胞转移后一天以ALT-801或PBS静 脉内地治疗小鼠。接着，第二次ALT-801或PBS治疗之后一天，分析来自接收方小鼠的脾脏 的CD8+CD44? T细胞的表型。ALT-801诱发CD8+CD44? T细胞的增殖，而IL-2或PBS则否。 额外地，在以ALT-801治疗的接收方小鼠中经过继转移和扩大的记忆⑶8+⑶44 s T细胞之间 的NKG2D-阳性细胞群体增加，但以PBS治疗的接收方小鼠则否。再者，ALT-801治疗后无 观察到这些细胞的表面上有⑶25或Η)-1的向上调节。因此，这些数据证实ALT-801明显 能以与抗原无关的方式活化具有独特表型的CD8+CD44?记忆T细胞。
[0272] 为了进一步证实表达NKG2D的⑶8+⑶44s T细胞的百分比的增加是由于NKG2D的 重生调节，而非先前存在的NKG2D+记忆⑶8+1'细胞群体的扩大，将首次接受试验的0578176 小鼠 NKG2D7CD257CD8+/CD44S T细胞分类。以Celltrace? Violet示踪剂标示分类的 NKG2D7⑶257⑶87⑶44s T细胞，并且过继转移（0. 4x IO6个细胞/接收方小鼠）入首 次接受试验的C57BL/6小鼠。转移后一天，以两种剂量的PBS或以ALT-801治疗小鼠，并 且于第二次治疗后一天采集脾细胞以分析NKG2D表型。来自以ALT-801治疗的小鼠的以 Celltrace? Violet标示的CD8+CD44高T细胞中的NKG2D扩增且向上调节，而PBS对照组中 则否。在体外，以ALT-801活化的CD8+CD44? T细胞展现针对膀胱癌细胞的与抗原无关的强 效抗肿瘤活性。
[0273] 不受限于特定理论，结果与以抗原无关的方式使ALT-801活化CD8+T细胞以增殖 和向上调节内生类的表面受体的模式一致。这些活化的记忆T细胞展示针对膀胱癌细胞的 有效，但与抗原无关的杀死。可能是这内生类型，与抗原无关的反应是抗肿瘤活性不取决于 目标的P53-胜肽/HLA-A*0201抗原的原因。
[0274] 这新颖的机转作用对于固体肿瘤而言与其它以T细胞为主的免疫治疗剂（诸如抗 CTLA和抗ro-i抗体）不同，而且可增强支持这些结论的这些研宄的效力。
[0275] 设计有ALT-801的最佳组合疗法
[0276] 已知癌症患者（尤其是彼等有晚期疾病者）是免疫学上受损。这是因为肿瘤 细胞主动地诱发呈现抗原细胞和效应细胞的功能障碍，并且促进调控免疫细胞的扩大， 其向下调节抗肿瘤免疫力，允许肿瘤细胞逃逸免疫反应（Whiteside, J Allergy Clin免 疫 1，2010, 125:S272 ;Poschke 等人，Cancer Tmmunol Immuotherher, 2011, 60:1161 ； Talmadge, Semin Cancer Biol, 2011, 21:131)。两个最佳特征化的免疫抑制细胞 子集为FoxP3+调控细胞（Tregs)和衍生自骨髓的抑制细胞（MDSCs) (Qin，Cell Mol Immunol, 2009,6:3 ;Gabrilovich 等人，Nat Rev Immunol, 2009,9: 162; Ostrand-Rosenberg, CAncer Immunol Immuotherher, 2010, 59:1593.)。MDSC 为由骨髓前 体细胞、不成熟巨噬细胞、不成熟树突状细胞以及不成熟粒细胞所组成的不成熟骨髓细胞 的异质群体（Gabrilovich等人，Nat Rev Immunol, 2009, 9:162)。大量文献显示在宽排 列的可移植和原位生成肿瘤模式中的MDSC扩增。由于假设细胞通过肿瘤衍生因子（诸 如，粒细胞-巨噬细胞群落-刺激因素和TNF- α )的分泌而从骨髓扩增及募集至肿瘤位 置，血液、脾脏、骨髓以及肿瘤位置的MDSC累积有可能为肿瘤恶化中的早期事件（Bayne 等人，Cancer Cell, 2012, 21:822 ;Pylayeva_Gupta 等人，Cancer Cell, 2012, 21:836; Zhao等人，J Clin Invest, 2012,122:4094.)。MDSC作用以抑制NK和T细胞通过直接 细胞接触、细胞因子以及代谢途径的副产物、控制Tregs的扩大和活化、Treg渗透到肿瘤 的促进，以及支持肿瘤细胞的新生血管形成和转移性扩散（Gabrilovich等人，Nat Rev Immunol, 2009,9:162 ;Peranzoni 等人，Curr Opin Immunol, 2010,22:238 ;Marigo 等 人 Immunol Rev, 2008,222:162 ;Chioda 等人，Cancer Metastasis Rev, 2011，30:27; Schlecker 等人，J Immunol, 2012，189:5602)。
[0277] MDSC显现与肿瘤联结的巨噬细胞（TAM)密切相关，所述TAM通常展现M2极 化，而且可藉由产生IL-10、TGFf3以及促血管形成因子（诸如，基质金属蛋白酶）、 VEGF以及衍生自血小板的生长因素而贡献肿瘤发展和免疫抑制（Mantovani等人，Hum Immunol, 2009, 70:325)。最近小鼠模式的证据暗示达到肿瘤的缺氧环境时，MDSC可区分成 TAM，而且之后展示相异的表型和功能性特征（Corzo等人，.J Exp Med, 2010, 207:2439)。
