经改良的抗gdf-8的拮抗剂抗体及其用途

经改良的抗gdf-8的拮抗剂抗体及其用途
【专利摘要】本发明提供经改良的中和性抗GDF-8抗体，其能在宿主细胞中以显著高于先前抗GDF-8抗体的水平表达。本发明还提供使用包含这些抗体的组合物增加肌肉质量或强度及治疗或预防肌肉病症、神经肌肉病症、代谢紊乱、脂肪组织病症或骨病的方法。PTA-1298020120614PTA-1298120120614
【专利说明】经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2012年6月15日申请的美国临时申请第61/660, 232号的权益，所述 申请的内容以引用方式全文并入本文中。
[0003] 序列表引用
[0004] 在37CFR § 1. 821下以计算机可读取形式（CRF)经由EFS-Web以文件名PC071914_ SEQLIST_ST25. txt同时提交的序列表以引用方式并入本文中。序列表的电子副本于2013 年5月14日创建，文件大小为71KB。
[0005] 生物保藏
[0006] 本发明的代表性材料于2012年6月14日保藏于美国典型培养物保藏中心 (American Type Culture Collection，"ATCC，'），学院大道（University Boulevard) 10801 号，马纳萨斯，VA 20110-2209,美国。具有ATCC登录号PTA-12980的载体0GD1.0. O-HC是 编码OGDL 0. 0重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-12981的载体OGDL 0. O-LC 是编码OGDL 0. 0轻链可变区的多核苷酸。
[0007] 保藏物在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其下条例（"布达 佩斯条约"）的规定下制备。这保证可将保藏物的活培养物自保藏的日起维持30年。根据 布达佩斯条约条款将使保藏物可由ATCC获得且使其遵守Pf izer公司与ATCC之间的协议， 其保证公众可基于相关美国专利的发布或基于向公众公开任何美国或外国专利申请（以 先达到者为准）永久且不受限制地获得保藏培养物的后代，且保证由美国专利商标局根据 35U. S. C. § 122和依据35U. S. C. § 122的委员会规则（包括37CFR § L 14,尤其参照886 OG 638)确定授权者可获得所述后代。
[0008] 本申请的专利权人已同意，若所保藏材料的培养物当在适宜条件下培养时死亡或 丢失或被破坏，则将迅速更换所述材料的另一培养物并作出通知。所保藏材料的可获得性 不应视为允许在违反任何政府机关根据其专利法授予的权利的情况下实践本发明。

【背景技术】
[0009] 生长分化因子-8(⑶F-8)也称作肌肉生长抑制素（myostatin)，是分泌蛋白及结 构相关生长因子的转化生长因子-β (TGF-β)超家族的成员。该超家族的成员具有生长 调节及形态发生性质（Kingsley 等人（1994) Genes Dev. 8:133-46 ;Hoodless 等人（1998) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 228:235-72)。人类⑶F-8 是以 375 个氨基酸的前体蛋白 质来合成，其形成同型二聚体复合体。在处理期间，称为"阴性相关肽"(LAP)的氨基末端前 肽被切割且可与所述同型二聚体保持非共价结合，从而形成名为"小潜伏复合体"的无活性 复合体（Miyazono 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:6407-15 ;Wakefield 等人（1988) J. Biol. Chem. 263:7646-54 ;Brown 等人（1999) Growth Factors3:35-43 ;Thies 等人（2001) Growth Factors 18:251-59 ;Gentry 等人（1990)Biochemistry 29:6851-57 ;Derynck 等人（1995) Nature 316:701-05 ;Massague(1990)Ann. Rev. Cell Biol. 12:597-641)。诸如促滤泡素抑 制素（follistatin)及其相关物的蛋白质也结合成熟⑶F-8同型二聚体且抑制⑶F-8生物 活性（Gamer 等人（1999) Dev. Biol. 208:222-32)。
[0010] 来自不同物种的推断⑶F-8氨基酸序列的比对显示，⑶F-8非常保守（McPherron 等人（1997)Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 94:12457-61)。人类、小鼠、大鼠、猪及鸡⑶F-8 的 序列在C末端区100%相同，而狒狒、牛及羊⑶F-8在C末端处仅相差3个氨基酸。⑶F-8 在物种之间的高保守度表明，GDF-8具有必需的生理功能。
[0011] 已显示⑶F-8可通过抑制成肌细胞及卫星细胞的增殖及分化在肌肉发育调节 及体内稳态中起重要作用（Lee and McPherron(1999)Curr.0pin.Genet.Dev.9:604_07; McCroskery等人（2003) J. Cell. Biol. 162:1135-47)。其早期在发育中的骨骼肌中表达，且 继续在成年骨骼肌中表达，优先在快缩类型中表达。另外，在成年小鼠中过表达的⑶F-8造 成显著肌肉损失（Zimmers等人（2002)Science 296:1486-88)。同样，已显不使GDF-8基因 无活性的天然突变在动物及人类中可引起肥大及增生（Lee及McPherron (1997),见上文）。 例如，GDF-8敲除转基因小鼠的特征在于骨骼肌的显著肥大及增生以及改变的骨皮质结构 (McPherron 等人（1997)Nature387:83_90;Hamrick 等人（2000)Bone 27:343-49)。在天 然⑶F-8突变的牛中显现类似的骨骼肌质量增加（Ashmore等人（1974) Growth 38:501-07 ; Swatland 等人（1994) J. Anim. Sci. 38:752-57 ;McPherron 等人，见上文；Kambadur 等人 (1997)Genome Res. 7:910-15)。另外，不同研究显示，增加的⑶F-8表达与HIV诱导的肌 肉耗损有关（Gonzalez-Cadavid 等人（1998)Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A. 95:14938-43)。 也已显示⑶F-8参与肌肉特异性酶（例如，肌酸激酶）的产生及成肌细胞增殖（W0 00/43781)。