[0278] 膀胱癌患者中的衍生自骨髓的抑制性细胞：由于MDSC的最初辨识，数个后续 刊物报导增加有各式各样人类固体肿瘤的患者中MDSC循环浓度增加（Montero等人，J Immuothher, 2012, 35:107.)。报导在非肌肉侵入性和肌肉侵入性膀胱癌患者中，周围血 液中存在 2 个相异的 MDSC 群体（Eruslanov 等人，Int J Cancer, 2012, 130:1109.) :(i) ⑶Ilb+/⑶15s/⑶33低与中性粒细胞标志⑶114和⑶117的共表达；以及（ii)⑶Ilb +/⑶15低 /⑶33s与单核细胞-巨噬细胞标志⑶14、⑶115、⑶116以及CCR2的共表达。当比较来自健 康志愿者的样本和患者周围血液样本时，仅发现在膀胱癌患者中存在更高水平的CDl Ib+/ ⑶15high/⑶33?细胞，而发现健康志愿者中存在显著量的⑶Ilb+/⑶15低/⑶33 s细胞。虽然 发现两个群体分泌实质量的细胞因子，仅注明CDllb+/CD15high/CD33 is群体具有免疫抑制活 性。在肿瘤试样中，发现2个相异的MDSC群体渗入肿瘤：彼等细胞中有60%至70%的被描 述成⑶I lb+/HLA-DR+，而剩下30 %至40 %被描述成⑶I Ib+和⑶15 +。未完全探讨彼等细胞的 临床显著性。在另一个研宄中，在膀胱尿道上皮癌瘤患者中发现增加的免疫抑制性CD14+/ HLA-DRvis细胞的循环水平和临床癌症期及病理级别的相关性。因此，膀胱尿道上皮癌瘤的 患者展现提升MDSC的水平，包含与晚期疾病相关的免疫抑制性表型。
[0279] 已进行连接MDSC和膀胱癌的前临床研宄，并且总结如下：
[0280] ?在C56BL/6小鼠中的原位MB491UC模式中，当疾病这化成成肌肉侵入性期时，膀 胱内植入的肿瘤实质上提高血液中的MDSC (实施例10)。
[0281] ?在此模式中，当MB491uc肿瘤细胞皮下或静脉内地植入时，观察到相似的结果 (实施例12)。
[0282] ?将带有MB491uc肿瘤的C57BL/6小鼠的MDSC分类，并且过继转移至非带有肿瘤 (接收方）的C57BL/6小鼠。将来自接收方小鼠或野生型C57BL/6小鼠细胞单离，并且以 ALT-801体外激发。接着，体外评估以ALT-801活化的脾细胞针对MB49 Iuc细胞的细胞毒性。 来自野生型C57BL/6小鼠的脾细胞较从MDSC接收方小鼠单离的细胞展现显著更强的针对 MB491uc细胞的细胞毒性（实施例13)。这些数据证实MB491uc诱发的MDSC针对ALT-801 诱发的生物活性的强效免疫抑制活性。
[0283] 这些研宄的结果暗示膀胱肿瘤细胞诱发MDSC可妨碍或干扰体内的ALT-801的抗 肿瘤活性。
[0284] 吉西他滨增强ALT-801抗肿瘤免疫反应：已建议消除MDSC可显著地增进癌症免 疫疗法（诸如，ALT-801)的抗肿瘤反应和增强的效果。
[0285] 吉西他滨为用于人类转移性膀胱癌中第一线化学疗法的主要组分，而且发现 其为治疗剂量时，实质上减少带有大肿瘤的动物的脾脏中MDSC的数目，但没有影响 ⑶4+T细胞、⑶8+T细胞、NK细胞、巨噬细胞或B细胞的数目（Suzuki等人，Clin Cancer Res，2005, 11:6713.)。MDSC的流失伴随CD8+T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性的增加。以吉 西他滨预处理显著地扩大IFN-β对大间皮瘤肿瘤的抗肿瘤效果。在C26鼠腺癌模式中，带 有肿瘤的小鼠中较对照的小鼠在脾脏中具有显著地提升的MDSC水平，并且如STATl磷酸化 的测量的在IFN- α和INF- γ的反应中展现减少的脾细胞活化（Mundy-Bosse等人，Cancer Res, 2011，71:5101.)。以吉西他滨或抗GRl抗体治疗带有C26的小鼠导致MDCS的耗尽和 脾细胞IFN反应性的恢复。
[0286] 已进行将吉西他滨与膀胱癌细胞诱发的MDSC活性的减少连接的临床前研宄，并 且总结如下：
[0287] ?在MB491uc肿瘤模式的临床前研宄中，吉西他滨治疗显著地减少带有肿瘤的小 鼠中的MDSC水平（实施例12)。这些数据暗示吉西他滨可为对消除MDSC有用的化学治疗 药物，藉此允许ALT-801刺激的免疫效应细胞介导针对膀胱癌的抗肿瘤活性。
[0288] ?在C56BL/6小鼠中的原位MB491uc模式中，次佳浓度的ALT-801与吉西他滨的组 合是有效的，但较相同水平的ALT-801与顺铂+吉西他滨的组合针对MB491uc肿瘤展现更 少的毒性（亦即，体重流失）。同样地，在带有皮下MB491uc肿瘤的C57BL/6小鼠中，ALT-801 与吉西他滨的组合较单独的A LT-801或单独的吉西他滨造成显著更大的抗肿瘤活性。
[0289] ?已产生有吉西他滨抗性的MB491UC肿瘤细胞，并且用以评估C57BL/6皮下肿瘤模 式中次佳剂量的ALT-801与吉西他滨的组合的功效。结果显示次佳剂量水平的ALT-801与 吉西他滨的组合较单独的ALT-801或吉西他滨展现显著更大的抗肿瘤活性。
[0290] 共同地，这些结果暗示ALT-801与吉西他滨的组合可提供转移性膀胱癌（特别是 有铂抗性的肿瘤）的有效治疗，同时顺铂可为废除的。因此，评估ALT-801与吉西他滨的组 合在对以铂为主的治疗的晚期膀胱癌患者中的抗肿瘤活性是令人感兴趣的。这功效研宄的 结果将告知是否从当前的ALT-801+吉西他滨+顺铂疗方移除顺铂，以治疗对顺铂+吉西他 滨有抗性的转移性尿道上皮癌瘤患者。若以非铂为主的疗方经证明为和以铂为主的疗方一 样有效，将亦大幅帮助具有肾功能不全的患者，而不适合接收含有顺铂的疗方。已向美国 FDA提交晚期膀胱癌实验中的ALT-801+吉西他滨试验中招收高达十四位患者的提议，而且 这试验的患者招收是从2012年12月开始。
[0291] 实施例15 :人类临床试验实验计划。
[0292] 研宄设计
[0293] 这是在具有膀胱、肾盂、输尿管以及尿道的肌肉侵入性或转移性尿道上皮细胞癌 患者中，在含有顺铂和吉西他滨的生物化学疗法疗方中的ALT-801的第Ib/II期，开放标 签，多发性中心，竞争性招收以及提升剂量的研宄。以符合良好临床实践（Good Clinical Trial, GCP)的方式进行研宄。
[0294] 研宄包含剂量提升期以测定ALT-801与顺铂和吉西他滨的组合的最大忍受剂量 (MTD)和在MTD的两阶段扩大期。这研宄中的剂量提升是使用（3+3)剂量提升设计，而且 在MTD的二阶段扩大期是使用修改的Simon两阶段设计进行。在这研宄的剂量提升期中， 除了两个不提升的剂量水平之外，还有ALT-801的五个剂量水平（0. 04mg/kg、0. 06mg/kg和 0· 08mg/kg、0. 10mg/kg 和 0· 12mg/kg)。顺钼（70mg/m2/ 剂量）和吉西他滨（1000mg/m2/ 剂 量）的剂量在横跨所有ALT-801剂量水平是固定的。若剂量提升期未达到MTD，则赞助商， 数据安全监控委员会（Data Safety Monitoring Board)，及主要调查者会唔以讨论是否修 正实验计划以扩张剂量提升期，以包含额外的ALT-801剂量水平。
[0295] 治疗
[0296] 计划的最初研宄中的治疗为3个疗程。各疗程是由顺铂（第1天）、吉西他滨（第 1天）、ALT-801 (第3天和第5天）、吉西他滨（第8天）、ALT-801 (第8天和第10天）以 及休息期（第11至21天）所组成。第二或第三个疗程开始之前，受试者需求达到连续标 准。完成研宄治疗的三个完整疗程时，已将各招收的患者按排，而具有总共12种剂量的研 宄药物ALT-801、3种剂量的顺铂以及6种剂量的吉西他滨。完成3个疗程的最初研宄治疗 之后，具有至少稳定的疾病和达到其它治疗标准的患者将以每周四种额外的ALT-801剂量 重复研宄治疗。实验计划中解决延迟或修改。这是在以下方案和图28和29中阐释：
[0297] 最初研宄治疗：

【权利要求】
1. 一种改善受试者的癌症的方法，包括： 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂，藉此改善所述 癌症。
2. 如权利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特异性地W所述癌症为目标或结 合所述癌症。
3. 如权利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白包括T细胞受体灯CR)结构域。
4. 如权利要求3的方法，其中，所述T细胞受体结构域为单链T细胞受体。
5. 如权利要求1的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由下列各者所组成群组： 己酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯达莫司汀、贝 伐单抗、舊萨罗了、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯基）苯 横酷胺、博来霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉氨 酷基-k脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、恶病质素、卡培拉滨、西马多了、西妥昔单 抗、瘤可宁、环磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -诺文-长春碱、多西他赛、多締紫 杉醇、环磯酷胺、卡销、卡莫司汀炬CNU)、顺销、念珠藻环肤、环磯酷胺、阿糖胞巧、达卡己嗦 (DTIC)、更生霉素、达沙替巧、柔红霉素、多拉斯他了、多韦替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B、埃罗替巧、艾瑞布尔、依托泊巧、依维莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、氣他 胺、吉非替巧、吉西他滨、哲基脈W及哲基脈紫杉烧类、宜佛斯酷胺、干扰素a、伊马替巧、 伊匹单抗、依利诺替康、拉钩它索，拉帕替巧、来那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧达明、洛 莫司汀（CCNU)，二氯甲基二己胺（氮芥）、美法仑、哲己基横酸米伏布尔、利索新、什汀巧 夫、链脈霉素、丝裂霉素、甲氨蝶岭，5-氣尿喀晚、巧鲁米特、奥那司酬、草酸销、他克挫、帕 巧单抗、帕挫帕巧、普拉曲沙、泼巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔单抗、 RPR109881、罗米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索尔明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、立甲曲沙、威罗菲巧、长春花碱、长春新碱、硫酸长 春地辛、长春氣宁W及伏立诺他。