[0012] 除了其生长调节及形态发生性质以外，⑶F-8据信参与多种其它生理过程，包括在 2型糖尿病发展期间的葡萄糖体内稳态、葡萄糖耐量降低、代谢综合征（即，例如综合征X的 综合征，其涉及同时发生一组健康状况，所述状况可包括胰岛素抵抗、腹部肥胖症、血脂异 常、高血压、慢性炎症、趋血栓阻塞性状态等，其使个人具有2型糖尿病和/或心脏病的高风 险）、胰岛素抵抗（例如，由诸如创伤或氮失调症等创伤诱导的抗性）及脂肪组织病症（例 如，肥胖症、血脂异常、非酒精性脂肪肝疾病等）（Kim等人（2000)Biochem. Biophys. Res. Comm. 281:902-06)〇
[0013] 多种人类及动物病症与肌肉组织功能受损有关，例如，肌萎缩侧索硬化症 ("ALS")、肌营养不良（"MD";包括杜兴肌营养不良（Duchenne，s muscular dystrophy))、 肌萎缩、器官萎缩、衰弱症、充血阻塞性肺病（COPD)、少肌症、恶病质及由其它疾病及状况引 起的肌肉耗损综合征。目前，几乎没有可靠或有效的疗法可治疗这些病症。这些疾病的病 理表明GDF-8信号传导在这些疾病的治疗中作为靶的潜在作用。
[0014] ALS是迟发且致死的神经变性疾病，其特征在于中枢神经系统变性及肌萎缩。ALS 通常始于步态异常及灵活性损失，然后进展至肢体及膈膜瘫痪。尽管大多数ALS病例是散 发性的且病因未知，但已显示5-10%病例源自显性家族性（FALS)遗传。约10-20%的FALS 病例归因于Cu/Zn超氧化物歧化酶（S0D1)基因中的突变（综述于Bruijn等人（2004) Ann. Rev. Neurosci. 27:723-49中）。SODl是催化超氧化物变为过氧化氢及双原子氧的反应的异 二聚金属-蛋白质，且由于SODl的损失不引起运动神经元疾病（Reaume等人（1996)Nat. Genet. 13:43-47)，人们相信毒性功能获得可诱导疾病（综述于Brui jn等人，见上文）。SODl 诱导的神经元细胞死亡的具体机制尚未明了，且可能涉及轴突运输的改变、对错误折叠蛋 白质的细胞反应、线粒体功能失调及兴奋性神经毒性（Bruijn等人，见上文）。
[0015] 在ALS中观察到的运动神经元变性可经由多种机制发生，包括运动神经元破坏 营养因子的摄取或运输（综述于Holzbaur(2004)Trends Cell Biol. 14:233-40中）。因 此，ALS可用通过提供最佳存活环境来使变性神经元恢复活力的疗法来治疗。神经环境包 括诸如神经胶质及肌肉细胞等受运动神经元支配的非神经元细胞。此环境提供由神经元 内吞并经由逆行轴突运输运输至细胞体的营养及生长因子（Chao(2003)Neuron 39:1-2; Holzbaur，见上文）。
[0016] FALS已通过突变体SODl的过表达在小鼠及大鼠二者中建模（Howland等人 (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 99:1604-09)。过表达突变体 SODl 的 G93A 形式的转基 因小鼠截至90至100日龄时显示肌肉无力及萎缩，且通常在接近130日龄时死亡（Gurney 等人（1994) Science 264:1772-75)。然而，潜在的S0DG93A诱导的病理（其包括握力减弱 及神经肌肉接点损失）早在50日龄时即显著（Frey等人（2000) J. Neurosci. 20:2534-42 ; Fisher 等人（2004)Exp. Neuro. 185:232-40 ;Ligon 等人（2005)NeuroReport 16:533-36 ; Wooley等人（2005)Muscle Nerve 32:43-50)。表达S0DG93A突变的转基因大鼠遵循类似 的变性时程（Howland等人，见上文）。近期研究已表明，病理的发展并非细胞自主性，此与 以下假设相同：在ALS中观察到的运动神经元变性经由多种机制而发生，包括运动神经元 破坏营养因子的摄取及运输（见上文）。Clement及合作者使用嵌合小鼠显示，野生型非 神经元细胞可延长表达突变体SODl的运动神经元的存活（Clement等人（2003) Science 302:113-17)。这些观察已促使人们研究可能通过提供最佳存活微环境来减慢神经元变性 的疗法。例如，经由直接肌内注射病毒表达的生长因子（包括IGF-1、⑶NF及VEGF)治疗 S0DG93A 小鼠延长动物存活（Kaspar 等人（2003) Science301:839-42 ;Azzouz 等人（2004) Nature 429:413-17 ;Wang 等人（2002) J.Neurosci. 22:6920-28)。另外，在 S0DG93A 转基因 小鼠模型中，局部IGF-I特异性同种型（mIGF-1)的肌肉特异性表达稳定神经肌肉接点，促 进运动神经元存活且延迟疾病的发作及进展，表明在转基因 SODl动物中，对肌肉的直接效 应可影响疾病发作及进展（Dobrowolny等人（2005) J. Cell Biol. 168:193-99)。也已在ALS 小鼠中报导肌肉高代谢与运动神经元易损性之间的关联，从而支持肌肉缺陷可促进疾病病 因的假设（Dupois 等人（2004) Proc. Natl. Acad Sci. U. S. A. 101:11159-64)。因此，促进肌 肉生长应可改良对运动神经元的局部支持，并因此产生治疗益处。
[0017] 抑制肌肉生长抑制素表达导致肌肉肥大及增生（Lee及McPherron，见上文； McPherron等人，见上文）。肌肉生长抑制素负向调节损伤后的肌肉再生，且在⑶F-8无 效小鼠中，缺少肌肉生长抑制素导致肌肉再生加速（McCroskery等人，（2005) J. Cell. Sci. 118:3531-41)。肌肉生长抑制素中和抗体增加野生型小鼠（Whittemore等人（2003) Biochem. Biophys. Res. Commun. 300:965-71)及 mdx 小鼠（肌营养不良模型，Bogdanovich 等人（2002)Nature420:418-21 ;Wagner 等人（2002)Ann. Neurol. 52:832-36)的体重、骨骼 肌质量以及骨骼肌的肌肉大小及强度。此外，在这些小鼠中，肌肉生长抑制素抗体降低对膈 膜（在ALS发病期间也被靶向的肌肉）的损伤。有假设诸如HGF等生长因子对肌肉的作用 可以是由于抑制肌肉生长抑制素表达所致（McCroskery等人（2005)，见上文），由此帮助 向上移动再生与变性之间的"推拉（push and pull)"或平衡。因此，⑶F-8抑制作为治疗 ALS、肌营养不良（MD)及其它期望增加肌肉质量、强度、大小等的GDF-8相关病症（例如神 经肌肉病症）的潜在药理学靶存在。由于可获得ALS的多种动物模型（小鼠及大鼠），可在 两种不同物种中测试治疗剂，由此提高人类体内治疗效果的可信度。