6. 如权利要求1的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由吉西他滨和包含顺销 的W销为主的化合物所组成群组。
7. 如权利要求1的方法，其中，所述癌症是选自由膀脱癌、尿道、输尿管W及肾孟的尿 道上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细 胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜脏癌W及胃癌所 组成群组。
8. 如权利要求1的方法，其中，所述癌症是膀脱或尿道上皮细胞癌。
9. 如权利要求1的方法，其中，所述癌症有化学抗性。
10. 如权利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约7 至14天内给药。
11. 如权利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约3 至5天内给药，或同时给药。
12. 如权利要求1的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是顺销。
13. 如权利要求12的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
14. 如权利要求1的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特异性地W癌症细胞为目标。
15. 如权利要求14的方法，其中，所述比-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞的表面 上的p53胜肤/HLA络合物为目标。
16. -种减少受试者的肿瘤负担的方法，包括： 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此减少所述肿瘤的体积。
17. 如权利要求16的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特异性地W所述癌症为目标或 结合所述癌症。
18. 如权利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T细胞受体（TCR)结构域。
19. 如权利要求18的方法，其中，所述T细胞受体结构域是单链T细胞受体。
20. 如权利要求16的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由下列各者所组成群 组；己酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯达莫司 汀、贝伐单抗、舊萨罗了、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯横酷胺、博来霉素、棚替佐米、N, N-二甲基-L-鄉氨酷基-L-鄉氨酷基-N-甲基-L-鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、恶病质素、卡培拉滨、西马多了、西妥昔 单抗、瘤可宁、环磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -诺文-长春碱、多西他赛、多締 紫杉醇、环磯酷胺、卡销、卡莫司汀炬CNU)，顺销、念珠藻环肤、环磯酷胺、阿糖胞巧、达卡己 嗦值TIC)、更生霉素、达沙替巧、柔红霉素、多拉斯他了、多韦替巧、多柔比星（阿霉素）、表 阿霉素、埃坡霉素B，埃罗替巧，艾瑞布尔、依托泊巧、依维莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、 氣他胺，吉非替巧、吉西他滨、哲基脈W及哲基脈紫杉烧类、宜佛斯酷胺，干扰素a、伊马 替巧、伊匹单抗、依利诺替康、拉钩它索、拉帕替巧、来那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧达明、 洛莫司汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法仑、哲己基横酸米伏布尔、利索新、什汀巧 夫、链脈霉素、丝裂霉素、甲氨蝶岭，5-氣尿喀晚、巧鲁米特、奥那司酬、草酸销、他克挫、帕 巧单抗、帕挫帕巧、普拉曲沙、泼巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚，利妥昔单抗、 RPR109881、罗米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索尔明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、S甲曲沙、威罗菲巧、长春花碱、长春新碱，硫酸长 春地辛、长春氣宁W及伏立诺他。
21. 如权利要求16的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由吉西他滨和包含顺 销的W销为主的化合物所组成群组。
22. 如权利要求16的方法，其中，所述肿瘤负担是选自由膀脱癌、尿道、输尿管W及肾 孟的尿道上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经 胶母细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜脏癌W及 胃癌所组成群组。
23. 如权利要求16的方法，其中，所述肿瘤负担是膀脱或尿道上皮细胞癌。
24. 如权利要求16的方法，其中，所述肿瘤负担有化学抗性。
25. 如权利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在7 至14天内给药。
26. 如权利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 3至5天内给药，或同时给药。
27. 如权利要求16的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是吉西他滨和顺销。
28. 如权利要求27的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
29. 如权利要求16的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞为目标。
30. 如权利要求29的方法，其中，所述比-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞的表面 上的p53胜肤/HLA络合物为目标。
31. -种治疗受试者的化学抗性癌症的方法，包括： 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此治疗所述化学抗性癌 症。
32. 如权利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白不特异性地W所述癌症为目标或 结合所述癌症。
33. 如权利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T细胞受体（TCR)结构域。
34. 如权利要求33的方法，其中，所述T细胞受体结构域是单链T细胞受体。
35. 如权利要求31的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由下述各者所组成群 组；己酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯达莫司 汀、贝伐单抗、舊萨罗了、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯横酷胺、博来霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、恶病质素、卡培拉滨、西马多了、西妥昔 单抗、瘤可宁、环磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -诺文-长春碱、多西他赛、多締 紫杉醇、环磯酷胺、卡销、卡莫司汀炬CNU)，顺销、念珠藻环肤、环磯酷胺、阿糖胞巧、达卡己 嗦值TIC)、更生霉素、达沙替巧、柔红霉素、多拉斯他了、多韦替巧、多柔比星（阿霉素）、 表阿霉素、埃坡霉素B、埃罗替巧、艾瑞布尔、依托泊巧、依维莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、 氣他胺、吉非替巧、吉西他滨、哲基脈W及哲基脈紫杉烧类、宜佛斯酷胺、干扰素a、伊马替 巧、伊匹单抗、依利诺替康、拉钩它索、拉帕替巧、来那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧达明、洛 莫司汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法仑、哲己基横酸米伏布尔、利索新、什汀巧 夫、链脈霉素、丝裂霉素、甲氨蝶岭、5-氣尿喀晚、巧鲁米特、奥那司酬、草酸销、他克挫、帕 巧单抗，帕挫帕巧、普拉曲沙、泼巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐P丫晚、利妥昔单抗、 RPR109881、罗米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索尔明、紫杉醇、替 莫挫胺、拓扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、立甲曲沙、威罗菲巧、长春花碱、长春新碱、硫酸长 春地辛、长春氣宁W及伏立诺他。
36. 如权利要求31的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由吉西他滨和包含顺 销的W销为主的化合物所组成群组。
37. 如权利要求31的方法，其中，所述癌症是选自由膀脱癌、尿道、输尿管W及肾孟的 尿道上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母 细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜脏癌W及胃癌 所组成群组。
38. 如权利要求31的方法，其中，所述癌症是膀脱或尿道上皮细胞癌。
39. 如权利要求31的方法，其中，所述癌症有化学抗性。