[0018] 除了人类的神经肌肉病症以外，还存在与骨丢失相关的生长因子相关状况，例如 骨质疏松和骨关节炎，其主要影响老人和/或停经后女性。另外，代谢性骨疾病及病症包括 由于长期糖皮质素疗法、性腺早衰、雄激素抑制、维生素 D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、 营养缺乏及神经性厌食症所致的低骨量。尽管这些状况的多种当前疗法通过抑制骨再吸收 来发挥作用，但促进骨形成的疗法可以是有用的替代性治疗。由于GDF-8在骨发育以及肌 肉发育中起作用，GDF-8的调节也是治疗骨变性病症的极佳药理学靶。
[0019] 除了其他生物效应，特异性拮抗GDF-8的鼠类单克隆抗体先前描述为在ALS的 哨齿动物模型中增加肌肉质量及强度（Holzbaur, EL等人，Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis, Neurobiology of Disease (2006) 23 (3) :697-707)。因此预期在ALS患者以及在受其它特征为过量⑶F-8 或由其介导的疾病及病症（例如上述的那些）影响的患者中，小鼠抗体及其人源化对应体 可有效增加肌肉质量及强度。
[0020] 上文所提及的人源化版本的小鼠抗GDF-8抗体（如多种单克隆抗体及其它基于蛋 白质的治疗剂）的制造困难且昂贵，因其制造通常需要在活哺乳动物细胞中进行生产。因 此，提高该抗体或其它具有类似特异性的抗体的产率允许以较少投入产生等量活性药物。 这将具有双重益处，即在降低制造成本的同时释放有限的制造设施用于生产其它生物药 物。两种益处均都会促进达成提高治疗性抗⑶F-8抗体以及其它生物制剂对于患者的可用 性的目标。因此，本领域需要在哺乳动物细胞中具有较高产率的抗GDF-8抗体的改良形式。


【发明内容】

[0021] 本发明提供人源化抗GDF-8抗体或其抗原结合片段，其能以与共享相同互补决定 区（⑶R)的这些抗体的先前形式相比较高的水平在宿主细胞中表达。还提供用于本发明方 法中的包含这些抗体的组合物。
[0022] 在某些实施方案中，这些抗体具有重链可变（VH)区，其中⑶Rl由氨基酸序列SEQ ID NO: 10 或 SEQ ID NO: 20 限定，CDR2 由氨基酸序列 SEQ ID NO: 11 或 SEQ ID NO: 21 限定， ⑶R3由氨基酸序列SEQ ID NO: 12限定，且其中VH区经修饰以使得在Kabat位置108的氨 基酸是亮氨酸而非甲硫氨酸。在其它实施方案中，这些抗体具有包含相同⑶R的VH区，且 其中VH区的第四框架区包含SEQ ID N0:44的氨基酸106-116。在这些抗体的其它实施方 案中，CDR接枝至人类生殖细胞VH基因区段DP-47上然后与JH4人类重链J区段基因连接。 在其它实施方案中，这些抗体的VH区包含氨基酸序列SEQ ID N0:44。
[0023] 在Kabat位置108具有亮氨酸的本发明抗体（例如上文所例示的那些）的特征在 于表达水平与在相同位置存在甲硫氨酸的形式相比有所提高。在某些实施方案中，前一形 式在类似条件下的表达水平比后一形式高大于约50 %、100 %、150 %、200 %、250 %、300 %、 400 %、500 %、600 %、700 %、800 %、900 %、1000 %、1200 %、1400 %、1600 %、1800 % 或甚至 2000%的量。
[0024] 根据本发明抗体的其它实施方案，前一段落中描述的VH区可与轻链可变（VL)区 配对，在所述轻链可变（VL)区中⑶Rl由氨基酸序列SEQ ID NO: 13限定，⑶R2由氨基酸 序列SEQ ID NO: 14限定，CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO: 15限定，且其中VL区中Kabat位 置100的氨基酸是甘氨酸或谷氨酰胺。在其它实施方案中，VH区与VL区配对，在所述VL 区中轻链CDR接枝至人类生殖细胞VL基因区段DPK-9然后与JK4人类轻链J区段基因连 接。根据这些抗体的一些其它实施方案，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区具有先 前所述的VL区CDR且其中VL区的第四框架区包含SEQ ID N0:9或SEQ ID N0:46的氨基 酸98-107。在其它实施方案中，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区包含氨基酸序列 SEQ ID NO:9 或 SEQ ID NO:46。
[0025] 在一些其它实施方案中，上文所述VH区连接至来自人类抗体亚型（包括IgA、IgG、 IgD、IgE或IgM)的重链恒定区。如果重链恒定区来自IgG，则在其它实施方案中，抗体重链 恒定区来自IgGl、IgG2、IgG3或IgG4的IgG亚型。重链恒定区可经修饰以例如消除一或多 种Fc结构域效应子功能，如SEQ ID NO: 57中所例示。在其它实施方案中，上文所述VL区 连接至可以具有λ或κ亚型的轻链恒定区。
[0026] 根据其它实施方案，SEQ ID NO: 44的VH区与氨基酸序列SEQ ID NO: 57的经修饰 重链区连接以产生氨基酸序列SEQ ID N0:58的全长抗体重链。相反，在其它实施方案中， SEQ ID N0:46的VL区可与氨基酸序列SEQ ID NO: 17的κ恒定轻链连接以产生氨基酸序列 SEQ ID N0:59的全长抗体轻链。在其它实施方案中，每一全长抗体重链和轻链的两个继而 可组合以产生具有两个抗原结合位点的抗⑶F-8抗体。在其它实施方案中，抗体可包含这 些全长大小的完整抗体的片段或衍生物，包括例如Fab、F(ab'） 2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、 scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。
[0027] 本发明抗体可对⑶F-8具有一定范围的结合亲和性，例如约5000nM或甚至更高， 例如至少约 4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、 300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、 6ηΜ、5ηΜ、4ηΜ、3ηΜ、2ηΜ、1ηΜ、0· 1ηΜ、0· OlnM 或 0· OOlnM。
[0028] 本发明还提供编码抗⑶F-8抗体的核酸，以及包含这些核酸序列的表达载体，以 及用于表达这些抗体的宿主细胞。