40. 如权利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 7至14天内给药。
41. 如权利要求31的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 3至5天内给药，或同时给药。
42. 如权利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是顺销。
43. 如权利要求42的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
44. 如权利要求31的方法，其中，所述比-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞为目标。
45. 如权利要求44的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞的表面 上的p53胜肤/HLA络合物为目标。
46. -种在受试者中诱发针对癌症的耐久性免疫记忆反应的方法，包括： 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此诱发针对癌症的耐久 性免疫记忆反应。
47. 如权利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白不特异性地W所述癌症为目标或 结合所述癌症。
48. 如权利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白包括T细胞受体（TCR)结构域。
49. 如权利要求48的方法，其中，所述T细胞受体结构域是单链T细胞受体。
50. 如权利要求46的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由下列各者所组成群 组；己酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯达莫司 汀、贝伐单抗、舊萨罗了、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯横酷胺、博来霉素、棚替佐米、N, N-二甲基-L-鄉氨酷基-L-鄉氨酷基-N-甲基-L-鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、恶病质素、卡培拉滨、西马多了、西妥昔 单抗、瘤可宁、环磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -诺文-长春碱、多西他赛、多締紫 杉醇、环磯酷胺、卡销、卡莫司汀炬CNU)、顺销、念珠藻环肤、环磯酷胺、阿糖胞巧、达卡己嗦 (DTIC)、更生霉素、达沙替巧、柔红霉素、多拉斯他了、多韦替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B、埃罗替巧、艾瑞布尔、依托泊巧，依维莫司，5-氣尿喀晚，非那利得，氣他 胺、吉非替巧、吉西他滨、哲基脈W及哲基脈紫杉烧类、宜佛斯酷胺、干扰素a、伊马替巧、伊 匹单抗、依利诺替康、拉钩它索、拉帕替巧、来那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧达明、洛莫司 汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法仑、哲己基横酸米伏布尔、利索新、什汀巧夫、链脈 霉素、丝裂霉素、甲氨蝶岭、5-氣尿喀晚、巧鲁米特、奥那司酬、草酸销、他克挫、帕巧单抗、帕 挫帕巧、普拉曲沙、泼巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔单抗、RPR109881、 罗米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索尔明、紫杉醇、替莫挫胺，拓 扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、=甲曲沙、威罗菲巧、长春花碱、长春新碱、硫酸长春地辛、长 春氣宁W及伏立诺他。
51. 如权利要求46的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由吉西他滨和包含顺 销的W销为主的化合物所组成群组。
52. 如权利要求46的方法，其中，所述癌是选自由膀脱癌、尿道、输尿管W及肾孟的尿 道上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母细 胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜脏癌W及胃癌所 组成群组。
53. 如权利要求46的方法，其中，所述癌症是膀脱或尿道上皮细胞癌。
54. 如权利要求46的方法，其中，所述癌症有化学抗性。
55. 如权利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 7至14天内给药。
56. 如权利要求46的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 3至5天内给药，或同时给药。