[0029] 本发明还提供用于治疗或预防患者中特征为肌肉质量或强度减小的肌肉病症的 方法。这些方法通过向需要治疗或预防这些病症的患者施用治疗或预防有效量的包含特异 性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段的组合物来实施。用于这些方法的抗体包括上文及 本发明全文中描述的那些抗体。
[0030] 根据某些实施方案，本发明抗体组合物可以治疗或预防有效量施用给需要治疗或 预防肌肉病症的患者，所述肌肉病症包括选自以下的病症：肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶 病质、肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。在其它实施方案中，肌 肉病症是由癌症引起的恶病质。在其它实施方案中，肌肉病症是杜兴肌营养不良。在后一 情况的某些实施方案中，施用抗GDF-8抗体可有效改良患者在6分钟步行测试中的表现。
[0031] 在一些实施方案中，通过在有效治疗肌营养不良的另一药剂之前、同时或之后施 用包含本发明抗体的组合物还可用于治疗患有肌营养不良（例如杜兴肌营养不良）的患 者。在某些实施方案中，该药剂是糖皮质素，例如强的松（prednisone)。
[0032] 还提供通过以有效增加哺乳动物的肌肉质量或强度的量向哺乳动物施用包含本 发明抗GDF-8抗体的组合物来增加哺乳动物的肌肉质量或强度的方法。在多个实施方案 中，肌肉是骨骼肌（包括一或多种在呼吸中发挥作用的骨骼肌）或心肌。
[0033] 还提供通过向需要治疗或预防神经肌肉病症的对象施用治疗或预防有效量的本 发明抗GDF-8抗体来治疗或预防神经肌肉病症的方法。在某些实施方案中，欲治疗或预防 的神经肌肉病症是ALS。
[0034] 还提供通过向需要治疗或预防代谢紊乱的对象施用治疗或预防有效量的本发明 抗GDF-8抗体来治疗或预防代谢紊乱的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防的代谢紊 乱包括2型糖尿病、代谢综合征、综合征X、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
[0035] 还提供通过向需要治疗或预防脂肪组织病症的对象施用治疗或预防有效量的本 发明抗GDF-8抗体来治疗或预防脂肪组织病症的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防 的脂肪组织病症包括肥胖症及异常高身体质量指数。
[0036] 还提供通过向需要治疗或预防骨丢失病症的对象施用治疗或预防有效量的本发 明抗GDF-8抗体来治疗或预防骨丢失病症的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防的骨 丢失病症包括骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨质疏松相关性骨折。
[0037] 在一些其它实施方案中，可用于本发明方法中的抗⑶F-8抗体包括与有用地改变 其功能或特征（例如，但不限于增加血清半衰期）的部分缀合的抗体。在其它实施方案中， 可出于类似目的或其它目的来实现氨基酸变化。
[0038] 用于本发明方法中的抗体组合物可制备为不同剂型，包括但不限于水性悬浮液， 用于通过多种途径施用，这些途径包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内 施用、输注施用或推注施用。
[0039] 在一些实施方案中，本发明抗⑶F-8抗体的有效剂量在0. 001mg/kg至约250mg/kg 范围内，其可在一次施用中或在多次间隔施用中给予。
[0040] 本发明还提供由临床医师及其他人员用于帮助将抗⑶F-8抗体组合物施用给患 者的药物试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括冻干形式或水溶液的本发明抗GDF-8抗 体、稀释剂（例如药物级水或缓冲液）及用于施用抗前胃泌素抗体的装置（例如注射器及 针）。在其它实施方案中，试剂盒可另外包括第二治疗剂。
[0041] 附图简要说明
[0042] 图IA提供来自某些本发明抗⑶F-8抗体的VH区的氨基酸序列的比对，这些VH区 包括鼠类抗体VH区及通过将鼠类重链CDR接枝至人类生殖细胞系VH区DP-47中产生的两 个人源化抗体VH区（即，VHO和VH1)。另外提供进一步人源化VH区VH2-VH5的氨基酸序 列的比对。重链⑶R的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置108的 氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
[0043] 图IB提供来自某些本发明抗⑶F-8抗体的VL区的氨基酸序列的比对，这些VL区 包括鼠类抗体VL区及通过将鼠类轻链CDR接枝至人类生殖细胞系VL区DPK-9中产生的两 种人源化抗体VL区（S卩，VLO和VL1)。另外提供进一步人源化VL区VL2-VL5的氨基酸序 列的比对。轻链⑶R的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置100的 氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
[0044] 图2A提供显示来自经10mg/kg OGDL 0. 0抗体治疗两周的C57B1/6小鼠的腓肠肌 (GAS)及四头肌（QUAD)质量与媒介物对照相比的增加的图表。图2B以经OGDL 0. 0抗体治 疗的小鼠的肌肉质量相对于对照的增加百分比报告图2A中的相同数据。图2B另外显示来 自同组抗体治疗小鼠及对照小鼠的趾长伸肌（EDL)的肌肉质量的增加百分比。
[0045] 图3提供显示由来自经10mg/kg OGDL 0· 0抗体治疗两周的C57B1/6小鼠的EDL 肌肉生成的总强直性张力与媒介物对照相比的增加的图表。
[0046] 图4A提供显示来自经PBS媒介物和0.3、1、3、10及30mg/kg 0GD1.0.0抗体每周 一次治疗4周的C57B1/6小鼠的腓肠肌（Gastroc)及四头肌（Quad)质量的剂量反应性增 加的图表。数据代表在4周结束时测量的肌肉质量。图4B以经OGDL 0.0抗体治疗的小鼠 的腓肠肌及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图4A中的相同数据。
[0047] 图54提供显示经？85媒介物和0.3、1、3、10及3011^/1^(?01.0.0抗体每周一次 治疗4周的C57B1/6小鼠的全身瘦肉质量（lean mass)的剂量反应性增加的图表。数据代 表在4周中每周结束时测量的瘦肉质量。图5B提供显示经PBS媒介物和0. 3、1、3、10及 30mg/kg OGDL 0. 0抗体每周一次治疗4周的C57B1/6小鼠在4周研究结束时全身瘦肉质量 的增加的图表。