57. 如权利要求46的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是顺销。
58. 如权利要求57的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
59. 如权利要求46的方法，其中，所述比-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞为目标。
60. 如权利要求59的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞的表面 上的p53胜肤/HLA络合物为目标。
61. -种增加具有癌症的受试者的存活的方法，包括： 对有需要的受试者给药有效量的IL-2融合蛋白和治疗剂，藉此增加所述受试者的存 活。
62. 如权利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白不特异性地W所述癌症为目标或 结合所述癌症。
63. 如权利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白包括T细胞受体灯CR)结构域。
64. 如权利要求63的方法，其中，所述T细胞受体结构域是单链T细胞受体。
65. 如权利要求61的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由下列各者所组成群 组；己酸阿比特龙、六甲密胺、脱水长春花碱、欧瑞斯他汀、阿扎胞巧、AZD 8477、苯达莫司 汀、贝伐单抗、舊萨罗了、比卡鲁胺、BMS184476、2, 3, 4, 5, 6-五氣-N-(3-氣-4-甲氧基苯 基）苯横酷胺、博来霉素、棚替佐米、N，N-二甲基鄉氨酷基鄉氨酷基-N-甲基-k鄉 氨酷基脯氨酷基-1-L脯氨酸-第S了基酷胺、恶病质素、卡培拉滨、西马多了、西妥昔 单抗、瘤可宁，环磯酷胺、3'，4' -二去氨-4' -二氧基-8' -诺文-长春碱、多西他赛、多締紫 杉醇、环磯酷胺、卡销、卡莫司汀炬CNU)、顺销、念珠藻环肤、环磯酷胺、阿糖胞巧、达卡己嗦 (DTIC)、更生霉素，达沙替巧、柔红霉素、多拉斯他了、多韦替巧、多柔比星（阿霉素）、表阿 霉素、埃坡霉素B，埃罗替巧、艾瑞布尔、依托泊巧、依维莫司、5-氣尿喀晚、非那利得、氣他 胺、吉非替巧、吉西他滨、哲基脈W及哲基脈紫杉烧类、宜佛斯酷胺、干扰素a、伊马替巧、伊 匹单抗、依利诺替康、拉钩它索、拉帕替巧、来那度胺、利阿挫、洛那法巧、氯巧达明、洛莫司 汀（CCNU)、二氯甲基二己胺（氮芥）、美法仑、哲己基横酸米伏布尔、利索新、什汀巧夫、链脈 霉素、丝裂霉素、甲氨蝶岭、5-氣尿喀晚、巧鲁米特、奥那司酬、草酸销、他克挫、帕巧单抗、帕 挫帕巧、普拉曲沙、泼巧莫司汀、化曲克辛、丙卡己阱、化挫咐町晚、利妥昔单抗、RPR109881、 罗米地辛、索拉非巧、磯酸雌莫司汀、舒巧替巧、它莫西芬、他索尔明、紫杉醇、替莫挫胺、拓 扑替康、曲妥珠单抗、维A酸、=甲曲沙、威罗菲巧、长春花碱、长春新碱、硫酸长春地辛、长 春氣宁W及伏立诺他。
66. 如权利要求61的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是选自由吉西他滨和包含顺 销的W销为主的化合物所组成群组。
67. 如权利要求61的方法，其中，所述癌症是选自由膀脱癌、尿道、输尿管W及肾孟的 尿道上皮细胞癌、多发性骨髓瘤、肾脏癌、乳癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、前列腺癌、神经胶母 细胞瘤、骨肉瘤、脂肪肉瘤、软组织肉瘤、卵巢癌、黑色素瘤、肝癌、食道癌、膜脏癌w及胃癌 所组成群组。
68. 如权利要求61的方法，其中，所述癌症是膀脱或尿道上皮细胞癌。
69. 如权利要求61的方法，其中，所述癌症有化学抗性。
70. 如权利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 7至14天内给药。
71. 如权利要求61的方法，其中，所述IL-2融合蛋白和所述一种或多种治疗剂是在约 3至5天内给药，或同时给药。
72. 如权利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是顺销。
73. 如权利要求72的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
74. 如权利要求61的方法，其中，所述比-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞为目标。
75. 如权利要求74的方法，其中，所述IL-2融合蛋白特异性地W所述癌症细胞的表面 上的p53胜肤/HLA络合物为目标。
76. -种治疗膀脱癌的套组，包括IL-2融合蛋白和一种或多种治疗剂。
77. 如权利要求76的方法，其中，所述比-2融合蛋白是ALT-801，而且所述一种或多种 治疗剂是顺销。
78. 如权利要求77的方法，其中，所述一种或多种治疗剂是吉西他滨。
【文档编号】A61K38/20GK104470535SQ201380028390
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年3月15日 优先权日:2012年3月29日
【发明者】J·闻, W·徐, P·罗德, H·C·黄 申请人:阿尔托生物科学有限公司