[0048] 图6A提供显示经10mg/kg OGDL 0· 0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠的全身瘦 肉质量相对于施用PBS媒介物的对照mdx小鼠的增加的图表。图6B提供显示经10mg/kg OGDL 0. 0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠的最大峰值握力相对于施用PBS媒介物的对照 mdx小鼠的增加的图表。
[0049] 图7A提供显示来自经10mg/kg OGDL 0· 0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠及 C57B1/6小鼠的腓肠肌及四头肌质量相对于施用PBS媒介物的对照小鼠的增加的图表。数 据代表在8周结束时测量的肌肉质量。图7B以经OGDL 0. 0抗体治疗的mdx小鼠的腓肠肌 及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图7A中的相同数据。
[0050] 图8提供显示经0、3、10及30mg/kg OGDL 0.0抗体治疗的食蟹猴中全身瘦肉质量 及腿部瘦肉质量的剂量反应性增加的图表。
[0051] 图9提供显示经10mg/kg及30mg/kg 0GD1.0.0抗体治疗的食蟹猴的全身瘦肉质 量的增加在抗体治疗中断后仍持续数周的图表。
[0052] 图10A提供显示经10mg/kg及30mg/kg OGDL 0· 0抗体治疗8周的食蟹猴中覆盖 L3-L5椎骨的轴上肌体积相对于施用PBS媒介物的对照动物有所增加的图表。
[0053] 图11提供在4周的OGDL 0. 0抗体治疗之前及之后来自实例性动物对象的轴上肌 的3D呈像。
[0054] 图12A提供含有在本文中称作VHO的重链可变区的实例性抗⑶F-8抗体重链的氨 基酸序列。
[0055] 图12B提供含有在本文中称作VLO的轻链可变区的实例性抗GDF-8抗体轻链的氨 基酸序列。
[0056] 详细说明
[0057] 本发明提供人源化抗GDF-8抗体的改良形式，其能在细胞中以与所述抗体的先前 形式相比显著较高的水平表达。因此，预期本文所述抗⑶F-8抗体的改良形式与先前形式 相比能在相同投入下以更大量及更低商品成本来产生。本发明还描述使用改良抗体进行治 疗或预防的各种方法。因此，在某些实例性非限制性实施方案中，改良的抗GDF-8抗体可用 于治疗肌营养不良、恶病质及其它病症，其中增加对象的肌肉质量或强度预期产生治疗益 处。
[0058] 抗体结构及多样件
[0059] 如本文所用，术语抗体是指完整免疫球蛋白（Ig)或其任意抗原结合片段、部位 (part)或部分（portion)，并尤其涵盖任何包含完整或部分抗原结合位点且保留至少一定 抗原结合特异性的多肽。抗体还可以指衍生自完整抗体的抗原结合片段、部位或部分与另 一分子（包括不同抗体、来自Ig超家族的蛋白质或并非源于免疫系统的蛋白质或其它类型 的分子）的组合。这些抗体衍生物可包括非蛋白质性部分（portion)或部分（moiety)。
[0060] 抗原指能被抗体特异性结合的物质、蛋白质或其它。抗原可具有一个以上抗原决 定簇或表位，其是抗原中被抗体结合的部分。
[0061] 免疫球蛋白（Ig)是异四聚蛋白质，其包含两条各自约50kDa的重链及两条各自约 25kDa的轻链。每条链包含多个Ig结构域。自氨基末端开始，重链含有单一可变区（VH)， 根据Ig亚型，之后是三个或四个称作CHl、CH2、CH3及（在存在时）CH4的恒定区。类似地， 在轻链中，单一可变区（VL)位于多肽的氨基末端，之后是单一恒定区（CL)。在CHl与CH2 区之间是长度可变的铰链区，根据同种型，其给予分子挠性。CHl的重链羧基末端（包括铰 链）、CH2、CH3及（在存在时）CH4构成Fc区。每一可变区或恒定区包含单一 Ig结构域。
[0062] Ig轻链经由二硫键结合至Ig重链，且Ig重链对经由二硫键彼此结合。非共价相 互作用还可有助于稳定重链和轻链之间及配对重链之间的链间四级结构。在完整Ig分子 中，配对重链和轻链的VH及VL区的位置彼此相邻且相互作用并合作形成抗原结合位点。因 为完整Ig分子含有两对配对重链和轻链，即总计两条重链及两条轻链，Ig分子含有两个抗 原结合位点。铰链区的存在使抗原结合位点与分子的其余部分之间具有挠性。
[0063] 重链和轻链恒定区不直接参与抗原识别。然而，重链尤其Fc区含有能与免疫系统 的效应子分子及细胞相互作用的序列，从而使得重链恒定区介导Ig分子的重要的生物学 功能。
[0064] 重链和轻链的可变区含有三个氨基酸差异性增强的间隔区域（称作超变区或互 补决定区（CDR))，其与CDR周围保守性更高的框架区（FR)相比在不同Ig分子之间广泛变 化。自可变区的氨基末端起，FR及⑶R的连续顺序和编号是FRl、⑶Rl、FR2、⑶R2、FR3、⑶R3 及FR4。框架区主要负责决定可变区Ig结构域的三级结构。与之相比，⑶R形成自每一可 变区向外延伸的环。相邻VH及VL区的CDR合作形成抗原结合表面，其主要负责限定具体 Ig分子的抗原结合特异性。
[0065] 研究抗体结构及功能的研究者已研发出不同方案来鉴别存于任何具体VH或VL区 的氨基酸序列内的重链和轻链CDR。这些方案中的多者根据与重链和轻链可变区的周围框 架相关的不变或几乎不变的模式鉴别CDR。然后使用对应于其组成残基在VH及VL区范围 内的位置的数字范围来限定CDR。因为CDR、尤其第三CDR的长度可变，方案有时还使用字 母来限定组成残基。第一种这些方案中的一个称为Kabat编号系统，其基于比对随后已知 的VH及VL序列以确定可变CDR子序列在保守性更高的框架区范围内的位置。用于限定 ⑶R的其它方案包括AbM编号系统及Chothia编号系统。其它方案也有可能。例如，可将 CDR限定为那些接触抗原的可变区残基，即使这些残基不完全符合CDR的更正式的限定（例 如 Kabat 或 Chothia 编号方案）。例如，参见 Y. Ofran 等人，Automated identification of complementarity determining regions (CDRs) reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell 印itopes, J Immunol. 2008 年 11月 I 日；181 (9) :6230-5,其以引用 方式并入。Kabat编号方案及某些其它抗体编号方案更详细地描述于（例如）Handb〇〇k of Therapeutic Antibodies (2007), Stefan Dubel 编辑，Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim，其以引用方式并入。
[0066] 重链和轻链可变区的CDR内的氨基酸接触抗原中的残基且主要负责限定抗体对 抗原的结合特异性。根据所研究的抗体-抗原对，所有或少于所有的CDR残基可直接接触 抗原。此外，某些接触可比其它接触更有助于限定特异性和/或亲和性。
[0067] 抗体及抗原中的接触残基的身份可使用X射线结晶学或其它本领域技术人员已 知的方法来测定。这些接触残基的突变通常（但并非总是）会对抗原结合特异性和/或亲 和性造成负面影响。相反，可能使非接触CDR残基以及FR残基突变且不显著影响抗原结合 特异性或亲和性。尽管预期保守氨基酸变化更可能保留抗原结合特异性及亲和性，但任何 具体CDR或框架突变的实际效果可使用本领域技术人员熟悉的技术根据经验来确定。
[0068] 尽管VH及VL区中通过其各自框架区支撑的⑶R通常负责建立抗原结合特异性及 亲和性，但可能有例外。例如，在某些Ig分子中，FR残基可能还有助于抗原结合，而在某些 其它Ig分子中，一或多个CDR可能不直接接触抗原。此外，在其它Ig分子中，分离VH区及 VL区的CDR即使在不存在通常会与其配对的相应可变区时还可具有显著的抗原结合特异 性。某些分离Ig分子可变区特异性结合抗原的能力类似于鲨鱼或骆驼抗体的抗原结合特 异性，这些抗体包含配对重链，但不包含轻链。
[0069] 某些物种的Ig分子可根据不同同种型来分类。例如，在人类中，Ig同种型包括 IgA、IgG、IgD、IgE及IgM。此外，IgA及IgG同种型可分类为多种亚型，其分别称作IgAl 及IgA2,以及IgGl、IgG2、IgG3及IgG4。同种型及亚型依照重链恒定区氨基酸序列的差异 来限定。因此，不同同种型及亚型能与不同免疫细胞上的不同效应子分子相互作用，由此产 生不同效应子功能。例如，IgA分子有助于黏膜免疫，而IgE分子有助于抗某些寄生虫的免 疫。IgM及IgE的重链含有四个串联排列的CH Ig结构域，其自氨基末端CH区开始编号为 CHI、CH2、CH3及CH4。然而，IgA、IgD及IgG仅含有三个串联排列的CH区。轻链恒定区包 含两个同种型（称作 K及λ)，其不具有已知生物学效应子功能。天然Ig分子将仅具有单 一轻链恒定区同种型。
[0070] 表达抗体重链和轻链的基因在活体内经由称为V(D)J重组的多次基因重排来构 建。此过程负责从位于基因组中的相当有限的基因序列库生成大型抗原结合蛋白质库。关 于此过程的更多信息描述于Abbas, A. Κ.、Lichtman, A. Η.及Pillai, S.，2010, Cellular and Molecular Immunology，第 6 版，第 8 章，Saunders, Philadelphia, PA 中，其全文以引用方 式并入。
[0071] 在人类生殖细胞系DNA中，三个单独基因座编码构建免疫球蛋白重链、κ轻链及 入轻链所需的外显子。重链基因座位于染色体14上，κ链基因座位于染色体2上且λ链 基因座位于染色体22上。在每一基因座的5'端处具有多个可变（V)基因区段，每一区段 长约300个碱基对，其编码构成抗体重链和轻链可变区（包括第一及第二互补决定区（CDRl 及CDR2))的大部分氨基酸。在人类中，在重链基因座中有约100个V基因，在κ链基因座 中有约35个V基因，且在λ链基因座中有约30个V基因。V基因区段是通过内含子彼此 隔开。
[0072] 位于人类重链基因座及κ轻链基因座中的V区段下游及恒定（C)基因区段上游 的是连接（J)区段的簇，其通常长约30-50个碱基对且彼此及与邻近V及C基因通过非编 码序列隔开。重链基因座在与不同Ig同种型相关的9个功能性C基因的上游含有6个功 能性J区段的簇，且κ轻链基因座在单一 Ck基因上游含有5个J区段的簇。人类λ轻链 基因座还含有4个功能性J区段，但各自定位于4个相应功能性C a基因中的一个的5'处。 人类重链基因座还含有定位于V基因下游及J区段簇上游的超过20个多样性（D)基因区 段的簇。两个轻链基因座均均不含D基因区段。
[0073] 在成熟Ig轻链基因中，V区由V及J基因区段编码，而在Ig重链中，V区由V、J及 D基因区段编码。重链和轻链中的⑶Rl及⑶R2由V基因区段编码。然而，构建⑶R3更复 杂。对于重链，⑶R3由包括D及J区段及连接残基的VDJ接点编码。类似地，轻链的⑶R3 由包括J区段及连接残基的VJ接点编码。
[0074] 在不成熟B细胞中，所有V、D及J基因区段均单独位于生殖细胞系中且无法用于 表达功能性Ig蛋白质。相反，随着B细胞成熟，这些基因区段经历称作V(D) J重组的复杂 的DNA重排过程，所述过程使随机选择的重链V、D及J基因区段或轻链V及J基因区段相 互接近。在V、D及J基因区段的连接期间，负责实施V(D) J重组的分子随机添加或移除区 段之间的核苷酸。以此方式，在成熟B细胞的基因组中生成完整可变区外显子，其随后与编 码功能性Ig重链和轻链蛋白质的mRNA中的其它外显子（包括那些编码C区的外显子）组 合。
[0075] 不同V、D及J基因区段随机组合构建V区外显子，以及在所连接基因区段之间随 机添加或移除核苷酸是免疫系统生成高多样性抗原结合位点的两个重要机制。这些现象分 别称作组合多样性及连接多样性。因为CDR3自由V、D及J区段（对于重链）或V及J区 段（对于轻链）贡献的序列形成，连接多样性解释为何CDR3在三种CDR中可变性最高且通 常与抗原形成的接触最广泛。
[0076] 由于Ig分子的结构基本上模块化，且不同区实施不同功能，因此可能制备保留 ⑶F-8结合能力的抗⑶F-8抗体的片段或衍生物。这些片段或衍生物涵盖于本文所用术语 抗体中。自Ig分子制备的抗原结合片段或衍生物的非限制性实例包括Fab片段，其是包含 VH、CHI、VL及CL区的单价片段；F(ab'）2,其是包含两个经由铰链区彼此连接的Fab的二 价片段；Fd片段，其包含VH及CHl区；Fv片段，其包含VL及VH区；dAb片段，其包含VH或 VL区。另一实例是单链Fv区（scFv)，其包含在单一多肽链中串联排列且通过允许可变区 结合并形成单价抗原结合位点的多肽接头间隔的VH及VL区。单链Fv区可经设计，其中VH 区在VL区之前，或另一选择为其中VL区在VH区之前。接头的非限制性实例是15个残基 (Gly4Ser) 3的肽（SEQ ID NO: 34)。其它接头也有可能。其它片段或衍生物包括Fab'、替代 抗体（surrobody)、二硫键稳定的Fv抗体（dsFv)、双抗体、三链抗体及单结构域抗体（例如 鲨鱼抗体或骆驼化抗体或纳米抗体）。其它片段或衍生物也有可能。抗原结合片段、部位或 部分（例如本文所述的那些）可以重组方式或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。
[0077] 实例件抗⑶F-8抗体
[0078] ⑶F-8指生长分化因子-8,其是TGF- β超家族的成员。成熟人类⑶F-8的氨基酸 序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0079] 先前研究鉴别能特异性结合GDF-8并中和其生物学活性的鼠类单克隆抗体。该抗 体经证实在小鼠中，包括在肌萎缩侧索硬化症（ALS)的小鼠模型中增加肌肉质量及强度。 参见WO 2007/024535,其全文以引用方式并入。小鼠抗体的VH区具有氨基酸序列SEQ ID N0:3且其VL区具有氨基酸序列SEQ ID N0:4。这些VH及VL区分别显示于图IA及图IB 中，其中VH及VL区CDR各自的氨基酸序列以粗体字型来描绘。在Kabat及AbM编号系统 中与每一 VH及VL⑶R相关的SEQ ID NO列于下文所示表1中。根据Kabat编号系统限 定的CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID NO: 10、11及12,而CDR L1、L2及L3分别被指 定为SEQ ID NO: 13、14及15。根据AbM编号系统，CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID N0:20、21及22，而CDRL1、L2及L3分别被指定为SEQIDN0:23、24及25。
[0080] 表1 :通过序列标识编号标识的本发明的核酸和氨基酸序列
[0081]

【权利要求】
1. 特异性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含： 抗体重链可变（VH)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH区的第 一、第二及第三互补决定区（⑶R);及 抗体轻链可变（VL)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL区的第 一、第二及第三互补决定区（⑶R); 其中所述VH区在对应于SEQ ID NO:44的残基编号111 (Kabat位置108)的氨基酸位 置处包含亮氨酸。
2. 权利要求1的抗体或片段，其中VH CDR1包含SEQ ID NO: 10或SEQ ID N0:20, VH 0)1?2包含3￡〇10勵：11或3￡〇10勵：21，￥110)1?3包含3￡〇10勵：12，￥10)1?1包含5￡〇 10勵：13，￥1〇)1?2包含5￡0 10勵：14且￥1〇)1?3包含5￡0 10勵：15。
3. 权利要求2的抗体或片段，其中在每一 CDR内最多三个非接触氨基酸残基经保守取 代。
4. 权利要求1的抗体或片段，其中所述VH区的第四框架区（FR4)包含SEQ ID N0:44 的氨基酸106至116。
5. 权利要求1的抗体或片段，其中所述VL区在对应于SEQ ID N0:46的残基编号 100 (Kabat位置100)的氨基酸位置处包含甘氨酸。
6. 权利要求1的抗体或片段，其中所述VL区在对应于SEQ ID N0:46的残基编号 100 (Kabat位置100)的氨基酸位置处包含谷氨酰胺。
7. 权利要求5的抗体或片段，其中所述VL区的第四框架区包含SEQ ID N0:46的氨基 酸98至107。
8. 权利要求6的抗体或片段，其中所述VL区的第四框架区包含SEQ ID N0:9的氨基酸 98 至 107。
9. 权利要求1的抗体或片段，其中所述VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。
10. 权利要求9的抗体或片段，其中所述VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:46。
11. 权利要求9的抗体或片段，其中所述VL区包含氨基酸序列SEQ ID N0:9。
12. 权利要求1的抗体或片段，其进一步包含衍生自选自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗 体亚型的抗体重链恒定（CH)区。
13. 权利要求12的抗体或片段，其中所述IgG亚型进一步选自IgGl、IgG2、IgG3及 IgG4。
14. 权利要求13的抗体或片段，其中所述IgG亚型是IgGl。
15. 权利要求13的抗体或片段，其中所述IgG亚型包含至少一个改变Fc结构域功能的 突变。
16. 权利要求12的抗体或片段，其中所述抗体或片段的重链包含氨基酸序列SEQ ID N0:57。
17. 权利要求1的抗体或片段，其进一步包含抗体轻链恒定（CL)区。
18. 权利要求17的抗体或片段，其中所述CL区是k或XCL区。
19. 权利要求17的抗体或片段，其中所述抗体或片段的轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。
20. 权利要求9的抗体或片段，其中所述VH区是由核酸序列SEQ ID NO:43编码。
21. 权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体或片段以至少KT6M、l(T7M、l(r8M、l(r 9M、 lO'M或l(TnM的Kd结合⑶F-8。
22. 权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体或片段选自Fab、F(ab'）2、scFv、scFv_Fc、 scFv-CH、scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。
23. 权利要求1的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量大于在类似条件下产生 的其中VH区在Kabat位置108处包含甲硫氨酸的其它方面均相同的抗体的量。
24. 权利要求23的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量超过在类似条件下产生 的所述其它方面均相同的抗体的量至少约以下的量：1. 5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、 8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍及30倍。
25. 特异性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含：与氨基酸序列 SEQ ID NO:44至少95%相同的VH区，及与氨基酸序列SEQ ID NO:46至少95%相同的VL 区，其中所述VH区在Kabat位置108处包含亮氨酸。
26. 特异性结合⑶F-8的抗体，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO:58限定的抗体重链及 由氨基酸序列SEQ ID NO:59限定的抗体轻链。
27. 权利要求26的抗体，其中所述抗体基本上由两条各自由氨基酸序列SEQ ID NO: 58 限定的抗体重链及两条各自由氨基酸序列SEQ ID N0:59限定的抗体轻链组成。
28. 药物组合物，其包含权利要求1的抗体及药物学可接受的载体。
29. 分离多核苷酸，其包含编码特异性结合GDF-8的抗体或其片段的至少一条多肽链 的核酸序列，所述抗体或片段包含： 抗体重链可变（VH)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH区的第 一、第二及第三互补决定区（⑶R)， 其中所述VH区在对应于SEQ ID NO:44的残基编号111 (Kabat位置108)的氨基酸位 置处包含亮氨酸；及 抗体轻链可变（VL)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL区的第 一、第二及第三互补决定区（⑶R)， 其中所述VL区在对应于SEQ ID N0:46的残基编号100(Kabat位置100)的氨基酸位 置处包含甘氨酸。
30. 权利要求29的分离多核苷酸，其中编码所述VH区的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO: 43或SEQ ID NO: 49,且其中编码所述VL区的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO: 45或SEQ ID N0:51。
31. 权利要求29的分离多核苷酸，其进一步包含编码人类抗体CH区的核酸序列。
32. 权利要求29的分离多核苷酸，其进一步包含编码人类抗体CL区的核酸序列。
33. 权利要求32的分离多核苷酸，其中所述CL区由核酸序列SEQ ID NO: 16编码。
34. 表达载体，其包含权利要求29的多核苷酸。
35. 宿主细胞，其包含可操作连接至调节序列的权利要求29的多核苷酸。
36. 产生特异性结合GDF-8的抗体或其片段的方法，其包含培养权利要求35的宿主细 胞及回收由此产生的所述抗体或片段的步骤。
37. 增加哺乳动物的肌肉质量或强度的方法，其包含向哺乳动物施用有效增加所述哺 乳动物的肌肉质量或强度的量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
38. 权利要求37的方法，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。
39. 权利要求37的方法，其中所述骨骼肌在呼吸中发挥作用。
40. 治疗肌肉病症的方法，其包含向需要治疗肌肉病症的对象施用治疗有效量的权利 要求1的抗体或其抗原结合片段。
41. 权利要求40的方法，其中所述肌肉病症选自肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶病质、 肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。
42. 权利要求41的方法，其中所述肌肉病症是肌营养不良。
43. 权利要求42的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy)〇
44. 权利要求43的方法，其中治疗是有效提高所述对象在6分钟步行测试中的表现。
45. 权利要求43的方法，其中所述抗体被施用给还也在用糖皮质素治疗的对象。
46. 预防肌肉病症的方法，其包含向需要预防肌肉病症的对象施用有效预防所述肌肉 病症的量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
47. 权利要求46的方法，其中所述肌肉病症选自肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶病质、 肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。
48. 权利要求47的方法，其中所述肌肉病症是肌营养不良。
49. 权利要求48的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良。
50. 治疗或预防神经肌肉病症的方法，其包含向需要治疗神经肌肉病症的对象施用治 疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
51. 权利要求50的方法，其中所述神经肌肉病症是ALS。
52. 治疗或预防代谢紊乱的方法，其包含向需要治疗代谢紊乱的对象施用治疗有效量 的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
53. 权利要求52的方法，其中所述代谢紊乱选自2型糖尿病、代谢综合征、综合征X、胰 岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
54. 治疗或预防脂肪组织病症的方法，其包含向需要治疗脂肪组织病症的对象施用治 疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
55. 权利要求54的方法，其中所述脂肪组织病症是肥胖症。
56. 治疗或预防骨丢失病症的方法，其包含向需要治疗骨丢失病症的对象施用治疗有 效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
57. 权利要求56的方法，其中所述骨丢失病症选自骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨 质疏松相关性骨折。
58. 特异性结合⑶F-8的抗体，其包含： 由SEQ ID N0:44组成的抗体VH区及由SEQ ID N0:46组成的抗体VL区， 其中所述抗体在类似条件下的表达水平高于包含由SEQ ID N0:7组成的VH区及由SEQ ID N0:9组成的VL区的其它方面均相同的第二抗体。
59. 权利要求58的抗体，其中所述抗体的表达水平比所述第二抗体高至少约1. 5倍、2 倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍或30 倍的量。
60. 权利要求59的抗体，其中当在COS细胞中表达时，所述抗体以所述第二抗体约12 倍表达。
61.权利要求59的抗体，其中当在CHO细胞中表达时，所述抗体以所述第二抗体约6倍 表达。
【文档编号】A61K39/395GK104487453SQ201380030753
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2013年6月12日 优先权日:2012年6月15日
【发明者】J·R·阿普加, M·M·马德, K·D·帕理什 申请人:辉瑞公司